Протокол упражнений по плаванию и методы ухода за беременными крысами

Резюме

Здесь мы представляем протокол, описывающий методы разведения крыс, процедуры обучения плаванию и протоколы кормления беременных крыс после размножения. Этот протокол представляет собой животную модель для изучения влияния материнских упражнений во время беременности на потомство и лежащие в их основе механизмы.

Аннотация

Концепция «Истоки здоровья и болезней развития» подчеркивает влияние ранней среды на хронические неинфекционные заболевания, такие как диабет, сердечно-сосудистые заболевания и рак. Исследования с использованием животных моделей изучали, как материнские факторы, такие как недоедание, переедание, ожирение, воздействие химических веществ или гипоксия, влияют на развитие плода и здоровье потомства, что приводит к таким проблемам, как низкий вес при рождении, высокое кровяное давление, дислипидемия и резистентность к инсулину. Учитывая растущую распространенность избыточного веса и ожирения среди женщин репродуктивного возраста, решающее значение имеют эффективные вмешательства. Физические упражнения для матери во время беременности стали ключевым вмешательством, приносящим пользу как матери, так и потомству и снижающим риск заболеваний. В этом исследовании сравниваются различия трех моделей упражнений на беременных крысах: добровольный бег на колесах, моторизованные беговые дорожки и плавание. Плавание является наиболее выгодным вариантом из-за его безопасного и контролируемого уровня интенсивности. В этом протоколе подробно описаны методы разведения крыс, обучение плаванию во время беременности и протоколы кормления после осеменения. Эта модель, подходящая для различных видов крыс и мышей, полезна для изучения пользы физических упражнений для здоровья потомства и благополучия между поколениями.

Введение

В последние два десятилетия появилась концепция «Истоки здоровья и болезней в развитии» (DOHaD), которая показала, что влияние окружающей среды на ранних этапах развития влияет на риск более поздних патофизиологических процессов, связанных с хроническими неинфекционными заболеваниями (НИЗ), особенно диабета, сердечно-сосудистых заболеваний и некоторых^{видов рака1}. Во время наиболее пластичной фазы внутриутробного развития плода, когда потомство подвергается воздействию внутриутробной среды, взаимодействие генов и окружающей среды и перфузия матки являются решающими факторами^{перепрограммирования} плода. В предыдущих исследованиях преимущественно использовались животные модели для изучения пагубных эффектов, таких как недоедание матери, переедание или ожирение во время беременности, а также пренатальное воздействие химических веществ или гипоксия, на развитие плода и долгосрочные фенотипические эффекты^{у потомства}. Это привело к снижению массы тела при рождении и последующему росту, а также к неблагоприятным последствиям для потомства, включая повышенное кровяное давление, дислипидемию и резистентность к инсулину⁴. Поскольку уровень избыточного веса и ожирения среди женщин репродуктивного возраста быстро растет, срочно необходимо разработать эффективные меры для предотвращения передачи этих вредных материнских расстройств из поколения в поколение, что оказывает важное влияние на здоровье^{населения5,6}.

Физические упражнения уже давно признаны важным профилактическим средством при сахарном диабете 2 типа, гипертонии и некоторых других заболеваниях⁷. Физические упражнения во время беременности оказывают благотворное воздействие на мать и оказывают благотворное влияние на потомство, тем самым снижая передачу болезней от матери потомству⁸. Несколько лет исследований продемонстрировали безопасность и глубокие преимущества физических упражнений, включая значительное снижение распространенных заболеваний беременности, таких как гестационный сахарный диабет ^9,10. Что касается безопасности матери и плода, проведение тренировок по физическим упражнениям и протоколов после кормления грудью является сложной задачей.

David¹¹et al. Описаны модели упражнений на животных, применимые к исследованиям сердечно-сосудистого здоровья. Три широко используемые модели упражнений — добровольный бег на колесах, беговые дорожки с электроприводом и плавание — имеют свои преимущества и недостатки. Произвольный бег колеса точно имитирует локомоторное поведение крыс, позволяя им двигаться в соответствии со своим циркадным ритмом. Тем не менее, этот вид упражнений требует более точного регулирования интенсивности и продолжительности. Моторизованная беговая дорожка может контролировать интенсивность, объем и продолжительность упражнений, но иногда ей требуется электрическая стимуляция, которая может вызвать физическое и психологическое напряжение у животных. Плавание широко используется в исследованиях на грызунах из-за присущей крысам способности плавать, что также позволяет избежать электрической стимуляции или механического повреждения ног и^{хвостов.} В исследованиях на моделях пренатальных упражнений^13,14 плавание является широко используемым методом упражнений. По мере прогрессирования беременности и увеличения живота крысы упражнения на беговой дорожке и колесе могут вызвать повторный контакт живота с твердыми поверхностями. Напротив, водная среда при плавании обеспечивает плавучесть, снижая риск травм, связанных с физическими упражнениями, у беременных животных.

В этом протоколе представлены методы разведения крыс, как проводить тренировки по плаванию во время беременности, а также протоколы кормления беременных крыс после вязки. Эта модель обучения плаванию беременных может быть применена к широкому кругу видов крыс и мышей, что, таким образом, может предоставить полезную модель грызунов для будущих исследований с использованием животных моделей для изучения механизмов, регулирующих благотворное влияние материнских упражнений на здоровье потомства и преимущества физических упражнений из поколения в поколение.

протокол

Все описанные здесь методы были одобрены комитетом по этике животных Пекинского университета спорта и выполняются в соответствии с рекомендациями Национальных институтов здравоохранения (NIH) и китайскими законами о защите животных и институциональными рекомендациями.

1. Спаривание и кормление крыс

1. Приобретайте 10-недельных самок крыс Wistar и 11-недельных крыс-самцов Wistar без патогенов (SPF).
2. Внедрите адаптивное кормление: Кормите крыс Wistar в неограниченном количестве стандартной диетой для грызунов и обеспечьте доступ к водопроводной воде в течение одной недели в специально отведенном для этого помещении. Убедитесь, что все крысы содержатся в 12-часовом цикле «свет-темнота» при постоянной температуре 22 °C и влажности 45-55%.
3. Осмотрите течку самки крысы.
   1. Подготовьте оборудование и материалы, включая предметные стекла для микроскопа из чистого стекла, ватные палочки диаметром 2 мм, солевой раствор (0,9% NaCl) и микроскоп.
   2. Пометьте каждое предметное стекло микроскопа датой и идентификацией крысы.
   3. Между 6 и 7 часами вечера, чтобы свести к минимуму стресс, осторожно удерживайте самку крысы. Возьмитесь за основание хвоста большим и указательным пальцами, одновременно оказывая давление другими пальцами на поясничный позвонок крысы.
   4. Поднимите кончик хвоста и обнажите влагалище. Смочите ватный тампон солевым раствором, затем введите кончик во влагалище и аккуратно скатайте кончик, чтобы собрать вагинальные выделения.
   5. Проведите кончиком тампона по предметному стеклу, избегая повторного нанесения на ту же область.
   6. Изучите мазок под микроскопом и используйте объектив с малым увеличением (10x) для обнаружения и наблюдения за клетками.
      Примечание: Во время течки у вагинального секрета более крупные эпителиальные ядра исчезают, заменяясь плоскоклеотившимися ороговевшими эпителиальными клетками, которые накапливаются в холмиках.
   7. Запишите стадию эстрального цикла для каждой крысы.
4. Между 7 и 8 часами вечера поместите самца и самку крысы в клетку для спаривания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Самки крыс должны находиться в проэструсе или течке для спаривания.
5. На второй день, между 7 и 8 часами утра, осмотрите сопрягаемую клетку на предмет копулятивных пробок. Если копулятивная пробка обнаружена у основания брачной клетки, приступайте к выделению мазка из влагалища у самки крысы тем же методом, который описан в шагах 1.3.4-1.3.6.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Копулятивные пробки представляют собой молочно-белые или желтоватые студенистые материалы, изготовленные из семенных пузырьков самцов крыс и секрета предстательной железы в сочетании с вагинальными выделениями.
6. Подтвердите беременность у самки крысы: после обнаружения копулятивных пробок в брачной клетке понаблюдайте за спермой на мазке из вагинального секрета. Обозначьте этот день как день беременности 1 (GD1).
7. Изолируйте беременную крысу в отдельной клетке.
   Примечание: На начальных стадиях беременности крайне важно не допускать столкновения беременной крысы с незнакомыми самцами химических сигналов в окружающей среде или от сожительства с незнакомым самцом крысы.
8. Период беременности крыс обычно длится 21-23 дня. Измерьте и запишите массу тела крыс от GD1 до GD20.
9. На GD20 замените клетку беременной крысы на чистую и положите в клетку медицинскую вату (по размеру аналогичную крысе). Обеспечьте достаточное количество воды и пищи для выживания в течение семи дней и расположите клетку в тихом месте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не меняйте клетку в течение как минимум 1 недели после родов крыс. При переходе в чистую клетку переложите использованную вату из грязной клетки в новую, чтобы крысы могли распознавать запах своего потомства.
10. На^21-й день после родов разделите потомство по половому признаку и поместите их в две клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за меньшего размера 21-дневного потомства поместите гранулы жесткого корма в стеклянную чашку Петри внутри клетки.

2. Программа обучения плаванию для беременных

1. Провести адаптационную подготовку всех подопытных самок крыс в течение 5 дней.
   1. Подготовьте прозрачную пластиковую емкость высотой не менее 20 см и наполните ее 10 см водой при температуре 34 ± 1°C.
   2. Возьмитесь за кончик хвоста крысы и поднимите его, затем опустите крысу в воду.
   3. Во время 15-минутной адаптивной тренировки внимательно следите за температурой воды каждые 5 минут, добавляя теплую воду для поддержания температуры.
   4. После тренировки переложите крысу в чистую воду с температурой 34 ± 1°C, чтобы вымыть ее шерсть. Затем переложите крысу в клетку с полотенцами и используйте фен, чтобы высушить ее шерсть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шум и жаркая среда могут вызвать стресс у крыс. Поэтому рекомендуется использовать регулируемый по температуре и тихий фен.
   5. Пожалуйста, верните крысу в соответствующие клетки.
2. Спаривание крыс (выполните шаги 1.3-1.6).
3. После шага 1.7 случайным образом распределите беременных крыс по группе сидячего образа жизни (SED) и группе упражнений (EX).
4. Взвешивайте крысу ежедневно перед каждой тренировкой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время адаптивной тренировки потеря веса крыс не должна превышать 3 г/день. Во время пренатальной подготовки вес крыс должен постепенно увеличиваться. Если крысы теряют более 3 г в день, сократите ежедневное время тренировок на 50%, чтобы обеспечить восстановление.
5. Проводите пренатальные тренировки по плаванию для EX от GD1 до GD20, 6 дней в неделю, с 8:00 до 9:00 утра.
   1. Приготовьте круглое ведро для воды диаметром 50 см и минимальной высотой 50 см и наполните его 40 см водой при температуре 34 ± 1°C.
   2. Начиная с GD1 и GD5, первоначально выполняйте тренировки по плаванию по 20 минут в день и постепенно увеличивайте до 60 минут в день.
   3. С GD6 по GD20 продолжайте тренировку по 60 минут в день в течение 6 дней в неделю.
   4. Для последующего ухода обратитесь к шагам 2.1.4-2.1.5.
   5. После тренировки дайте EX rat 5 г семян подсолнечника грызуна для обеспечения питательной поддержки.
6. Во время тренировки EX каждый день помещайте крысу с СЭД в ту же водную среду, что и на адаптивную тренировку (шаг 2.1.1). Пусть крыса с СЭД проводит в водной среде столько же времени, сколько и крыса с СЭД. После тренировки дайте крысе с СЭД 5 г семян подсолнечника грызунов, чтобы обеспечить им питательную поддержку и успокоить эмоции.
7. После каждой тренировки по плаванию очищайте и дезинфицируйте все оборудование ультрафиолетовым светом, включая ведра с водой и полотенца.

3. Физические особенности плодов

1. Утром GD20.5 обезболите самку крысы 3% изофлураном и усыпьте ее в камере CO₂ .
2. С помощью хирургического ножа сделайте разрез в нижней части живота крысы. Следите за тем, чтобы разрез был наклонен в обе стороны живота, обеспечивая полное оголение матки.
3. Осторожно вскройте матку с помощью щипцов и ножниц, чтобы обнажить плод и плаценту. Аккуратно отделите тонкие амнионы, окружающие плоды, с помощью щипцов, чтобы избежать повреждения плода и плаценты, вызванного ножницами.
4. Очистите тела плодов с помощью стерильной марли, чтобы удалить кровь и слизь. Последовательно разделяют плод и плаценту по их анатомическому положению, затем взвешивают их.
5. Понаблюдайте за расстоянием между анусом и гениталиями, чтобы определить пол плода. Плод мужского пола имеет большее расстояние, чем женский. Запишите пол и количество плодов для дальнейшего использования.
6. Измерьте длину плода с помощью штангенциркуля, лежа на поверхности. Поскольку зародыши еще живы, они могут свернуться калачиком после вскрытия, поэтому разверните их тела, чтобы сделать измерения.
   Примечание: Чтобы обеспечить согласованность экспериментальных результатов и согласованность методов измерения, один и тот же экспериментатор поддерживает одни и те же стандарты на протяжении всего эксперимента. Плод был усыплен в соответствии с рекомендациями учреждения, а образцы тканей были собраны для дальнейшего анализа по мере необходимости.

Результаты

В разделе «Методы разведения крыс» (рис. 1) мы определяем эстральный цикл самок крыс с помощью слайдов вагинального секрета для повышения успешности разведения. Эстральный цикл крыс длится 4-5 дней, включая проэструс, течку, метеструс и диэструс. Самки к?...

Обсуждение

Это исследование направлено на создание осуществимой программы упражнений для беременных крыс, включая подробные методы спаривания крыс, протоколы обучения плаванию и методы исследования для оценки физиологических показателей у плода. Мы разработали пренатальную ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Caliper	Mitutoyo Measuring Instruments (Shanghai) Co., Ltd	530-101 N15	Fetus dissect
Circular water bucket	Naliya	N/A	Rat swimming
Experimental Surgical Instrument	Shenzhen RWD Life Technology Co., LTD	SP0001-G	Fetus dissect
Glass Microscope Slides	Jiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD	80312-3161	Vaginal smear
Glass petri dish	Merck Life Technologies	BR455751-10EA	Offspring rearing
Hairdryer	Panasonic	EH-WNE5H	Post-swimming care
Information Card	Zhongke Life Science	SS3	Rat mating
Isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., LTD	R510-22-10	Fetus dissect
Light microscope	Olympus	IX71-F22PH	Vaginal smear
Mating cage	Zhongke Life Science	SS3	Rat mating
Medical Absorbent Cotton	Hongxiang Sanitary Materials Co., LTD	N/A	The pregnant rats are anticipating giving birth
Rodent Anesthesia Machine, Gas Anesthesia	Shenzhen RWD Life Technology Co., LTD	R500IE	Fetus dissect
Rodent breeding feed	Beijing Huafukang Biotechnology Co., LTD	1032	Pregnant rat feeding
Rodent maintenance feed	Beijing Huafukang Biotechnology Co., LTD	1022	Offspring rearing
Rodent sunflower seeds	Jolly	JP241	Nutritional supplement
Soundproof cotton	Kufu Medical Instrument	N/A	The pregnant rats are anticipating giving birth
Sterile Cotton Swab (2 mm diameter)	Kufu Medical Instrument	N/A	Vaginal smear
Sterile gauze	Kufu Medical Instrument	N/A	Fetus dissect
Stroke-physiological Saline Solution (0.9% NaCl)	Shandong Hualu Pharmaceutical Co., LTD	N/A	Vaginal smear
Thermometer	Beekman organism	N/A	The monitoring of rat swimming
Towels	Grace	N/A	Post-swimming care
Transparent plastic container	Naliya	N/A	Swimming adaptive training
Ultraviolet light	Merck Life Technologies	Z169633-1EA	Post-swimming care
Water heater	Haier	EC6001-Q6S	Rat swimming
Weight Scale	Electronlc Acale	JM.A10001	Body weight measurement
Wistar Rats	Vital river Laboratory Animal Technology Co., LTD	N/A	Experiment