Protocolo de exercícios de natação e métodos de cuidados para ratas grávidas

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para delinear métodos de criação de ratos, procedimentos de treinamento de natação e protocolos de enfermagem pós-reprodução para ratas prenhes após o treinamento. Este protocolo fornece um modelo animal para estudar os efeitos do exercício materno durante a gravidez na prole e seus mecanismos subjacentes.

Resumo

O conceito de origens de desenvolvimento da saúde e da doença destaca o impacto dos ambientes iniciais em doenças crônicas não transmissíveis, como diabetes, doenças cardiovasculares e câncer. Estudos usando modelos animais investigaram como fatores maternos, como desnutrição, supernutrição, obesidade e exposição a produtos químicos ou hipóxia, afetam o desenvolvimento fetal e a saúde da prole, levando a problemas como baixo peso ao nascer, pressão alta, dislipidemia e resistência à insulina. Dada a crescente prevalência de sobrepeso e obesidade entre mulheres em idade reprodutiva, intervenções eficazes são críticas. O exercício materno durante a gravidez surgiu como uma intervenção fundamental, beneficiando tanto a mãe quanto a prole e reduzindo o risco de doenças. Este estudo compara as diferenças de três modelos de exercícios em ratas prenhes: corrida voluntária com rodas, esteiras motorizadas e natação. A natação é a opção mais benéfica devido aos seus níveis de intensidade seguros e controlados. Este protocolo detalha os métodos de criação de ratos, treinamento de natação durante a gravidez e protocolos de amamentação pós-reprodução. Este modelo, adequado para várias espécies de ratos e camundongos, é útil para estudar os benefícios do exercício materno na saúde da prole e no bem-estar intergeracional.

Introdução

O conceito de Origens do Desenvolvimento da Saúde e da Doença (DOHaD) surgiu nas últimas duas décadas, o que mostrou que as influências ambientais durante o desenvolvimento inicial afetam o risco de processos fisiopatológicos posteriores associados às doenças crônicas não transmissíveis (DCNT), especialmente diabetes, doenças cardiovasculares e alguns tipos de câncer¹. Durante a fase mais plástica do desenvolvimento fetal, onde a prole é exposta ao ambiente intrauterino, a interação gene e ambiente e a perfusão útero-placentária são fatores cruciais da reprogramação fetal². Estudos anteriores utilizaram predominantemente modelos animais para investigar os efeitos prejudiciais, como desnutrição materna, supernutrição ou obesidade durante a gravidez e exposição pré-natal a produtos químicos ou hipóxia, no desenvolvimento fetal e efeitos fenotípicos de longo prazo na prole³. Isso produziu baixo peso ao nascer e crescimento posterior e produziu efeitos adversos na prole, incluindo pressão arterial elevada, dislipidemia e resistência à insulina⁴. Uma vez que a taxa de sobrepeso e obesidade está aumentando rapidamente entre as mulheres em idade reprodutiva, é urgente estabelecer intervenções eficazes para prevenir a transmissão intergeracional desses distúrbios maternos deletérios, o que tem um impacto importante na saúde da população ^5,6.

O exercício tem sido reconhecido há muito tempo como uma importante terapêutica preventiva para diabetes tipo 2, hipertensão e várias outras doenças⁷. O exercício durante a gravidez tem efeitos benéficos para a mãe e confere efeitos benéficos à prole, reduzindo assim a transmissão materna da doença para a prole⁸. Vários anos de pesquisa demonstraram a segurança e os profundos benefícios do exercício, incluindo reduções substanciais nas condições comuns da gravidez, como diabetes mellitus gestacional ^9,10. Em relação à segurança materna e fetal, a realização de treinamento físico e protocolos pós-amamentação é desafiadora.

David¹¹et al. descreveu modelos de exercícios em animais aplicáveis à pesquisa em saúde cardiovascular. Os três modelos de exercícios comumente usados, corrida voluntária com rodas, esteiras motorizadas e natação, têm vantagens e desvantagens. A roda voluntária que corre imita de perto o comportamento locomotor dos ratos, permitindo que eles se movam de acordo com seu ritmo circadiano. No entanto, esse tipo de exercício precisa de uma regulação mais precisa da intensidade e da duração. A esteira motorizada pode controlar a intensidade, o volume e a duração do exercício, mas às vezes precisa de estimulação elétrica, o que pode desencadear estresse físico e psicológico nos animais. A natação é amplamente utilizada em estudos com roedores devido à capacidade inerente de natação dos ratos, que também pode evitar estimulação elétrica ou danos mecânicos aos pés e caudas¹². Em estudos sobre modelos de exercícios pré-natais13,14, a natação é uma modalidade de exercício comumente utilizada. À medida que a gravidez progride e o abdômen do rato incha, os exercícios de corrida em esteira e roda podem causar contato repetido do abdômen com superfícies duras. Em contraste, o ambiente aquático na natação fornece flutuabilidade, reduzindo o risco de lesões relacionadas ao exercício para animais prenhes.

Este protocolo apresenta os métodos de criação de ratos, como realizar o treinamento de natação durante a gestação e os protocolos de amamentação pós-recria para ratas prenhes após o treinamento. Este modelo de treinamento de natação grávida pode ser aplicado a uma ampla gama de espécies de ratos e camundongos, o que pode, portanto, fornecer um modelo útil de roedores para futuras investigações usando modelos baseados em animais para estudar os mecanismos que regulam os efeitos benéficos do exercício materno na saúde da prole e os benefícios do exercício ao longo das gerações.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo comitê de ética animal da Universidade de Esportes de Pequim e realizados em conformidade com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) e as leis chinesas de proteção animal e diretrizes institucionais.

1. Acasalamento e alimentação de ratos

1. Compre ratos Wistar Wistar de 10 semanas de idade e ratos machos Wistar de 11 semanas de idade, com classificação específica e livre de patógenos (FPS).
2. Implemente a alimentação adaptativa: Alimente os ratos Wistar ad libitum com uma dieta padrão para roedores e forneça acesso à água da torneira por uma semana na instalação de alimentação designada. Certifique-se de que todos os ratos estejam alojados em um ciclo claro-escuro de 12 horas a uma temperatura constante de 22 ° C e umidade de 45-55%.
3. Examine o estro da rata.
   1. Prepare o equipamento e os materiais, incluindo lâminas de microscópio de vidro limpas, cotonetes de 2 mm de diâmetro, solução salina (NaCl a 0,9%) e microscópio.
   2. Rotule cada lâmina de microscópio com a data e a identificação do rato.
   3. Entre 18h e 19h, para minimizar o estresse, contenha a rata gentilmente. Segure a base da cauda com o polegar e o indicador enquanto aplica pressão dos outros dedos na vértebra lombar do rato.
   4. Levante a ponta da cauda e exponha a vaginal. Umedeça um cotonete com solução salina, coloque a ponta na vagina e role suavemente a ponta para coletar as secreções vaginais.
   5. Role a ponta do cotonete pela lâmina, evitando a reaplicação na mesma área.
   6. Examine o esfregaço ao microscópio e use a objetiva de baixa ampliação (10x) para localizar e observar as células.
      NOTA: Durante o estro, as secreções vaginais têm núcleos epiteliais maiores desaparecidos, substituídos por células epiteliais queratinizadas esfoliadas escamosas que se acumulam em um monte.
   7. Registre o estágio do ciclo estral para cada rato.
4. Entre 19h e 20h, coloque um rato macho e uma fêmea na gaiola de acasalamento.
   NOTA: As ratas precisam estar em proestro ou estro para o acasalamento.
5. No segundo dia, entre 7 e 8 da manhã, inspecione a gaiola de acasalamento em busca de plugues copulatórios. Se um tampão copulatório for encontrado na base da gaiola de acasalamento, prossiga para criar um esfregaço de secreção vaginal para a rata fêmea seguindo o mesmo método descrito nas etapas 1.3.4 a 1.3.6.
   NOTA: Os tampões copulatórios são materiais gelatinosos brancos leitosos ou amarelados feitos de vesículas seminais de ratos machos e secreções da próstata combinadas com secreções vaginais.
6. Confirme a gravidez na rata fêmea: depois de encontrar tampões copulatórios na gaiola de acasalamento, observe o esperma no esfregaço de secreção vaginal. Designe este dia como dia de gestação 1 (GD1).
7. Isole a rata grávida em uma gaiola separada.
   NOTA: Durante os estágios iniciais da gravidez, é imperativo evitar que uma rata grávida encontre pistas químicas masculinas desconhecidas em seu ambiente ou coabite com um rato macho desconhecido.
8. Os períodos de gestação de ratos geralmente duram de 21 a 23 dias. Meça e registre os pesos corporais dos ratos de GD1 a GD20.
9. No GD20, substitua a gaiola da rata grávida por uma limpa e coloque algodão absorvente médico (semelhante em tamanho ao da rata) na gaiola. Forneça água e comida suficientes para sete dias de sobrevivência e posicione a gaiola em um local tranquilo.
   NOTA: Não troque a gaiola por pelo menos 1 semana após o parto do rato. Ao mudar para uma gaiola limpa, transfira o algodão absorvente usado da gaiola suja para a nova para garantir que os ratos possam reconhecer o cheiro de seus filhotes.
10. No^21º dia pós-parto, separe os filhotes por gênero e coloque-os em duas gaiolas.
    NOTA: Devido ao tamanho menor da prole de 21 dias, coloque os pellets de ração dura em uma placa de Petri de vidro dentro da gaiola.

2. Programa de treinamento de natação pré-natal

1. Realize treinamento de adaptação para todas as ratas experimentais por 5 dias.
   1. Prepare um recipiente de plástico transparente com pelo menos 20 cm de altura e encha-o com 10 cm de água a 34 ± 1°C.
   2. Segure a ponta da cauda do rato e levante-a, depois coloque o rato na água.
   3. Durante o treinamento adaptativo de 15 minutos, monitore de perto a temperatura da água a cada 5 minutos, adicionando água morna para manter a temperatura.
   4. Após o treinamento, transfira o rato para água limpa a 34 ± 1°C para lavar o pelo. Em seguida, transfira o rato para uma gaiola com toalhas e use um secador de cabelo para secar o pelo.
      NOTA: Ruído e um ambiente quente podem causar estresse aos ratos. Portanto, é recomendável usar um secador de cabelo silencioso e com temperatura ajustável.
   5. Por favor, devolva o rato às suas respectivas gaiolas.
2. Acasalamento de ratos (siga as etapas 1.3-1.6).
3. Após a etapa 1.7, atribua aleatoriamente ratas prenhes em um grupo sedentário (SED) e um grupo de exercícios (EX).
4. Pese o rato diariamente antes de cada sessão de treinamento.
   NOTA: Durante o treinamento adaptativo, a perda de peso dos ratos não deve exceder 3 g/dia. Durante o treinamento pré-natal, o peso dos ratos deve aumentar gradualmente. Se os ratos perderem mais de 3 g por dia, reduza o tempo de treinamento diário em 50% para permitir a recuperação.
5. Realizar treinamento de natação pré-natal para o EX de GD1 a GD20, 6 dias por semana, das 8:00 às 9:00 da manhã.
   1. Prepare um balde de água circular com um diâmetro de 50 cm e uma altura mínima de 50 cm e encha-o com 40 cm de água a uma temperatura de 34 ± 1°C.
   2. De GD1 a GD5, realizar inicialmente o treinamento de natação por 20 min por dia e aumentar progressivamente para 60 min por dia.
   3. De GD6 a GD20, continue o treinamento físico por 60 min por dia durante 6 dias por semana.
   4. Para cuidados posteriores, consulte as etapas 2.1.4-2.1.5.
   5. Após o exercício, dê ao rato EX 5 g de sementes de girassol de roedores para fornecer suporte nutricional.
6. Durante o treinamento EX todos os dias, coloque o rato SED no mesmo ambiente aquático do treinamento adaptativo (etapa 2.1.1). Deixe o rato SED passar o mesmo tempo no ambiente aquático que o rato EX. Após o exercício, dê ao rato SED 5 g de sementes de girassol de roedores para fornecer suporte nutricional e acalmar as emoções.
7. Após cada sessão de treinamento de natação, limpe e desinfete todos os equipamentos com luz ultravioleta, incluindo baldes de água e toalhas.

3. Características físicas dos fetos

1. Na manhã de GD20.5, anestesiar a rata com isoflurano a 3% e eutanasiar em câmara de CO₂ .
2. Use uma faca cirúrgica para fazer uma incisão na parte inferior do abdômen do rato. Certifique-se de que a incisão se incline para ambos os lados do abdômen, garantindo a exposição completa do útero.
3. Abra cuidadosamente o útero usando fórceps e tesouras para expor os fetos e placentas. Separe suavemente o âmnio fino ao redor dos fetos usando uma pinça para evitar danos induzidos por tesoura aos fetos e placentas.
4. Limpe os corpos dos fetos usando gaze estéril para remover sangue e muco. Separe sequencialmente fetos e placentas por suas posições anatômicas e pese-os.
5. Observe a distância entre o ânus e a genitália para determinar o sexo dos fetos. Os fetos masculinos têm uma distância maior do que as fêmeas. Registre o sexo e a quantidade de fetos para referência futura.
6. Meça o comprimento dos fetos usando um paquímetro enquanto estiver deitado. Como os fetos ainda estão vivos, eles podem se enrolar depois de serem dissecados, então desdobre seus corpos para fazer medições.
   NOTA: Para garantir a consistência dos resultados experimentais e os métodos de medição são consistentes, o mesmo experimentador mantém os mesmos padrões por toda parte. Os fetos foram eutanasiados de acordo com as diretrizes institucionais recomendadas e amostras de tecido foram coletadas para análise posterior, conforme necessário.

Resultados

Na seção de métodos de reprodução de ratos (Figura 1), determinamos o ciclo estral de ratos fêmeas fazendo lâminas de secreção vaginal para aumentar a taxa de sucesso da reprodução. O ciclo estral dos ratos dura de 4 a 5 dias, incluindo proestro, estro, metestro e diestro. Ratos fêmeas em metaestro ou diestro exibem comportamentos como distanciar-se dos machos. Ao mesmo tempo, aqueles em estro estão dispostos a acasalar, e a ovulação em ratos ...

Discussão

Este estudo tem como objetivo estabelecer um programa de exercícios viável para ratas grávidas, incluindo métodos detalhados de acasalamento de ratos, protocolos de treinamento de natação e métodos de pesquisa para avaliar indicadores fisiológicos em fetos. Desenvolvemos um modelo de treinamento de exercícios de natação pré-natal por meio da prática, com soluções correspondentes para possíveis problemas que possam surgir no protocolo (Tabela 1). Este prot...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Caliper	Mitutoyo Measuring Instruments (Shanghai) Co., Ltd	530-101 N15	Fetus dissect
Circular water bucket	Naliya	N/A	Rat swimming
Experimental Surgical Instrument	Shenzhen RWD Life Technology Co., LTD	SP0001-G	Fetus dissect
Glass Microscope Slides	Jiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD	80312-3161	Vaginal smear
Glass petri dish	Merck Life Technologies	BR455751-10EA	Offspring rearing
Hairdryer	Panasonic	EH-WNE5H	Post-swimming care
Information Card	Zhongke Life Science	SS3	Rat mating
Isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., LTD	R510-22-10	Fetus dissect
Light microscope	Olympus	IX71-F22PH	Vaginal smear
Mating cage	Zhongke Life Science	SS3	Rat mating
Medical Absorbent Cotton	Hongxiang Sanitary Materials Co., LTD	N/A	The pregnant rats are anticipating giving birth
Rodent Anesthesia Machine, Gas Anesthesia	Shenzhen RWD Life Technology Co., LTD	R500IE	Fetus dissect
Rodent breeding feed	Beijing Huafukang Biotechnology Co., LTD	1032	Pregnant rat feeding
Rodent maintenance feed	Beijing Huafukang Biotechnology Co., LTD	1022	Offspring rearing
Rodent sunflower seeds	Jolly	JP241	Nutritional supplement
Soundproof cotton	Kufu Medical Instrument	N/A	The pregnant rats are anticipating giving birth
Sterile Cotton Swab (2 mm diameter)	Kufu Medical Instrument	N/A	Vaginal smear
Sterile gauze	Kufu Medical Instrument	N/A	Fetus dissect
Stroke-physiological Saline Solution (0.9% NaCl)	Shandong Hualu Pharmaceutical Co., LTD	N/A	Vaginal smear
Thermometer	Beekman organism	N/A	The monitoring of rat swimming
Towels	Grace	N/A	Post-swimming care
Transparent plastic container	Naliya	N/A	Swimming adaptive training
Ultraviolet light	Merck Life Technologies	Z169633-1EA	Post-swimming care
Water heater	Haier	EC6001-Q6S	Rat swimming
Weight Scale	Electronlc Acale	JM.A10001	Body weight measurement
Wistar Rats	Vital river Laboratory Animal Technology Co., LTD	N/A	Experiment