从健康猪的新鲜粪便中分离、纯化和鉴定产酸杆菌肽的地衣芽孢杆菌

摘要

该方案完整而全面地描述了从健康猪粪便中分离、纯化和鉴定产生杆菌肽的地 衣芽孢杆菌 的详细过程。

摘要

地衣芽孢杆菌 和杆菌肽在医药、化学、水产养殖、农副产品等领域具有巨大的应用市场和价值。因此，选择杆菌肽产量高的 地衣芽孢杆菌 非常重要。在该实验方案中，从健康猪的新鲜粪便中分离、纯化和鉴定具有高产量杆菌肽的芽 孢杆菌 。还测试了次生代谢物杆菌肽对 黄微球菌 的抑制作用。采用薄层色谱法和高效液相色谱法对杆菌肽进行定性和定量检测。通过相关试剂盒测定 B. licheniformis 的生理生化特性。使用基因序列检测确定并构建 B. licheniformis 的系统发育关系。该方案从多个角度描述并介绍了从动物新鲜粪便中标准分离、纯化和鉴定地 衣芽孢杆菌 的过程，为地 衣芽孢杆菌 和杆菌肽在工厂中的大规模利用提供了一种方法。

引言

地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）是厚壁菌门（Firmicutes）的一种芽孢杆菌，广泛分布于水、土壤和动物肠道等各种环境中¹。B. licheniformis 具有短而粗壮的杆状结构，可以单独移动².菌落近乎圆形和暗淡，中央有一个凸起和整齐的灰白色边缘³.它具有很强的生长和繁殖能力，可以吸收和利用各种碳源的营养物质，如单糖、多糖、酮糖和有机酸⁴。在生长发育的后期，B. licheniformis 可以以休眠孢子的形式存在，并产生细菌物质，如杆菌肽、地衣霉素和表面活性素。它还可以抵抗营养缺乏和极端的外部环境⁵。没有明显的密码子偏好，高效的分泌系统决定了地衣芽孢杆菌的异源蛋白分泌，是枯草芽孢杆菌⁶ 的两倍。它通常用于生产酶制剂，如蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶⁷。由于缺乏内源性毒素，它被认证为食品安全菌株，并被 EFSA⁸ 列入 QPS。因此，有几种潜在用途，包括生物活性化合物生产，在水产养殖、农业、食品、生物医学和制药行业有广泛的应用。此外，B. licheniformis 是动物肠道菌群的重要组成部分，可促进动物提高生产性能，改善肠道菌群平衡，预防疾病。2004 年对地衣芽孢杆菌 ATCC14580 的全基因组进行了分析，逐渐了解了转录翻译、蛋白质折叠和分泌机制的背景信息⁹。这种遗传信息使其有利于分子水平的基因改造，有助于促进地衣芽孢杆菌的大规模生产。

杆菌肽是一种十二环肽抗生素，由非核糖体肽合成酶在 枯草芽孢杆菌 和 地衣芽孢杆菌中通过次级代谢产生。杆菌肽是由杆菌肽 A、B 和 C 等多种成分组成的混合物，其中每个成分之间的一个或两个氨基酸不同;其中，杆菌肽 A 具有最强的生物活性¹⁰。杆菌肽可以通过抑制细胞壁形成并与膜结合蛋白相互作用来抑制革兰氏阳性菌（如 葡萄球菌 和 黄体微球菌 ）和一些革兰氏阴性菌¹¹。同时，杆菌肽安全稳定，不易产生耐药性，可与其他抗菌药物配伍¹²。因此，杆菌肽用于医疗和兽医实践。此外，由于其消除速度快、吸收率低，还可用作动物饲料的添加剂¹³。

B. licheniformis 可以定植于肠道并改善胃肠道微环境。不同来源的芽孢杆菌在不同动物胃肠道中的粘附繁殖能力及相关生理功能不同。猪来源的 B. licheniformis 更有利于在猪和其他牲畜的肠道中定植。肠道益生菌的相对丰度与宿主¹⁴ 的健康状况之间存在密切关系。在断奶仔猪中补充 地衣芽孢杆菌 混合物通过改变微生物群组成和代谢活性来改善肠道生态系统，还影响肠道粘膜¹⁵。动物粪便可以反映动物肠道菌群的类型和数量。该方案描述了从健康猪粪便中分离和纯化产生杆菌肽的芽 孢杆菌 属。粪便来源于太湖母猪，不用配合饲料喂养，在养猪场生产性能优异。根据其形态学特征、理化性质和生化鉴定，将分离株鉴定为 B. licheniformis 。

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研究方案

所有实验程序均由南京工业大学伦理委员会记录和批准。粪便来自大约 2 岁的太湖母猪（见 材料表），这些母猪是在专业和标准养猪场饲养的。

1. 培养基的制备

1. Luria-Bertani （LB） 液体培养基：将 10 g NaCl、5 g 酵母提取物粉末和 10 g 胰蛋白胨加入锥形瓶中，加入蒸馏水至 1 L，搅拌，用玻璃棒溶解。将 100 mL 培养基转移到 500 mL 锥形瓶中，并用透气密封膜紧紧系住。在高压灭菌器中于 121 °C 灭菌 20 分钟（参见 材料表）。
2. LB固体培养基：在锥形瓶中加入10 g NaCl、5 g酵母提取物粉、10 g胰蛋白胨、20 g琼脂粉，加入蒸馏水至1 L，用玻璃棒溶解，并用透气密封膜紧紧扎扎。在 121 °C 下在高压灭菌器中灭菌 20 分钟。当培养基冷却至 50 °C 时，将 20 mL 培养基倒入培养皿中，让其冷却，然后倒置存放。
3. 杆菌肽发酵培养基：将 8 g 豆粕、4 g 可溶性淀粉、0.1 g （NH₄）₂SO₄、0.6 g CaCO₃ 和 100 mL 蒸馏水加入 500 mL 锥形瓶中，用玻璃棒搅拌充分溶解，并用透气密封膜紧紧。在高压灭菌器中于 121 °C 灭菌 20 分钟（参见 材料表）。
4. M. luteus 悬浮液：选择一个 M. luteus 环并接种在步骤 1.2 中制备的 LB 培养板上（参见 材料表）。在 37 °C 的恒温培养箱中培养 16 小时（参见 材料表）。向板中加入 5 mL 生理盐水，轻轻摇晃以洗脱菌落。测量 OD 600 并在试管中稀释溶液，得到 OD 600 为 0.3-0.7 的悬浮液。将 M. luteus 的悬浮液储存在 4 °C 以备后用。
5. 抗菌活性测定培养基：将 1 mL 步骤 1.4 中制备的 黄质杆菌 悬浮液加入 100 mL 步骤 1.2 中制备的液体 LB 固体培养基中，并轻轻摇晃。立即取 5 mL 含有 黄体分 枝杆菌的溶液，将其均匀涂抹在 LB 培养板上。

2. 从健康猪的新鲜粪便中分离和纯化芽孢杆菌

1. 将 9 mL 生理盐水和 1.0 g 新鲜猪粪加入 150 mL 锥形瓶中。在室温下用磁力搅拌器（参见 材料表）以 60 rpm/min 的速度搅拌 15 分钟。
2. 将粪便提取物放入 80 °C 恒温水浴（参见 材料表）中 20 分钟以杀死不产生孢子的细菌。
3. 将悬浮液加入 250 mL 锥形瓶中的 100 mL LB 液体培养基中，并在摇床中以 180 rpm/min 的速度在 37 °C 下培养 8 小时。
4. 用生理盐水将培养的细菌溶液从 ^10-1 连续稀释到 ^10-8。将 0.1 mL 的 ^10-6、^10-7 和 ^10-8 细菌稀释剂涂抹在单个 LB 培养板上并晾干。10 分钟后，将板倒置在 37 °C 的恒温培养箱中 48 小时。
5. 使用接种环挑选看起来类似于 B. licheniformis 的菌落（乳白色、柔软的稠度、粘液状外观、凸起和平坦的隆起以及不规则的形状）¹⁶，并在步骤 1.5 中制备的抗菌活性测定培养基上使用锯齿形图案对它们进行划线（参见 图 1）。
6. 将板放入 37 °C 的培养箱中 48 小时，观察菌落周围是否有抑制区。

3. 筛选抑制黄体分枝杆菌活性

1. 选择一个产生抑制区的单个菌落并添加到 100 mL LB 液体培养基中，在 37 °C 和 180 rpm/min 的摇床中培养 12 小时。
2. 将 5 mL 培养基接种到步骤 1.3 中制备的杆菌肽发酵培养基中，并在 37 °C 下培养 48 小时。
3. 将发酵液收集在离心管中，并在4°C下以13,400 x g 离心15分钟，然后使用0.22 μm微孔滤膜过滤（参见 材料表）。
4. 将牛津杯添加到新鲜的抗菌活性测定培养基板中，然后将 50 μL 滤液（发酵上清液）添加到牛津杯中（参见 材料表）。在 37 °C 的培养箱中培养 12 小时。孵育后，用游标卡尺测量抑制区的直径（参见 材料表）。
5. 选择抑制区直径大于 15 mm 的菌株和相应的发酵上清液进行后续实验。

4. 薄层色谱法鉴定杆菌肽

1. 加入 60 mg 杆菌肽标准品，并在 10 mL 容量瓶中溶解 1% EDTA-2Na（参见 材料表），制成 6.0 mg/mL 杆菌肽溶液。
2. 用 1% EDTA-2Na 将 1 mL 发酵上清液稀释至 10 mL。在活化硅胶薄层板上点样 5 μL 样品和 5 μL 杆菌肽标准溶液（参见 材料表）。
3. 向色谱槽中加入 100 mL 正丁醇-乙酸-水-吡啶-乙醇 （60：15：10：6：5）（参见 材料表）。将硅胶薄层板放入色谱槽中。盖上盖子，在室温下静置 30 分钟。
4. 取出硅胶薄层板，喷洒含有 1% 茚三酮的丁醇-吡啶溶液 （99：1）（见 材料表），在 105°C 下加热 5 分钟，直到出现棕红色斑点。根据以下公式计算标准品和样品的 R_f （保留因子值）：
   R_f = 光斑移动距离/溶剂移动距离。

5. HPLC 检测杆菌肽

1. 将 0.3 mL 发酵上清液和 1.2 mL 50% 乙醇加入 2 mL 微量离心管中，用手摇动 5 分钟，然后在 4 °C 下静置 12 小时。
2. 以 13,400 x g 离心 15 分钟，然后过滤到标有 S1 的样品瓶中，该样品瓶具有 0.22 μm 微孔滤膜（参见 材料表）。
3. 杆菌肽母溶液的制备：将 0.4 g 杆菌肽标准品（60 U/mg;参见 材料表）、100 mL 40 g/L EDTA-2Na（参见 材料表）加入 100 mL 容量瓶中，制备 240 U/mL 杆菌肽母溶液。
4. 将 3 mL 杆菌肽母液和 21、9、3、1 和 0 mL 超纯水分别添加到标记为 A1、B1、C1、D1 和 E1 的试管中。用 0.22 μm 微孔滤膜过滤后，将滤液放入标有 A2、B2、C2、D2 和 E2 的样品瓶中。
   注：杆菌肽标准溶液的浓度为 30、60、120、180 和 240 U/mL。
5. 将 A2、B2、C2、D2、E2 和 S1 放入 HPLC 仪器的测试托盘中。将 1000 mL 50 mM/L 甲酸铵和 1000 mL 乙腈放入流动相托盘中，分别作为流动相 A 和 B。
   注意：甲酸应将甲酸铵的 pH 值调节至 4.0。
6. 按照色谱柱上指示的方向安装 C18（5 μm，4.6 mm x 250 mm）HPLC 色谱柱（参见 材料表）。
7. 将流动相参数设置为 0 min、77% A 和 23% B;30 分钟，70% A 和 30% B;40 分钟，60% A 和 40% B;50 分钟，60% A 和 40% B;51 min，77% A 和 23% B;58 分钟，77% A 和 23% B. 将样品量设置为 100 μL;流速，1.0 mL/min;柱温，30 °C。
8. 单击 Run 按钮以执行程序。

6. 形态学鉴定

1. 在 LB 培养板上稀释和包被具有最高杆菌肽滴度的菌株，并在 37 °C 的培养箱中培养 48 小时。如下所述染色并观察菌落形态。
2. 向载玻片中加入一滴无菌纯净水，吸取少量菌落，然后添加到水滴中。均匀涂抹，让玻片自然干燥，然后固定在火焰上。
3. 加入结晶紫 1 分钟对样品进行染色，然后用自来水冲洗。加入碘 1 分钟以对样品进行染色，然后用蒸馏水冲洗。
4. 加入 95% 酒精，摇动玻片脱色 1 分钟，然后用蒸馏水冲洗。
5. 加入藏红花 1 分钟，使样品染色，然后用蒸馏水冲洗。让载玻片自然干燥，并在显微镜下用油浸观察菌落形态（参见 材料表）。

7. 生理生化鉴定

1. 将 2 mL 无菌盐水加入试管中，并使用接种环将板中的单个菌落接种到无菌盐水溶液中，以获得细菌悬浮液。
2. 在每个孔中加入 100 μL 细菌悬浮液，用于测量芽 孢杆菌 生化鉴定条上的 VP、柠檬酸盐、明胶、7% 氯化钠、pH 5.7、硝酸盐还原和淀粉水解（参见 材料表）。
3. 使用接种环挑选另一个单个菌落，并在 芽孢杆菌 生化鉴定条的厌氧生长生化管上以锯齿形图案划线。
4. 使用接种环挑选其他菌落，并将它们垂直穿刺到孔中，用于在 芽孢杆菌 生化鉴定条上进行丙酸盐、D-木糖、L-阿拉伯糖和 D-甘露醇鉴定。

8. 菌株基因序列的测定

1. 使用细菌 DNA 提取试剂盒提取菌株的 DNA（参见材料表）：将 2 mL 种子液加入 5 mL 微量离心管中，并以 11,500 x g 离心 1 分钟。弃去上清液，向沉淀中加入 110 μL 缓冲液（含有 20 mM Tris，pH8.0;2 mM Na 2-EDTA 和 1.2% Triton）和 70 μL 50 mg/mL 溶菌酶溶液，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。
2. 加入 4 μL 100 mg/mL RNase A 15 秒，并在室温下放置 5 分钟。加入 20 μL 蛋白酶 K 溶液并充分混合。
3. 加入 220 μL 缓冲液 GB，摇动 15 秒直至沉淀悬浮，在 70 °C 下放置 10 分钟以使溶液澄清，然后进行短暂旋转以去除管壁上的水珠。
4. 加入 220 μL 无水乙醇，充分休眠 15 秒，短暂分离。将溶液和絮凝沉淀转移到收集管的吸附柱 CB3 中，以 13,400 x g 离心 30 秒，弃去上清液。
5. 向吸附柱中加入 500 μL 缓冲液 GD，以 13,400 x g 离心 30 秒，然后弃去上清液。向色谱柱中加入 600 μL PW，以 13,400 x g 离心 30 秒，弃去上清液。
6. 将吸附柱放回收集管中，以 13,400 x g 离心 2 分钟，弃去上清液。
7. 将吸附柱在室温下放置 10 分钟晾干。将色谱柱转移到离心管中，并在吸附膜中间加入 100 μL 洗脱缓冲液 TE。
8. 在室温下放置 5 分钟，以收集流入离心管的液流，并以 13,400 x g 离心 2 分钟。
9. 将 25 μL 的 2x 预混液（参见 材料表）、2.5 μL 在步骤 8.8 中获得的 DNA 样品、2 μL 的 27F 正向引物、2 μL 的 1492R 反向引物和 18.5 μL 的双蒸 H₂O 添加到 0.1 mL PCR 管中。
   注意：引物的基因序列为 27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和 1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。
10. 在以下条件下将 PCR 管放入 PCR 机中（参见 材料表）：在 95 °C 下预变性 10 分钟，在 95 °C 下变性 30 秒，在 55 °C 下退火 30 秒，在 72 °C 下延伸 90 秒，在 72 °C 下延伸 7 分钟。运行变性、退火和延伸三步循环 32 次。
11. 取 5 μL 产品，用 1% 琼脂糖凝胶在 120 V 下进行电泳 30 分钟。
    1. 将 500 mg 琼脂糖溶解在 50 mL 的 1x TAE 缓冲液中。在微波炉中加热溶液 1-2 分钟，直到琼脂糖完全溶解。加入 5 μL DNA 染色染料，然后倒入凝胶托盘中并插入孔板。在室温下静置 30 分钟，直到它凝固;将凝胶放入电泳槽中，加入 1x TAE 缓冲液以浸没凝胶。向第一个孔中加入 2 μL 2 kb DNA 分子量标准 （10 mg/μL），将 5 μL PCR 产物与 1 μL 上样染料混合到凝胶的其余孔中。
12. 将凝胶放入凝胶成像系统中并拍照。在紫外线下快速切割 DNA 条并称重。
13. 将试纸加入微量离心管中，并加入等体积的 PN 溶液。将试管置于 50 °C 的水浴中，直到凝胶完全溶解。
14. 向吸附柱 CA2 中加入 500 μL 平衡液体 BL，以 13,400 x g 离心 1 分钟，弃去上清液。
15. 将溶解的凝胶溶液加入吸附柱 CA2 中，在室温下放置 2 分钟，以 13,400 x g 离心 30 秒，弃去上清液。
16. 向吸附柱 CA2 中加入 600 μL PW，以 13,400 x g 离心 1 分钟，弃去上清液，重复 1 次。
17. 将吸附柱 CA2 放入收集管中，以 13,400 x g 离心 2 分钟，弃去上清液。
18. 将吸附柱 CA2 在室温下彻底干燥 10 分钟，然后将其放入干净的离心管中。
19. 将 50 μL 洗脱缓冲液 EB 添加到室温下悬浮 2 分钟的吸附膜中，然后以 13,400 x g 离心 2 分钟收集 DNA 溶液。
    注：上述溶液或试剂包含在纯化试剂盒中（参见 材料表）。
    1. 将收集到的 DNA 溶液发送给专业的测序公司（参见 材料表）进行测序。在 NCBI 的 GenBank 数据库中比较 Blast 的测序结果。根据序列同源性，选择不同的菌株，并在 MEGA-X 中通过 Maximum Likelihood 方法构建系统发育树，以确定菌株的物种关系。

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结果

在本实验中，从健康猪的新鲜粪便中分离出 48 株 芽孢杆菌 ，编号为 1001 至 1048。其中，15 株菌株对 黄体蚜具有抗菌活性。从 15 个菌株中，通过高效液相色谱法测量杆菌肽的滴度，如 表 1 所示。其中， 地衣芽孢杆菌 1026 号的杆菌肽滴度最高，为 456.35 ± 21.75 U/mL，因此选择第 1026 号进行后续实验。

TLC 的鉴定结果如图 ...

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讨论

地衣芽孢杆菌生长迅速，培养条件简单，糖分消耗快，成熟的发酵技术有助于节省工业生产成本¹³。B. licheniformis 及其分泌物杆菌肽的广泛应用决定了其广阔的市场价值。在农业中，地衣芽孢杆菌被用作生物肥料，通过提高土壤肥力、促进根系发育和帮助有机物降解来改善植物生长和养分吸收¹⁵。对于工业酶生产，

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 × Phanta Flash Master Mix	Nanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing,China	P252-01
2kb DNA Marker	Beijing Trans Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China	BM121-01
Acetonitrile	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, China	A104443
Agar powder	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	A800730
Agarose	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, China	A104062
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China	10002917
Autoclave sterilizer	Zealway Instrument Inc., Xiamen, China	GI36DWS
Bacillus biochemical identification strip	Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, China	HBIG14
Bacitracin	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Shanghai, China	B65740
Bacteria DNA Extraction Kit	Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Beijing, China	DP209
Breathable sealing film	Beijing Leiborun Biotechnology Co., Ltd.	BS-QM-01A
Butanol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	B433378
C18 (5 μm, 4.6 × 250 mm) HPLC column	Rizhao Kepuno New Material Co., Ltd., Rizhao, China	C1805-462510
Calcium carbonate (CaCO3)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China	10005717
Centrifuge	New Brunswick Scientific Co., Inc., UK	5452
Chromatographic tank	Nanjing Tenghui Experimental Technology Co., Ltd., Nanjing, China	P-1
Conical bottle	Sichuan Shubo  Co., Ltd., Chengdu, China	18012
Constant temperature incubator	Taist Instrument Co., Ltd., Tianjin, China	GH4500
Dipotassium phosphate (K2HPO4)	Xilong Chemical Co., Ltd., Guangdong, China	XL0015
EDTA-2Na	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, China	E397526
Electronic balance	Mettler Toledo International Co., Ltd.	FA2104
Ethyl alcohol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, China	E130059
Gel Midi Purification Kit	Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Beijing, China	DP302
Glass rod	Chengdu Yibang Kexi Instrument Co., Ltd.	1294
Glucose	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	D823520
Gram 's staining solution kit	Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, China	HB8278
High performance liquid chromatograph	Agilent Technologies, Inc., California, America	1260
Horizontal electrophoresis apparatus	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China	DYCP-31DN BIOMATE
Inoculation ring	Shanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China	3171026
Magnetic stirrer	Wiggens GmbH Co., Ltd., Germany	WH220 PLUS
Methyl alcohol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, China	M116115
Microcentrifuge tube	Shanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China	1351171
Micrococcus luteus	Bena Culture Collection, Suzhou, China	BNCC102589
Microporous filter membrane	Nantong Suri Experimental Equipment Co., Ltd.	PES0.22
Ninhydrin	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	N105629
Optical microscope	Optical Instrument Factory, Shanghai, China	DYS-108
Pig feces	Nanjing Quanfu Pig Farm, Nanjing, China
Polymerase chain reaction (PCR) Amplifier	Suzhou Dongsheng Xingye Scientific Instrument Co., Ltd., Suzhou, China	ETC811
Professional sequencing company	General Biology (Anhui) Co., Ltd., Anhui, China
Pyridine	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	P111516
Shaker	Taicang Qiangle Experimental Equipment Co., Ltd.,Taicang, China	HYL-C
Silica gel GF254 thin layer plate	Yantai Huayang New Material Co., Ltd., Yantai, China	HPT-HSGF5025023
Sodium chloride (NaCl)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	S805275
Sodium citrate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China	C39197100001
Soluble starch	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	S817547
Thermostat water bath	Shanghai Heheng Instrument Equipment Co., Ltd., Shanghai, China	DK-8D
Tryptone	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	T139519
Ultra GelRed	Nanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing,China	GR501-01
Ultra pure water instrument	Merck KGaA Co., Ltd., Germany	Milli Direct-Q8
Ultrasonic cleaner	Jiangsu Huaguan Electric Appliance Group Co., Ltd., Jiangsu, China	SB-100DT
Vernier caliper	Sanfeng Company, Japan	N20P
Yeast extract powder	Vicbio Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China	LP0021