פרוטוקול התעמלות שחייה ושיטות טיפול בחולדות בהריון

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להגדרת שיטות גידול חולדות, נהלי אימון שחייה ופרוטוקולי הנקה לאחר הרבייה עבור חולדות הרות לאחר אימון. פרוטוקול זה מספק מודל חייתי לחקר ההשפעות של פעילות גופנית אימהית במהלך ההריון על צאצאים והמנגנונים העומדים בבסיסה.

Abstract

המקורות ההתפתחותיים של תפיסת הבריאות והמחלות מדגישים את ההשפעה של סביבות מוקדמות על מחלות כרוניות לא מידבקות כמו סוכרת, מחלות לב וכלי דם וסרטן. מחקרים שהשתמשו במודלים של בעלי חיים בדקו כיצד גורמים אימהיים כגון תת-תזונה, תזונת יתר, השמנת יתר וחשיפה לכימיקלים או היפוקסיה משפיעים על התפתחות העובר ובריאות הצאצאים, מה שמוביל לבעיות כמו משקל לידה נמוך, לחץ דם גבוה, דיסליפידמיה ותנגודת לאינסולין. בהתחשב בשכיחות הגוברת של עודף משקל והשמנת יתר בקרב נשים בגיל הפוריות, התערבויות יעילות הן קריטיות. פעילות גופנית אימהית במהלך ההריון התפתחה כהתערבות מרכזית, המועילה הן לאם והן לצאצאים ומפחיתה את הסיכון למחלות. מחקר זה משווה את ההבדלים בין שלושה מודלים של התעמלות על חולדות הרות: ריצה רצונית על גלגלים, הליכונים ממונעים ושחייה. שחייה היא האפשרות המועילה ביותר בשל רמות העצימות הבטוחות והמבוקרות שלה. פרוטוקול זה מפרט את שיטות גידול החולדות, אימוני שחייה במהלך ההריון ופרוטוקולי הנקה לאחר הרבייה. מודל זה, המתאים למיני חולדות ועכברים שונים, שימושי לחקר היתרונות של פעילות גופנית אימהית על בריאות הצאצאים ובריאות בין-דורית.

Introduction

תפיסת המקורות ההתפתחותיים של בריאות ומחלות (DOHaD) התפתחה בשני העשורים האחרונים, אשר הראתה כי השפעות סביבתיות במהלך ההתפתחות המוקדמת משפיעות על הסיכון לתהליכים פתופיזיולוגיים מאוחרים יותר הקשורים למחלות כרוניות לא מידבקות (NCD), במיוחד סוכרת, מחלות לב וכלי דם וסוגים מסוימים של סרטן¹. במהלך השלב הפלסטי ביותר של התפתחות העובר, שבו הצאצאים נחשפים לסביבה תוך רחמית, האינטראקציה בין הגן לסביבה וזילוח הרחם הם גורמים מכריעים בתכנות מחדש של העובר². מחקרים קודמים השתמשו בעיקר במודלים של בעלי חיים כדי לחקור את ההשפעות המזיקות, כגון תת-תזונה אימהית, תזונת יתר או השמנת יתר במהלך ההריון, וחשיפה טרום לידתית לכימיקלים או היפוקסיה, על התפתחות העובר והשפעות פנוטיפיות ארוכות טווח בצאצאים³. זה יצר משקל לידה נמוך וגדילה מאוחרת יותר ויצר השפעות שליליות על צאצאים, כולל לחץ דם גבוה, דיסליפידמיה, ותנגודת לאינסולין⁴. מכיוון ששיעור עודף המשקל וההשמנה עולה במהירות בקרב נשים בגיל הפוריות, יש צורך דחוף בהקמת התערבויות יעילות למניעת העברה בין-דורית של הפרעות אימהיות מזיקות אלה, שיש להן השפעה חשובה על בריאות האוכלוסייה ^5,6.

פעילות גופנית מוכרת זה מכבר כטיפול מונע חשוב לסוכרת מסוג 2, יתר לחץ דם ומספר מחלות אחרות⁷. פעילות גופנית במהלך ההריון יש השפעות מועילות עבור האם ומעניק השפעות מועילות על הצאצאים, ובכך להפחית את העברת המחלה האימהית לצאצאים⁸. מספר שנים של מחקר הוכיחו את הבטיחות של פעילות גופנית ואת היתרונות העמוקים שלה, כולל הפחתה משמעותית במצבי הריון נפוצים כגון סוכרת הריונית ^9,10. בכל הנוגע לבטיחות האם והעובר, ביצוע אימוני התעמלות ופרוטוקולים לאחר הנקה הוא מאתגר.

דוד¹¹ואח' תיאר מודלים של פעילות גופנית בבעלי חיים החלים על מחקר בריאות הלב וכלי הדם. לשלושת דגמי ההתעמלות הנפוצים, ריצה רצונית על גלגלים, הליכונים ממונעים ושחייה, יש יתרונות וחסרונות. הגלגל הרצוני הפועל מחקה באופן הדוק את ההתנהגות המוטורית של חולדות, ומאפשר להן לנוע בהתאם לשעון הביולוגי שלהן. עם זאת, סוג זה של תרגיל דורש ויסות מדויק יותר של אינטנסיביות ומשך. ההליכון הממונע יכול לשלוט בעצימות, בנפח ובמשך האימון, אך לעיתים הוא זקוק לגירוי חשמלי, שעלול לעורר לחץ פיזי ופסיכולוגי אצל בעלי החיים. שחייה נמצאת בשימוש נרחב במחקרי מכרסמים בשל יכולת השחייה המובנית של חולדות, אשר יכולות גם למנוע גירוי חשמלי או נזק מכני לרגליים ולזנבות שלהן¹². במחקרים על מודלים של התעמלות טרום לידתית^13,14, שחייה היא שיטת פעילות גופנית נפוצה. ככל שההריון מתקדם והבטן של החולדה מתנפחת, תרגילי הליכון וריצת גלגלים עלולים לגרום למגע חוזר ונשנה של הבטן עם משטחים קשים. לעומת זאת, סביבת המים בשחייה מספקת ציפה, ומפחיתה את הסיכון לפציעות הקשורות לפעילות גופנית עבור בעלי חיים בהריון.

פרוטוקול זה מציג את שיטות גידול החולדות, כיצד לבצע את אימוני השחייה במהלך ההריון, ואת פרוטוקולי ההנקה לאחר הרבייה עבור חולדות הרות לאחר האימון. מודל זה של אימוני שחייה בהריון יכול להיות מיושם על מגוון רחב של מיני חולדות ועכברים, מה שעשוי לספק מודל מכרסמים שימושי לחקירה עתידית באמצעות מודלים מבוססי בעלי חיים כדי לחקור את המנגנונים המווסתים את ההשפעות המיטיבות של פעילות גופנית אימהית על בריאות הצאצאים ואת היתרונות של פעילות גופנית לאורך דורות.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה האתית לבעלי חיים באוניברסיטת הספורט בבייג'ינג ובוצעו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) ולחוקים הסיניים להגנה על בעלי חיים ולהנחיות מוסדיות.

1. הזדווגות והאכלת חולדות

1. רכשו חולדות נקבות Wistar בנות 10 שבועות ללא פתוגן (SPF) וחולדות זכרים של Wistar בני 11 שבועות.
2. הטמיעו האכלה אדפטיבית: האכילו את חולדות Wistar ad libitum בתזונת מכרסמים סטנדרטית וספקו גישה למי ברז למשך שבוע במתקן האכלה ייעודי. ודאו שכל החולדות שוכנות במחזור אור-חושך של 12 שעות בטמפרטורה קבועה של 22 מעלות צלזיוס ולחות של 45-55%.
3. בחנו את הייחום של נקבת החולדה.
   1. הכינו את הציוד והחומרים, כולל שקופיות מיקרוסקופ זכוכית נקייה, צמר גפן בקוטר 2 מ"מ, תמיסת מלח (0.9% NaCl) ומיקרוסקופ.
   2. תייגו כל שקופית במיקרוסקופ עם התאריך וזיהוי החולדה.
   3. בין השעות 18:00-19:00, כדי למזער את הלחץ, יש לרסן את נקבת החולדה בעדינות. אחזו בבסיס הזנב עם האגודל והאצבע תוך הפעלת לחץ מהאצבעות האחרות על החוליה המותנית של החולדה.
   4. הרימו את קצה הזנב וחשפו את הנרתיק. יש להרטיב צמר גפן בתמיסת מלח, ואז להכניס את הקצה לנרתיק ולגלגל בעדינות את הקצה כדי לאסוף הפרשות מהנרתיק.
   5. גלגלו את קצה המקלון על פני המגלשה, והימנעו ממריחה חוזרת על אותו אזור.
   6. בחנו את הכתם מתחת למיקרוסקופ והשתמשו במטרת ההגדלה הנמוכה (פי 10) כדי לאתר ולצפות בתאים.
      הערה: במהלך הייחום, להפרשות הנרתיק נעלמו גרעיני אפיתל גדולים יותר, ואת מקומם תפסו תאי אפיתל קשקשיים שהצטברו לתלולית.
   7. רשום את שלב מחזור הייחום עבור כל חולדה.
4. בין השעות 19:00-20:00 הכניסו לכלוב ההזדווגות זכר ונקבה.
   הערה: נקבות החולדות צריכות להיות בפרואסטרוס או בייחום לצורך הזדווגות.
5. ביום השני, בין 7 ל 8 בבוקר, לבדוק את כלוב ההזדווגות עבור תקעים copulatory. אם נמצא פקק כפייתי בבסיס כלוב ההזדווגות, יש להמשיך וליצור כתם הפרשה נרתיקי עבור נקבת החולדה באותה שיטה המתוארת בשלבים 1.3.4-1.3.6.
   הערה: פקקי קופולטורי הם חומרים ג'לטיניים חלביים לבנים או צהבהבים העשויים משלפוחית זרע של חולדה זכרית והפרשות ערמונית בשילוב הפרשות נרתיקיות.
6. אשרו הריון בחולדה הנקבה: לאחר מציאת פקקים כפייתיים בכלוב ההזדווגות, צפו בזרע על משטח הפרשת הנרתיק. קבע יום זה כיום ההריון 1 (GD1).
7. בודדו את החולדה ההרה בכלוב נפרד.
   הערה: בשלבים הראשונים של ההריון, הכרחי למנוע מחולדה בהריון להיתקל ברמזים כימיים זכריים לא מוכרים בסביבתה או לחיות יחד עם חולדה זכרית לא מוכרת.
8. תקופות הריון של חולדות נמשכות בדרך כלל 21-23 ימים. מדדו ורשמו את משקל הגוף של החולדות מ-GD1 עד GD20.
9. ב-GD20, החליפו את כלוב החולדה ההרה בכלוב נקי והכניסו לכלוב כותנה סופגת רפואית (דומה בגודלה לחולדה). ספקו מספיק מים ומזון להישרדות של שבעה ימים, ומקמו את הכלוב במקום שקט.
   הערה: אין להחליף את הכלוב במשך שבוע לפחות לאחר לידת חולדות. בעת המעבר לכלוב נקי, העבירו את הכותנה הסופגת המשומשת מהכלוב המלוכלך לכלוב החדש כדי להבטיח שהחולדות יוכלו לזהות את ריח צאצאיהן.
10. ביום^ה-21 לאחר הלידה, יש להפריד את הצאצאים לפי מין ולהכניס אותם לשני כלובים.
    הערה: בשל גודלם הקטן יותר של הצאצאים בני 21 יום, הניחו את כדורי ההזנה הקשה בצלחת פטרי זכוכית בתוך הכלוב.

2. תוכנית אימוני שחייה לפני הלידה

1. ערכו אימוני הסתגלות לכל נקבות החולדות הניסיוניות במשך 5 ימים.
   1. הכינו מיכל פלסטיק שקוף בגובה 20 ס"מ לפחות ומלאו אותו ב-10 ס"מ מים בטמפרטורה של 34 ±-1°C.
   2. אחזו בקצה זנבה של החולדה והרימו אותו, ואז הניחו את החולדה במים.
   3. במהלך אימון אדפטיבי של 15 דקות, עקוב מקרוב אחר טמפרטורת המים כל 5 דקות, והוסף מים חמים כדי לשמור על הטמפרטורה.
   4. לאחר האימון, העבירו את החולדה למים נקיים בטמפרטורה של 34 ±-1 מעלות צלזיוס כדי לשטוף את פרוותה. לאחר מכן, העבירו את החולדה לכלוב עם מגבות והשתמשו במייבש שיער כדי לייבש את פרוותה.
      הערה: רעש וסביבה חמה עלולים לגרום לסטרס אצל חולדות. לכן, מומלץ להשתמש במייבש שיער מתכוונן ושקט.
   5. אנא החזירו את החולדה לכלובים המתאימים.
2. הזדווגות חולדות (בצע את השלבים 1.3-1.6).
3. לאחר שלב 1.7, הקצו חולדות הרות באופן אקראי לקבוצה יושבנית (SED) ולקבוצת פעילות גופנית (EX).
4. שקלו את החולדה מדי יום לפני כל אימון.
   הערה: במהלך אימון הסתגלותי, הירידה במשקל של חולדות לא תעלה על 3 גרם ליום. במהלך האימון לפני הלידה, משקל החולדות צריך לעלות בהדרגה. אם החולדות מאבדות יותר מ-3 גרם ביום, הפחיתו את זמן האימון היומי ב-50% כדי לאפשר התאוששות.
5. בצע אימוני שחייה טרום לידתי עבור EX מ GD1 ל GD20, 6 ימים בשבוע, מ 8: 00-9: 00 בבוקר.
   1. הכינו דלי מים עגול בקוטר של 50 ס"מ וגובה מינימלי של 50 ס"מ ומלאו אותו במים 40 ס"מ בטמפרטורה של 34 ± 1 מעלות צלזיוס.
   2. מ GD1 ל GD5, בתחילה לבצע את אימון השחייה במשך 20 דקות ביום בהדרגה להגדיל ל 60 דקות ביום.
   3. מ-GD6 עד GD20, המשיכו באימוני האימון במשך 60 דקות ביום במשך 6 ימים בשבוע.
   4. עבור טיפול לאחר מכן, עיין בשלבים 2.1.4-2.1.5.
   5. לאחר פעילות גופנית, תנו לחולדת EX 5 גרם של גרעיני חמניות מכרסמים כדי לספק תמיכה תזונתית.
6. במהלך אימון EX בכל יום, מקמו את חולדת SED באותה סביבת מים כמו אימון אדפטיבי (שלב 2.1.1). תנו לחולדת SED לבלות את אותו הזמן בסביבת המים כמו חולדת EX. לאחר פעילות גופנית, תנו לחולדת SED 5 גרם של גרעיני חמניות מכרסמים כדי לספק להם תמיכה תזונתית והרגעת רגשות.
7. לאחר כל אימון שחייה, יש לנקות ולחטא את כל הציוד באור אולטרה סגול, כולל דליי מים ומגבות.

3. מאפיינים פיזיים של עוברים

1. בבוקר GD20.5, מרדימים את נקבת החולדה עם 3% איזופלורן וממיתים אותה בתא_CO2 .
2. השתמש בסכין כירורגית כדי לבצע חתך בבטן התחתונה של החולדה. יש לוודא כי החתך נוטה לכיוון שני צידי הבטן, מה שמבטיח חשיפה מלאה של הרחם.
3. פתח בזהירות את הרחם באמצעות מלקחיים ומספריים כדי לחשוף את העוברים והשליות. הפרידו בעדינות את מי השפיר הדקים המקיפים את העוברים באמצעות מלקחיים כדי למנוע נזק שייגרם מספריים לעוברים ולשליות.
4. נקו את גופם של עוברים באמצעות גזה סטרילית להסרת דם וריר. הפרידו ברצף עוברים ושליות לפי מיקומם האנטומי, ואז שקלו אותם.
5. שימו לב למרחק בין פי הטבעת לאיברי המין כדי לקבוע את מין העוברים. לעוברים זכרים יש מרחק גדול יותר מאשר לנקבות. רשום את מין וכמות העוברים להתייחסות עתידית.
6. מדדו את אורך העוברים באמצעות קליפר בשכיבה שטוחה. מכיוון שהעוברים עדיין בחיים, הם עשויים להתכרבל לאחר נתיחתם, ולכן לפרוש את גופם כדי לבצע מדידות.
   הערה: כדי להבטיח עקביות של תוצאות הניסוי ושיטות המדידה עקביות, אותו נסיין שומר על אותם סטנדרטים לאורך כל הדרך. העוברים הומתו על פי הנחיות מוסדיות מומלצות ודגימות רקמה נאספו לניתוח נוסף לפי הצורך.

תוצאות

בחלק שיטות הרבייה של חולדות (איור 1), אנו קובעים את מחזור הייחום של נקבות חולדות על-ידי ביצוע שקופיות הפרשת נרתיק כדי להגביר את שיעור ההצלחה של הרבייה. מחזור הייחום של החולדות נמשך 4-5 ימים, כולל פרואסטרוס, ייחום, מטסטרוס ודיסטרוס. נקבות חולדות במטסטרוס או בד...

Discussion

מחקר זה נועד לבסס תוכנית פעילות גופנית ישימה עבור חולדות הרות, כולל שיטות הזדווגות מפורטות של חולדות, פרוטוקולים לאימוני שחייה ושיטות מחקר להערכת אינדיקטורים פיזיולוגיים בעוברים. פיתחנו מודל אימון שחייה טרום לידתי באמצעות תרגול, עם פתרונות מתאימים לבעיות פוטנציאליות ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Caliper	Mitutoyo Measuring Instruments (Shanghai) Co., Ltd	530-101 N15	Fetus dissect
Circular water bucket	Naliya	N/A	Rat swimming
Experimental Surgical Instrument	Shenzhen RWD Life Technology Co., LTD	SP0001-G	Fetus dissect
Glass Microscope Slides	Jiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD	80312-3161	Vaginal smear
Glass petri dish	Merck Life Technologies	BR455751-10EA	Offspring rearing
Hairdryer	Panasonic	EH-WNE5H	Post-swimming care
Information Card	Zhongke Life Science	SS3	Rat mating
Isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., LTD	R510-22-10	Fetus dissect
Light microscope	Olympus	IX71-F22PH	Vaginal smear
Mating cage	Zhongke Life Science	SS3	Rat mating
Medical Absorbent Cotton	Hongxiang Sanitary Materials Co., LTD	N/A	The pregnant rats are anticipating giving birth
Rodent Anesthesia Machine, Gas Anesthesia	Shenzhen RWD Life Technology Co., LTD	R500IE	Fetus dissect
Rodent breeding feed	Beijing Huafukang Biotechnology Co., LTD	1032	Pregnant rat feeding
Rodent maintenance feed	Beijing Huafukang Biotechnology Co., LTD	1022	Offspring rearing
Rodent sunflower seeds	Jolly	JP241	Nutritional supplement
Soundproof cotton	Kufu Medical Instrument	N/A	The pregnant rats are anticipating giving birth
Sterile Cotton Swab (2 mm diameter)	Kufu Medical Instrument	N/A	Vaginal smear
Sterile gauze	Kufu Medical Instrument	N/A	Fetus dissect
Stroke-physiological Saline Solution (0.9% NaCl)	Shandong Hualu Pharmaceutical Co., LTD	N/A	Vaginal smear
Thermometer	Beekman organism	N/A	The monitoring of rat swimming
Towels	Grace	N/A	Post-swimming care
Transparent plastic container	Naliya	N/A	Swimming adaptive training
Ultraviolet light	Merck Life Technologies	Z169633-1EA	Post-swimming care
Water heater	Haier	EC6001-Q6S	Rat swimming
Weight Scale	Electronlc Acale	JM.A10001	Body weight measurement
Wistar Rats	Vital river Laboratory Animal Technology Co., LTD	N/A	Experiment