Schwimmübungsprotokoll und Pflegemethoden für trächtige Ratten

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Rattenzuchtmethoden, Schwimmtrainingsverfahren und Pflegeprotokolle nach der Zucht für trächtige Ratten nach dem Training zu beschreiben. Dieses Protokoll bietet ein Tiermodell für die Untersuchung der Auswirkungen von mütterlicher Bewegung während der Schwangerschaft auf die Nachkommen und die zugrunde liegenden Mechanismen.

Zusammenfassung

Das Konzept der Entwicklungsursprünge von Gesundheit und Krankheit unterstreicht den Einfluss früher Umgebungen auf chronische nichtübertragbare Krankheiten wie Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Krebs. Studien mit Tiermodellen haben untersucht, wie mütterliche Faktoren wie Unterernährung, Überernährung, Fettleibigkeit und die Exposition gegenüber Chemikalien oder Hypoxie die Entwicklung des Fötus und die Gesundheit der Nachkommen beeinflussen, was zu Problemen wie niedrigem Geburtsgewicht, Bluthochdruck, Fettstoffwechselstörungen und Insulinresistenz führt. Angesichts der zunehmenden Prävalenz von Übergewicht und Adipositas bei Frauen im gebärfähigen Alter sind wirksame Interventionen von entscheidender Bedeutung. Bewegung der Mutter während der Schwangerschaft hat sich als wichtige Maßnahme herausgestellt, die sowohl der Mutter als auch den Nachkommen zugute kommt und das Krankheitsrisiko verringert. Diese Studie vergleicht die Unterschiede von drei Trainingsmodellen an trächtigen Ratten: freiwilliges Radlaufen, motorisierte Laufbänder und Schwimmen. Schwimmen ist aufgrund seiner sicheren und kontrollierten Intensitätsstufen die vorteilhafteste Option. Dieses Protokoll beschreibt die Zuchtmethoden der Ratte, das Schwimmtraining während der Trächtigkeit und die Pflegeprotokolle nach der Zucht. Dieses Modell, das für verschiedene Ratten- und Mausarten geeignet ist, ist nützlich, um die Vorteile von Bewegung von Müttern für die Gesundheit der Nachkommen und das generationenübergreifende Wohlbefinden zu untersuchen.

Einleitung

In den letzten zwei Jahrzehnten hat sich das Konzept der Developmental Origins of Health and Disease (DOHaD) entwickelt, das gezeigt hat, dass Umwelteinflüsse während der frühen Entwicklung das Risiko für spätere pathophysiologische Prozesse beeinflussen, die mit chronischen nichtübertragbaren Krankheiten (NCD), insbesondere Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und einigen Krebsarten, verbunden sind¹. In der plastischsten Phase der fetalen Entwicklung, in der die Nachkommen der intrauterinen Umgebung ausgesetzt sind, sind die Interaktion zwischen Gen und Umwelt sowie die uteroplazentare Perfusion entscheidende Faktoren für die fetale Reprogrammierung². In früheren Studien wurden überwiegend Tiermodelle verwendet, um die nachteiligen Auswirkungen wie Unterernährung der Mutter, Überernährung oder Fettleibigkeit während der Schwangerschaft sowie die pränatale Exposition gegenüber Chemikalien oder Hypoxie auf die Entwicklung des Fötus und die langfristigen phänotypischen Auswirkungen bei den Nachkommen^{zu untersuchen 3}. Dies führte zu einem niedrigen Geburtsgewicht und späterem Wachstum und hatte nachteilige Auswirkungen auf die Nachkommen, einschließlich erhöhtem Blutdruck, Dyslipidämie und Insulinresistenz⁴. Da die Rate von Übergewicht und Adipositas bei Frauen im gebärfähigen Alter rapide zunimmt, ist es dringend erforderlich, wirksame Interventionen zur Verhinderung der generationsübergreifenden Übertragung dieser schädlichen mütterlichen Erkrankungen zu etablieren, was sich erheblich auf die Gesundheit der Bevölkerung auswirkt ^5,6.

Bewegung ist seit langem als wichtiges präventives Therapeutikum für Typ-2-Diabetes, Bluthochdruck und verschiedene andere Krankheiten anerkannt⁷. Bewegung während der Schwangerschaft hat positive Auswirkungen auf die Mutter und wirkt sich positiv auf die Nachkommen aus, wodurch die mütterliche Übertragung von Krankheiten auf die Nachkommen verringert^{wird 8}. Mehrere Jahre Forschung haben die Sicherheit und die tiefgreifenden Vorteile von Bewegung gezeigt, einschließlich einer erheblichen Verringerung häufiger Schwangerschaftserkrankungen wie Schwangerschaftsdiabetes^{mellitus 9,10}. In Bezug auf die Sicherheit von Mutter und Fötus ist die Durchführung von Bewegungstrainings und Protokollen nach dem Stillen eine Herausforderung.

David¹¹et al. beschriebene Tierbewegungsmodelle, die auf die kardiovaskuläre Gesundheitsforschung anwendbar sind. Die drei häufig verwendeten Übungsmodelle, freiwilliges Radlaufen, motorisierte Laufbänder und Schwimmen, haben Vor- und Nachteile. Das willkürliche Radlaufen ahmt das Fortbewegungsverhalten von Ratten genau nach und ermöglicht es ihnen, sich entsprechend ihrem zirkadianen Rhythmus zu bewegen. Diese Art von Übung erfordert jedoch eine genauere Regulierung von Intensität und Dauer. Das motorisierte Laufband kann die Intensität, das Volumen und die Dauer des Trainings steuern, aber manchmal benötigt es eine elektrische Stimulation, die bei den Tieren physischen und psychischen Stress auslösen kann. Schwimmen wird in Nagetierstudien häufig verwendet, da Ratten über eine inhärente Schwimmfähigkeit verfügen, die auch elektrische Stimulation oder mechanische Schäden an Füßen und Schwänzen vermeiden kann¹². In Studien zu pränatalen Übungsmodellen^13,14 ist Schwimmen eine häufig verwendete Übungsmethode. Wenn die Trächtigkeit fortschreitet und der Bauch der Ratte anschwillt, können Laufband- und Radlaufübungen zu wiederholtem Kontakt des Bauches mit harten Oberflächen führen. Im Gegensatz dazu sorgt das Wassermilieu beim Schwimmen für Auftrieb, wodurch das Risiko von belastungsbedingten Verletzungen für trächtige Tiere verringert wird.

Dieses Protokoll stellt die Zuchtmethoden der Ratte vor, wie das Schwimmtraining während der Trächtigkeit durchgeführt wird und die Pflegeprotokolle nach der Zucht für trächtige Ratten nach dem Training. Dieses Schwimmtrainingsmodell kann auf eine Vielzahl von Ratten- und Mausarten angewendet werden, was somit ein nützliches Nagetiermodell für zukünftige Untersuchungen mit Tiermodellen darstellen könnte, um die Mechanismen zu untersuchen, die die positiven Auswirkungen von mütterlicher Bewegung auf die Gesundheit der Nachkommen und die Vorteile von Bewegung über Generationen hinweg regulieren.

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Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden von der Tierethikkommission der Sportuniversität Peking genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) und den chinesischen Tierschutzgesetzen und institutionellen Richtlinien durchgeführt.

1. Paarung und Fütterung von Ratten

1. Kaufen Sie spezifische, pathogenfreie (SPF) bewertete 10 Wochen alte weibliche Wistar-Ratten und 11 Wochen alte männliche Wistar-Ratten.
2. Implementieren Sie adaptive Fütterung: Füttern Sie die Wistar-Ratten ad libitum mit einer Standarddiät von Nagetieren und verschaffen Sie ihnen eine Woche lang Zugang zu Leitungswasser in der dafür vorgesehenen Fütterungsanlage. Stellen Sie sicher, dass alle Ratten in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus bei einer konstanten Temperatur von 22 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 45-55 % untergebracht werden.
3. Untersuchen Sie die Brunst der weiblichen Ratte.
   1. Bereiten Sie die Ausrüstung und Materialien vor, einschließlich sauberer Objektträger aus Glas, Wattestäbchen mit einem Durchmesser von 2 mm, Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) und Mikroskop.
   2. Beschriften Sie jeden Objektträger mit dem Datum und der Rattenidentifikation.
   3. Um Stress zu minimieren, halten Sie die weibliche Ratte zwischen 18 und 19 Uhr sanft fest. Fassen Sie mit Daumen und Zeigefinger die Basis des Schwanzes, während Sie mit den anderen Fingern Druck auf den Lendenwirbel der Ratte ausüben.
   4. Hebe die Spitze des Schwanzes an und lege die Scheide frei. Befeuchten Sie ein Wattestäbchen mit Kochsalzlösung, stecken Sie dann die Spitze in die Vagina und rollen Sie die Spitze vorsichtig, um Vaginalsekret aufzufangen.
   5. Rollen Sie die Tupferspitze über den Objektträger und vermeiden Sie ein erneutes Auftragen auf dieselbe Stelle.
   6. Untersuchen Sie den Abstrich unter dem Mikroskop und verwenden Sie das Objektiv mit geringer Vergrößerung (10x), um die Zellen zu lokalisieren und zu beobachten.
      HINWEIS: Während der Brunst sind in den Vaginalsekreten größere Epithelkerne verschwunden, die durch plattenepitheliale exfolierte keratinisierte Epithelzellen ersetzt wurden, die sich zu einem Hügel angesammelt haben.
   7. Notiere das Stadium des Brunstzyklus für jede Ratte.
4. Setzen Sie zwischen 19 und 20 Uhr eine männliche und eine weibliche Ratte in den Paarungskäfig.
   HINWEIS: Die weiblichen Ratten müssen sich zur Paarung in der Prostrus oder Brunst befinden.
5. Am zweiten Tag, zwischen 7 und 8 Uhr, untersuchen Sie den Paarkäfig auf Kopulationspfropfen. Wenn ein Kopulationspfropfen an der Basis des Paarungskäfigs gefunden wird, fahren Sie mit der Erstellung eines Vaginalsekretabstrichs für die weibliche Ratte fort, indem Sie die gleiche Methode wie in den Schritten 1.3.4 bis 1.3.6 beschrieben anwenden.
   HINWEIS: Kopulationspfropfen sind milchig-weiße oder gelblich-gallertartige Materialien, die aus Samenbläschen und Prostatasekreten männlicher Ratten in Kombination mit Vaginalsekreten hergestellt werden.
6. Bestätigen Sie die Trächtigkeit bei der weiblichen Ratte: Nachdem Sie Kopulationspfropfen im Paarungskäfig gefunden haben, beobachten Sie Spermien auf dem Vaginalsekretabstrich. Bezeichnen Sie diesen Tag als Trächtigkeitstag 1 (GD1).
7. Isolieren Sie die trächtige Ratte in einem separaten Käfig.
   HINWEIS: In der Anfangsphase der Trächtigkeit ist es unbedingt zu verhindern, dass eine trächtige Ratte in ihrer Umgebung auf unbekannte männliche chemische Signale stößt oder mit einer unbekannten männlichen Ratte zusammenlebt.
8. Die Tragzeit von Ratten dauert in der Regel 21-23 Tage. Messen und notieren Sie das Körpergewicht der Ratten von GD1 bis GD20.
9. Ersetzen Sie bei GD20 den Käfig der trächtigen Ratte durch einen sauberen und legen Sie medizinisch saugfähige Watte (ähnlich groß wie die Ratte) in den Käfig. Sorgen Sie für ausreichend Wasser und Futter für ein siebentägiges Überleben und stellen Sie den Käfig an einem ruhigen Ort auf.
   HINWEIS: Wechseln Sie den Käfig mindestens 1 Woche nach der Geburt der Ratte nicht. Wenn Sie auf einen sauberen Käfig umsteigen, übertragen Sie die gebrauchte saugfähige Watte aus dem schmutzigen Käfig in den neuen, um sicherzustellen, dass die Ratten den Geruch ihres Nachwuchses erkennen können.
10. Trennen Sie den Nachwuchs am 21^. Tag nach der Geburt nach Geschlecht und setzen Sie ihn in zwei Käfige.
    HINWEIS: Aufgrund der geringeren Größe des 21 Tage alten Nachwuchses legen Sie die Hartfutterpellets in eine Glaspetrischale im Käfig.

2. Vorgeburtliches Schwimmtrainingsprogramm

1. Durchführung eines 5-tägigen Anpassungstrainings für alle experimentellen weiblichen Ratten.
   1. Bereiten Sie einen durchsichtigen Plastikbehälter mit einer Höhe von mindestens 20 cm vor und füllen Sie ihn mit 10 cm Wasser bei 34 ± 1 °C.
   2. Fassen Sie die Spitze des Schwanzes der Ratte und heben Sie sie an, dann legen Sie die Ratte ins Wasser.
   3. Überwachen Sie während des 15-minütigen adaptiven Trainings die Wassertemperatur alle 5 Minuten genau und fügen Sie warmes Wasser hinzu, um die Temperatur zu halten.
   4. Setzen Sie die Ratte nach dem Training in sauberes Wasser bei 34 ± 1 °C um, um ihr Fell zu waschen. Setze die Ratte dann mit Handtüchern in einen Käfig und benutze einen Fön, um ihr Fell zu trocknen.
      HINWEIS: Lärm und eine heiße Umgebung können bei Ratten Stress verursachen. Daher empfiehlt es sich, einen temperaturregulierbaren und leisen Fön zu verwenden.
   5. Bitte bringen Sie die Ratte in ihre jeweiligen Käfige zurück.
2. Rattenpaarung (befolgen Sie die Schritte 1.3-1.6).
3. Nach Schritt 1.7 werden trächtige Ratten nach dem Zufallsprinzip in eine sitzende Gruppe (SED) und eine Bewegungsgruppe (EX) eingeteilt.
4. Wiegen Sie die Ratte täglich vor jeder Trainingseinheit.
   HINWEIS: Während des adaptiven Trainings sollte der Gewichtsverlust von Ratten 3 g/Tag nicht überschreiten. Während des vorgeburtlichen Trainings sollte das Gewicht der Ratten nach und nach zunehmen. Wenn die Ratten mehr als 3 g pro Tag verlieren, reduzieren Sie die tägliche Trainingszeit um 50%, um eine Erholung zu ermöglichen.
5. Führen Sie ein Schwangerschaftsschwimmtraining für den EX von GD1 bis GD20 durch, 6 Tage die Woche, von 8:00 bis 9:00 Uhr morgens.
   1. Bereiten Sie einen runden Wassereimer mit einem Durchmesser von 50 cm und einer Mindesthöhe von 50 cm vor und füllen Sie ihn mit 40 cm Wasser bei einer Temperatur von 34 ± 1°C.
   2. Führen Sie von GD1 bis GD5 das Schwimmtraining zunächst 20 Minuten pro Tag durch und steigern Sie es schrittweise auf 60 Minuten pro Tag.
   3. Von GD6 bis GD20 setzen Sie das Übungstraining für 60 Minuten pro Tag an 6 Tagen pro Woche fort.
   4. Zur Nachsorge siehe Schritte 2.1.4-2.1.5.
   5. Geben Sie der EX-Ratte nach dem Training 5 g Sonnenblumenkerne von Nagetieren, um die Ernährung zu unterstützen.
6. Setzen Sie die SED-Ratte während des täglichen EX-Trainings in die gleiche Wasserumgebung wie beim adaptiven Training (Schritt 2.1.1). Lassen Sie die SED-Ratte die gleiche Zeit in der Wasserumgebung verbringen wie die EX-Ratte. Geben Sie der SED-Ratte nach dem Training 5 g Sonnenblumenkerne von Nagetieren, um sie ernährungsphysiologisch zu unterstützen und Emotionen zu beruhigen.
7. Reinigen und desinfizieren Sie nach jedem Schwimmtraining alle Geräte, einschließlich Wassereimer und Handtücher, mit ultraviolettem Licht.

3. Physikalische Eigenschaften von Föten

1. Am Morgen von GD20.5 wird die weibliche Ratte mit 3% Isofluran betäubt und in einer CO₂ -Kammer eingeschläfert.
2. Verwenden Sie ein chirurgisches Messer, um einen Schnitt in den Unterbauch der Ratte zu machen. Achten Sie darauf, dass der Schnitt zu beiden Seiten des Bauches geneigt ist, um eine vollständige Freilegung der Gebärmutter zu gewährleisten.
3. Öffnen Sie die Gebärmutter vorsichtig mit einer Pinzette und einer Schere, um die Föten und Plazenten freizulegen. Trennen Sie das dünne Amnion, das die Föten umgibt, vorsichtig mit einer Pinzette, um eine durch eine Schere verursachte Schädigung der Föten und Plazenten zu vermeiden.
4. Reinigen Sie die Körper der Föten mit steriler Gaze, um Blut und Schleim zu entfernen. Trennen Sie Föten und Plazenten nacheinander nach ihrer anatomischen Position und wiegen Sie sie dann.
5. Beobachte den Abstand zwischen Anus und Genitalien, um das Geschlecht der Föten zu bestimmen. Männliche Föten haben einen größeren Abstand als weibliche. Notieren Sie das Geschlecht und die Anzahl der Föten zum späteren Nachschlagen.
6. Messen Sie die Länge der Föten mit einem Messschieber, während Sie flach liegen. Da die Föten noch am Leben sind, können sie sich nach dem Präparieren zusammenrollen, also entfalten Sie ihren Körper, um Messungen vorzunehmen.
   HINWEIS: Um die Konsistenz der Versuchsergebnisse und die Konsistenz der Messmethoden zu gewährleisten, hält derselbe Versuchsleiter überall die gleichen Standards ein. Die Föten wurden gemäß den von der Einrichtung empfohlenen Richtlinien euthanasiert und Gewebeproben für weitere Analysen bei Bedarf entnommen.

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Ergebnisse

Im Abschnitt Rattenzuchtmethoden (Abbildung 1) bestimmen wir den Brunstzyklus weiblicher Ratten, indem wir Vaginalsekret-Objektträger herstellen, um die Erfolgsrate der Zucht zu erhöhen. Der Östruszyklus der Ratte dauert 4-5 Tage, einschließlich Proöstrus, Brunst, Metestrus und Diöstrus. Weibliche Ratten in Metestrus oder Diöstrus zeigen Verhaltensweisen wie die Distanzierung von Männchen. Gleichzeitig sind die Ratten in der Brunst bereit, sich zu pa...

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Diskussion

Diese Studie zielt darauf ab, ein praktikables Übungsprogramm für trächtige Ratten zu etablieren, einschließlich detaillierter Rattenpaarungsmethoden, Schwimmtrainingsprotokolle und Forschungsmethoden zur Bewertung physiologischer Indikatoren bei Föten. Wir haben in der Praxis ein pränatales Schwimmtrainingsmodell entwickelt, mit entsprechenden Lösungen für mögliche Probleme, die im Protokoll auftreten können (Tabelle 1). Dieses Protokoll wird es praktischer ma...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Caliper	Mitutoyo Measuring Instruments (Shanghai) Co., Ltd	530-101 N15	Fetus dissect
Circular water bucket	Naliya	N/A	Rat swimming
Experimental Surgical Instrument	Shenzhen RWD Life Technology Co., LTD	SP0001-G	Fetus dissect
Glass Microscope Slides	Jiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD	80312-3161	Vaginal smear
Glass petri dish	Merck Life Technologies	BR455751-10EA	Offspring rearing
Hairdryer	Panasonic	EH-WNE5H	Post-swimming care
Information Card	Zhongke Life Science	SS3	Rat mating
Isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., LTD	R510-22-10	Fetus dissect
Light microscope	Olympus	IX71-F22PH	Vaginal smear
Mating cage	Zhongke Life Science	SS3	Rat mating
Medical Absorbent Cotton	Hongxiang Sanitary Materials Co., LTD	N/A	The pregnant rats are anticipating giving birth
Rodent Anesthesia Machine, Gas Anesthesia	Shenzhen RWD Life Technology Co., LTD	R500IE	Fetus dissect
Rodent breeding feed	Beijing Huafukang Biotechnology Co., LTD	1032	Pregnant rat feeding
Rodent maintenance feed	Beijing Huafukang Biotechnology Co., LTD	1022	Offspring rearing
Rodent sunflower seeds	Jolly	JP241	Nutritional supplement
Soundproof cotton	Kufu Medical Instrument	N/A	The pregnant rats are anticipating giving birth
Sterile Cotton Swab (2 mm diameter)	Kufu Medical Instrument	N/A	Vaginal smear
Sterile gauze	Kufu Medical Instrument	N/A	Fetus dissect
Stroke-physiological Saline Solution (0.9% NaCl)	Shandong Hualu Pharmaceutical Co., LTD	N/A	Vaginal smear
Thermometer	Beekman organism	N/A	The monitoring of rat swimming
Towels	Grace	N/A	Post-swimming care
Transparent plastic container	Naliya	N/A	Swimming adaptive training
Ultraviolet light	Merck Life Technologies	Z169633-1EA	Post-swimming care
Water heater	Haier	EC6001-Q6S	Rat swimming
Weight Scale	Electronlc Acale	JM.A10001	Body weight measurement
Wistar Rats	Vital river Laboratory Animal Technology Co., LTD	N/A	Experiment