JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол содержит полное и всестороннее описание подробного процесса выделения, очистки и идентификации бацитрацин-продуцирующих Bacillus licheniformis из здоровых свиных фекалий.

Аннотация

Bacillus licheniformis и бацитрацин имеют огромный рынок применения и ценность в области медицины, химии, аквакультуры, сельского хозяйства и побочных продуктов. Поэтому отбор B. licheniformis с высокой продукцией бацитрацина имеет большое значение. В этом экспериментальном протоколе Bacillus с высоким выходом бацитрацина был выделен, очищен и идентифицирован из свежих фекалий здоровых свиней. Также было проверено ингибирующее действие вторичного метаболита бацитрацина на Micrococcus luteus . Для качественного и количественного определения бацитрацина использовали тонкослойную хроматографию и высокоэффективную жидкостную хроматографию. Физиологические и биохимические характеристики B. licheniformis определяли по соответствующим наборам. Филогенетические отношения B. licheniformis были определены и построены с помощью детекции последовательности генов. Этот протокол описывает и вводит стандартный процесс выделения, очистки и идентификации B. licheniformis из свежих фекалий животных с различных точек зрения, обеспечивая метод широкомасштабного использования B. licheniformis и бацитрацина на заводах.

Введение

Bacillus licheniformis — вид бацилл из семейства Firmicutes, который широко распространён в различных средах обитания, таких как вода, почва и кишечник животных1. B. licheniformis имеет короткую и толстую палочковидную структуру и передвигается индивидуально2. Колония почти круглая и тусклая, с центральной выпуклостью и аккуратными краями серовато-белогоцвета 3. Он обладает сильной способностью к росту и размножению и может поглощать и использовать питательные вещества из различных источников углерода, таких как моносахариды, полисахариды, кетоза и органические кислоты4. На более поздней стадии роста и развития B. licheniformis может существовать в виде спящих спор и продуцировать антибактериальные вещества, такие как бацитрацин, лихенизин и сурфактин. Он также может противостоять дефициту питательных веществ и экстремальным внешним условиям5. Явного предпочтения кодонов не существует, а эффективная система секреции определяет гетерологичную белковую секрецию B. licheniformis, которая в два раза выше, чем у Bacillus subtilis6. Он часто используется для производства ферментных препаратов, таких как протеаза, амилаза и целлюлаза7. Из-за отсутствия эндогенных токсинов он сертифицирован как безопасный для пищевых продуктов штамм и внесен в список QPS по EFSA8. Таким образом, существует несколько потенциальных применений, включая производство биоактивных соединений, которые имеют широкий спектр применения в аквакультуре, сельском хозяйстве, пищевой промышленности, биомедицине и фармацевтической промышленности. Кроме того, B. licheniformis является важным компонентом кишечной флоры животных, что может способствовать повышению продуктивности животных, улучшению баланса кишечной флоры и профилактике заболеваний. В 2004 г. был проанализирован весь геном B. licheniformis ATCC14580, и постепеннобыла изучена исходная информация о транскрипционной трансляции, сворачивании белка и механизме секреции9. Эта генетическая информация делает его способствующим генетической модификации на молекулярном уровне, способствуя широкомасштабному производству B. licheniformis.

Бацитрацин является додекациклическим пептидным антибиотиком, продуцируемым нерибосомальной пептидсинтетазой путем вторичного метаболизма у B. subtilis и B. licheniformis. Бацитрацин представляет собой смесь, состоящую из различных компонентов, таких как бацитрацин А, В и С, где одна или две аминокислоты различаются между каждым компонентом; среди них наибольшей биологической активностью обладает бацитрацин А10. Бацитрацин может ингибировать грамположительные бактерии, такие как стафилококк и Micrococcus luteus, а также некоторые грамотрицательные бактерии, ингибируя образование клеточной стенки и взаимодействуя с мембрансвязывающими белками. Между тем, бацитрацин безопасен и стабилен, ему нелегко выработать лекарственную устойчивость, и он может быть совместим с другими антибактериальными препаратами. Поэтому бацитрацин используется в медицинской и ветеринарной практике. Кроме того, из-за его быстрой скорости выведения и низкой скорости усвоения, его также можно использовать в качестве добавки к кормам для животных13.

B. licheniformis может колонизировать кишечник и улучшать микросреду желудочно-кишечного тракта. Адгезия и репродуктивная способность и связанные с ними физиологические функции Bacillus из разных источников в желудочно-кишечном тракте разных животных различны. Выведенный из свиньи B. licheniformis более благоприятен для колонизации в кишечнике свиней и другого домашнего скота. Существует тесная связь между относительным обилием кишечных пробиотиков и состоянием здоровья хозяина14. Пищевая добавка с смесью B. licheniformis у поросят-отъемышей улучшает экосистему кишечника за счет изменения состава микробиоты и метаболической активности, а также влияет на слизистую оболочку кишечника15. Фекалии животных могут отражать тип и количество кишечной флоры животных. В этом протоколе описывается выделение и очистка бацитрацин-продуцирующих Bacillus spp. из здоровых свиных фекалий. Кал получают от свиноматок породы Тайху, которых не кормят комбикормами и которые имеют отличные производственные показатели на свинофермах. Изоляты были идентифицированы как B. licheniformis на основании их морфологических характеристик, физико-химических свойств и биохимической идентификации.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все экспериментальные процедуры были задокументированы и одобрены Этическим комитетом Нанкинского технического университета. Кал был получен от свиноматок тайху в возрасте около 2 лет (см. Таблицу материалов), которые были выращены на профессиональных и стандартных свинофермах.

1. Подготовка носителей

  1. Жидкая среда Лурия-Бертани (LB): Добавьте 10 г NaCl, 5 г порошка дрожжевого экстракта и 10 г триптона в коническую бутылку, добавьте дистиллированную воду до 1 л, перемешайте и растворите стеклянным стержнем. Перелейте 100 мл среды в коническую бутылку объемом 500 мл и плотно завяжите ее дышащей герметизирующей пленкой. Стерилизовать при 121 °C в автоклаве в течение 20 мин (см. Таблицу материалов).
  2. Твердая среда LB: Добавьте 10 г NaCl, 5 г порошка дрожжевого экстракта, 10 г триптона, 20 г порошка агара в коническую бутылку, добавьте дистиллированную воду до 1 л, растворите стеклянным стержнем и плотно завяжите дышащей герметизирующей пленкой. Стерилизовать при 121 °C в автоклаве в течение 20 минут. Когда среда остынет до 50 °C, налейте 20 мл среды в чашки Петри, дайте им остыть, а затем храните вверх дном.
  3. Среда для брожения бацитрацина: Добавьте 8 г соевого жмыха, 4 г растворимого крахмала, 0,1 г (NH4)2SO4, 0,6 г CaCO3 и 100 мл дистиллированной воды в коническую бутылку объемом 500 мл, перемешайте стеклянным стержнем, чтобы она полностью растворилась, и плотно завяжите дышащей герметизирующей пленкой. Стерилизовать при 121 °C в автоклаве в течение 20 мин (см. Таблицу материалов).
  4. Суспензия M. luteus : Выберите кольцо M. luteus и инокулируйте на культуральный планшет LB, приготовленный на шаге 1.2 (см. Таблицу материалов). Выращивание в инкубаторе постоянной температуры при 37 °С в течение 16 ч (см. Таблицу материалов). Добавьте в тарелку 5 мл обычного физиологического раствора и осторожно встряхните, чтобы разбавить колонии. Измерьте OD600 и разведите раствор в пробирке, чтобы получить суспензию с OD600 0,3-0,7. Храните суспензию M. luteus при температуре 4 °C для последующего использования.
  5. Среда для анализа антибактериальной активности: Добавьте 1 мл суспензии M. luteus , приготовленной на стадии 1.4, в 100 мл жидкой твердой среды LB, приготовленной на стадии 1.2, и слегка встряхните. Немедленно возьмите 5 мл этого раствора, содержащего M. luteus, и равномерно распределите его по культуральной пластине LB.

2. Выделение и очистка Бациллы из свежих фекалий здоровых свиней

  1. Добавьте 9 мл физиологического раствора и 1,0 г свежего свиного кала в колбу Эрленмейера объемом 150 мл. Перемешивайте с помощью магнитной мешалки (см. Таблицу материалов) при комнатной температуре со скоростью 60 об/мин в течение 15 минут.
  2. Поместите фекальный экстракт в водяную баню с термостатом при температуре 80 °C (см. Таблицу материалов) на 20 минут, чтобы убить бактерии, не производящие споры.
  3. Добавьте суспензию в 100 мл жидкой среды LB в колбу Эрленмейера объемом 250 мл и закваливайте в шейкере (см. Таблицу материалов) со скоростью 180 об/мин при 37 °C в течение 8 ч.
  4. Проводят серийное разведение культивируемого бактериального раствора обычным физиологическим раствором от 10-1 до 10-8. Нанесите 0,1 мл 10-6, 10-7 и 10-8 бактериального разбавителя на отдельные культуральные планшеты LB и дайте высохнуть. Через 10 минут поместите перевернутые пластины в инкубатор с постоянной температурой при температуре 37 °C на 48 часов.
  5. С помощью инокуляционного кольца выберите колонии, которые внешне похожи на B. licheniformis (кремово-белый цвет, мягкая консистенция, слизистый вид, выпуклость, плоский рельеф и неправильная форма)16, и сделайте для них зигзагообразную полосу на среде для анализа антибактериальной активности, приготовленной на этапе 1.5 (см. рисунок 1).
  6. Поместите планшеты в инкубатор при температуре 37 °C на 48 ч и понаблюдайте, есть ли вокруг колонии зона торможения.

3. Скрининг на ингибирование активности M. luteus

  1. Выберите одну колонию, которая генерирует тормозную зону, и добавьте к 100 мл жидкой среды LB, закваливайте в шейкере при 37 °C и 180 об/мин в течение 12 часов.
  2. Инокулировать 5 мл питательной среды в среду для ферментации бацитрацина, приготовленную на стадии 1.3, и культивировать при 37 °С в течение 48 ч.
  3. Соберите ферментационный бульон в центрифужную пробирку и центрифугируйте при давлении 13 400 x g при 4 °C в течение 15 минут, а затем отфильтруйте с помощью микропористой фильтрующей мембраны размером 0,22 мкм (см. Таблицу материалов).
  4. Добавьте чашку Оксфорд в чашку для свежего антибактериального анализа, а затем добавьте 50 мкл фильтрата (надосадочная жидкость для брожения) в чашку Оксфорд (см. Таблицу материалов). Выращивание в инкубаторе при 37 °С в течение 12 ч. После инкубации измерьте диаметр тормозной зоны с помощью штангенциркуля (см. Таблицу материалов).
  5. Для последующих экспериментов отбирают штаммы и соответствующий надосадочный агент брожения с диаметром ингибирующей зоны более 15 мм.

4. Идентификация бацитрацина методом тонкослойной хроматографии

  1. Добавьте 60 мг стандартного бацитрацина и растворите в 1% ЭДТА-2Na (см. Таблицу материалов) в объемном флаконе объемом 10 мл до получения раствора бацитрацина 6,0 мг/мл.
  2. Разведите 1 мл надосадочной жидкости для ферментации до 10 мл с 1% ЭДТА-2Na. Нанесите 5 мкл образца и 5 мкл стандартного раствора бацитрацина на тонкослойную пластину с активированным силикагелем (см. Таблицу материалов).
  3. Добавьте 100 мл н-бутанол-уксусной кислоты-воды-пиридин-этанола (60:15:10:6:5) в хроматографическую емкость (см. Таблицу материалов). Поместите тонкую пластину силикагеля в хроматографическую емкость. Накройте крышкой и дайте настояться при комнатной температуре в течение 30 минут.
  4. Достаньте пластину с тонким слоем силикагеля, распылите раствор бутанол-пиридина (99:1), содержащий 1% нингидрина (см. Таблицу материалов), и нагревайте при 105 °C в течение 5 минут до появления коричневато-красных пятен. Рассчитайте Rf (значение коэффициента удержания) для стандарта и образца по следующей формуле:
    Rf = Расстояние перемещения пятна/Расстояние перемещения растворителя.

5. Определение бацитрацина методом ВЭЖХ

  1. Добавьте 0,3 мл надосадочной жидкости для брожения и 1,2 мл 50% этанола в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл, встряхните вручную в течение 5 минут и дайте постоять при температуре 4 °C в течение 12 часов.
  2. Центрифугируйте при давлении 13 400 x g в течение 15 мин и отфильтруйте в бутылку для образцов с маркировкой S1 с микропористой фильтрующей мембраной 0,22 мкм (см. Таблицу материалов).
  3. Приготовление маточного раствора бацитрацина: Добавьте 0,4 г стандартного бацитрацина (60 Ед/мг; см. Таблицу материалов), 100 мл 40 г/л ЭДТА-2Na (см. Таблицу материалов) в объемную колбу объемом 100 мл для приготовления 240 Ед/мл маточного раствора бацитрацина.
  4. Добавьте 3 мл маточного раствора бацитрацина и 21, 9, 3, 1 и 0 мл сверхчистой воды в пробирки с маркировкой A1, B1, C1, D1 и E1 соответственно. После фильтрации с помощью микропористой фильтрующей мембраны толщиной 0,22 мкм поместите фильтрат в флаконы с образцами с маркировкой A2, B2, C2, D2 и E2.
    Примечание: Концентрации стандартного раствора бацитрацина составляют 30, 60, 120, 180 и 240 Ед/мл.
  5. Поместите A2, B2, C2, D2, E2 и S1 в испытательный лоток прибора для ВЭЖХ. Поместите 1000 мл формиата аммония 50 мМ/л и 1000 мл ацетонитрила в лоток для подвижной фазы и установите их как подвижные фазы А и В соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: pH формиата аммония должен быть отрегулирован до 4,0 с муравьиной кислотой.
  6. Установите колонку C18 (5 мкм, 4,6 мм x 250 мм) в направлении, указанном на колонке (см. Таблицу материалов).
  7. Установите параметры подвижной фазы как 0 мин, 77% А и 23% В; 30 мин, 70% А и 30% В; 40 мин, 60% А и 40% В; 50 мин, 60% А и 40% В; 51 мин, 77% А и 23% В; 58 мин, 77% А и 23% В. Установите размер образца 100 мкл; Расход, 1,0 мл/мин; Температура столба, 30 °C.
  8. Нажмите кнопку «Выполнить », чтобы запустить программу.

6. Морфологическая идентификация

  1. Разбавляют и покрывают штамм самым высоким титром бацитрацина на планшете для культивирования LB и выращивают в инкубаторе при 37 °C в течение 48 часов. Окрашивайте и наблюдайте за морфологией колонии, как описано ниже.
  2. Добавьте на горку каплю стерильной очищенной воды, соберите небольшое количество колоний, и добавьте в водную каплю. Равномерно размажьте, дайте предметному стеклу высохнуть естественным образом, а затем зафиксируйте над огнем.
  3. Добавьте кристаллическую фиалку на 1 минуту, чтобы испачкать образец, а затем промойте водой из-под крана. Добавьте йод на 1 минуту, чтобы испачкать образец, а затем промойте дистиллированной водой.
  4. Добавьте 95% спирт, встряхните предметное стекло до обесцвечивания в течение 1 минуты, а затем смойте дистиллированной водой.
  5. Добавьте шафран на 1 минуту для окрашивания образца, а затем промойте дистиллированной водой. Дайте предметному стеклу высохнуть естественным образом и понаблюдайте за морфологией колонии под микроскопом с масляной иммерсией (см. Таблицу материалов).

7. Физиолого-биохимическая идентификация

  1. Добавьте в пробирку 2 мл стерильного физиологического раствора и введите одну колонию из планшета в стерильный физиологический раствор с помощью инокуляционного кольца для получения бактериальной суспензии.
  2. Добавьте 100 мкл бактериальной суспензии в каждое отверстие для измерения V-P, цитрата, желатина, 7% хлорида натрия, pH 5,7, восстановления нитратов и гидролиза крахмала на биохимической идентификационной полоске Bacillus (см. Таблицу материалов).
  3. Используйте инокуляционное кольцо, чтобы выбрать еще одну отдельную колонию и проложите их зигзагообразным узором на биохимической трубке анаэробного роста биохимической идентификационной полоски Bacillus .
  4. Используйте инокуляционное кольцо, чтобы выбрать другие колонии и проколоть их вертикально в поры для идентификации пропионата, D-ксилозы, L-арабинозы и D-маннита на биохимической идентификационной полоске Bacillus .

8. Определение последовательности генов штамма

  1. Извлеките ДНК штамма с помощью набора для экстракции ДНК бактерий (см. Таблицу материалов): Добавьте 2 мл жидкости для семян в микроцентрифужную пробирку объемом 5 мл и центрифугируйте при 11 500 x g в течение 1 минуты. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте в гранулу 110 мкл буфера (содержащего 20 мМ Трис, pH8,0; 2 мМ Na2-ЭДТА и 1,2% Тритона) и 70 мкл 50 мг/мл раствора лизоцима 50 мг/мл и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут.
  2. Добавьте 4 мкл 100 мг/мл РНКазы А в течение 15 с и оставьте на 5 минут при комнатной температуре. Добавьте 20 мкл раствора протеиназы К и хорошо перемешайте.
  3. Добавьте 220 μL буфера GB, встряхивайте в течение 15 секунд, пока гранула не станет взвешенной, поместите при температуре 70 °C на 10 минут, чтобы раствор стал прозрачным, и выполните короткий отжим, чтобы удалить шарики воды со стенки трубки.
  4. Добавьте 220 μл безводного этанола, полностью ударьте в течение 15 с, короткое отделение. Перенесите раствор и осаждение флокуляции в адсорбционную колонну CB3 сборной трубки, центрифугируйте при давлении 13 400 x g в течение 30 с и выбросьте надосадочную жидкость.
  5. Добавьте 500 мкл буферного GD в адсорбционную колонку, центрифугируйте в течение 30 с при 13 400 x g и выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте в колонку 600 μL PW, центрифугируйте в течение 30 с при 13 400 x g и выбросьте надосадочную жидкость.
  6. Поместите адсорбционную колонну обратно в сборную пробирку, центрифугируйте в течение 2 минут при давлении 13 400 x g и выбросьте надосадочную жидкость.
  7. Поместите адсорбционную колонну при комнатной температуре на 10 минут для высыхания. Перенесите колонку в центрифужную трубку и добавьте 100 мкл элюирующего буфера TE в середину адсорбционной мембраны.
  8. Оставьте при комнатной температуре на 5 минут, чтобы поток набрал поток в центрифужную трубку и центрифугу в течение 2 минут при давлении 13 400 x g.
  9. Добавьте 25 мкл 2x мастер-смеси (см. Таблицу материалов), 2,5 мкл образца ДНК, полученного на стадии 8.8, 2 мкл прямого праймера 27F, 2 мкл обратного праймера 1492R и 18,5 мкл дважды дистиллированного H2O в 0,1 мл ПЦР-пробирки.
    Примечание: Последовательности генов праймеров: 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' и 1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'.
  10. Поместите ПЦР-пробирку в ПЦР-аппарат (см. Таблицу материалов) в следующих условиях: предварительная денатурация при 95 °C в течение 10 минут, денатурация при 95 °C в течение 30 секунд, отжиг при 55 °C в течение 30 секунд, наращивание при 72 °C в течение 90 секунд, наращивание при 72 °C в течение 7 минут. Запустите трехступенчатый цикл денатурации, отжига и удлинения в 32 раза.
  11. Возьмите 5 μл продукта и проведите электрофорез с 1% агарозным гелем при 120 В в течение 30 минут.
    1. Растворите 500 мг агарозы в 50 мл 1x TAE буфера. Нагревайте раствор в микроволновке в течение 1-2 минут до полного растворения агарозы. Добавьте 5 μL красителя для окрашивания ДНК, затем налейте в лоток для геля и вставьте диафрагму. Дать постоять при комнатной температуре 30 минут, пока он не застынет; поместите гель в резервуар для электрофореза и добавьте 1x буфер TAE, чтобы погрузить гель. Добавьте 2 мкл 2 kb DNA ladder (10 мг/μл) в первую лунку и 5 μL продукта ПЦР, смешанного с 1 μL загружающего красителя, в оставшиеся лунки в геле.
  12. Поместите гель в систему визуализации геля и сделайте снимок. Быстро разрежьте полоски ДНК под воздействием ультрафиолета и взвесьте.
  13. Добавьте полоски в микроцентрифужную пробирку и добавьте равный объем раствора ПН. Держите тюбик на водяной бане при температуре 50 °C до полного растворения геля.
  14. Добавьте 500 мкл равновесной жидкости BL в адсорбционную колонку CA2, центрифугируйте при 13 400 x g в течение 1 мин и выбросьте надосадочную жидкость.
  15. Добавьте растворенный раствор геля в адсорбционную колонну CA2 и поместите ее при комнатной температуре на 2 минуты, центрифугируйте при 13 400 x g в течение 30 секунд и выбросьте надосадочную жидкость.
  16. Добавьте 600 мкл PW в адсорбционную колонку CA2, центрифугируйте при 13 400 x g в течение 1 мин, выбросьте надосадочную жидкость и повторите 1 раз.
  17. Поместите адсорбционную колонку CA2 в сборную пробирку, центрифугируйте при давлении 13 400 x g в течение 2 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
  18. Поместите адсорбционную колонну CA2 при комнатной температуре на 10 минут для полного высыхания, а затем поместите ее в чистую центрифужную пробирку.
  19. Добавьте 50 мкл элюирующего буфера EB в адсорбционную пленку, подвешенную при комнатной температуре на 2 мин, и соберите раствор ДНК путем центрифугирования при 13 400 х г в течение 2 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеупомянутые растворы или реагенты входят в комплект для очистки (см. Таблицу материалов).
    1. Отправьте собранный раствор ДНК в профессиональную компанию по секвенированию (см. Таблицу материалов) для секвенирования. Сравните результаты секвенирования с помощью Blast в базе данных GenBank NCBI. В соответствии с гомологией последовательностей выбрать различные штаммы и построить филогенетические деревья методом максимального правдоподобия в MEGA-X для определения видовых отношений штаммов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В этом эксперименте из свежих фекалий здоровых свиней было выделено 48 штаммов Bacillus , пронумерованных от 1001 до 1048. Среди них 15 штаммов обладали антибактериальной активностью в отношении M. luteus. Из 15 штаммов титры бацитрацина измеряли с помощью высокоэффективн?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

B. licheniformis быстро растет при простых условиях культивирования и быстром потреблении сахара, а зрелая технология ферментации способствует экономии затрат на промышленное производство13. Широкое применение B. licheniformis и его секретов, бацитрацина, оп...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (No 2022YFC2104800) и проектом «Шесть вершин талантов» в провинции Цзянсу (No 2019-NY-058).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2 × Phanta Flash Master MixNanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing,ChinaP252-01
2kb DNA MarkerBeijing Trans Biotechnology Co., Ltd., Beijing, ChinaBM121-01
AcetonitrileShanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, ChinaA104443
Agar powderShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaA800730
AgaroseShanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, ChinaA104062
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China10002917
Autoclave sterilizerZealway Instrument Inc., Xiamen, ChinaGI36DWS
Bacillus biochemical identification stripQingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, ChinaHBIG14
BacitracinShanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaB65740
Bacteria DNA Extraction KitTiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaDP209
Breathable sealing filmBeijing Leiborun Biotechnology Co., Ltd.BS-QM-01A
ButanolShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaB433378
C18 (5 μm, 4.6 × 250 mm) HPLC columnRizhao Kepuno New Material Co., Ltd., Rizhao, ChinaC1805-462510
Calcium carbonate (CaCO3)Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China10005717
CentrifugeNew Brunswick Scientific Co., Inc., UK5452
Chromatographic tank Nanjing Tenghui Experimental Technology Co., Ltd., Nanjing, ChinaP-1
Conical bottleSichuan Shubo  Co., Ltd., Chengdu, China18012
Constant temperature incubatorTaist Instrument Co., Ltd., Tianjin, ChinaGH4500
Dipotassium phosphate (K2HPO4)Xilong Chemical Co., Ltd., Guangdong, ChinaXL0015
EDTA-2NaShanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, ChinaE397526
Electronic balanceMettler Toledo International Co., Ltd.FA2104
Ethyl alcoholShanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, ChinaE130059
Gel Midi Purification KitTiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaDP302
Glass rodChengdu Yibang Kexi Instrument Co., Ltd.1294
GlucoseShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaD823520
Gram 's staining solution kitQingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, ChinaHB8278
High performance liquid chromatographAgilent Technologies, Inc., California, America1260
Horizontal electrophoresis apparatusBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd., Beijing, ChinaDYCP-31DN BIOMATE
Inoculation ringShanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China3171026
Magnetic stirrerWiggens GmbH Co., Ltd., GermanyWH220 PLUS
Methyl alcoholShanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, ChinaM116115
Microcentrifuge tubeShanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China1351171
Micrococcus luteusBena Culture Collection, Suzhou, ChinaBNCC102589
Microporous filter membraneNantong Suri Experimental Equipment Co., Ltd.PES0.22
NinhydrinShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaN105629
Optical microscopeOptical Instrument Factory, Shanghai, ChinaDYS-108
Pig fecesNanjing Quanfu Pig Farm, Nanjing, China
Polymerase chain reaction (PCR) AmplifierSuzhou Dongsheng Xingye Scientific Instrument Co., Ltd., Suzhou, ChinaETC811
Professional sequencing companyGeneral Biology (Anhui) Co., Ltd., Anhui, China
PyridineShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaP111516
ShakerTaicang Qiangle Experimental Equipment Co., Ltd.,Taicang, ChinaHYL-C
Silica gel GF254 thin layer plateYantai Huayang New Material Co., Ltd., Yantai, ChinaHPT-HSGF5025023
Sodium chloride (NaCl)Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaS805275
Sodium citrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, ChinaC39197100001
Soluble starchShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaS817547
Thermostat water bathShanghai Heheng Instrument Equipment Co., Ltd., Shanghai, ChinaDK-8D
TryptoneShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaT139519
Ultra GelRedNanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing,ChinaGR501-01
Ultra pure water instrumentMerck KGaA Co., Ltd., GermanyMilli Direct-Q8
Ultrasonic cleanerJiangsu Huaguan Electric Appliance Group Co., Ltd., Jiangsu, ChinaSB-100DT
Vernier caliper Sanfeng Company, JapanN20P
Yeast extract powderVicbio Biotechnology Co., Ltd., Beijing, ChinaLP0021

Ссылки

  1. Shleeva, M. O., Kondratieva, D. A., Kaprelyants, A. S. Bacillus licheniformis: A producer of antimicrobial substances, including antimycobacterials, which are feasible for medical applications. Pharmaceutics. 15 (7), 1893(2023).
  2. Muras, A., Romero, M., Mayer, C., Otero, A. Biotechnological applications of Bacillus licheniformis. Crit. Rev. Biotechnol. 41 (4), 609-627 (2021).
  3. He, H., et al. Biotechnological and food synthetic biology potential of platform strain: Bacillus licheniformis. Syn Syst Biotechno. 8 (2), 281-291 (2023).
  4. Sun, Y., et al. Enhanced β-mannanase production by Bacillus licheniformis by optimizing carbon source and feeding regimes. Prep Biochem Biotech. 52 (7), 845-853 (2022).
  5. Trunet, C., et al. Suboptimal Bacillus licheniformis and Bacillus weihenstephanensis spore incubation conditions increase heterogeneity of spore outgrowth time. Appl Environ Microb. 86 (6), e02061-e02119 (2020).
  6. Lee, N. K., Kim, W. S., Paik, H. D. Bacillus strains as human probiotics: characterization, safety, microbiome, and probiotic carrier. Food Sci Biotechnol. 28 (5), 1297-1305 (2019).
  7. Yi, W., et al. Dietary novel alkaline protease from Bacillus licheniformis improves broiler meat nutritional value and modulates intestinal microbiota and metabolites. Anim Microbiome. 6 (1), 1-16 (2024).
  8. Vasileios, B., et al. Safety and efficacy of Bacillus licheniformis DSM 32457 as a silage additive for all animal species. EFSA Journal. 17 (8), e05787(2019).
  9. Birgit, V., et al. The complete genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13, an organism with great industrial potential. J Mol Microb Biotech. 7 (4), 204-211 (2004).
  10. Zhu, J., et al. Microbial synthesis of bacitracin: Recent progress, challenges, and prospects. Synth Syst Biotechnol. 8 (2), 314-322 (2023).
  11. Shleeva, M. O., Kondratieva, D. A., Kaprelyants, A. S. Bacillus licheniformis: A producer of antimicrobial substances, including antimycobacterials, which are feasible for medical applications. Pharmaceutics. 15 (7), 1893(2023).
  12. Willdigg, J. R., et al. The Bacillus subtilis cell envelope stress-inducible ytpAB operon modulates membrane properties and contributes to bacitracin resistance. J Bacteriol. 206 (3), e0001524(2024).
  13. Silva, K. G. S., et al. Effects of bacterial direct-fed microbial mixtures offered to beef cattle consuming finishing diets on intake, nutrient digestibility, feeding behavior, and ruminal kinetics/fermentation profile. J Anim Sci. 102, skae003 (2024).
  14. Jia, D., et al. Probiotic Bacillus licheniformis ZW3 alleviates DSS-induced colitis and enhances gut homeostasis. Int J Mol Sci. 25 (1), 561(2024).
  15. Wang, X., et al. Dietary supplementation with Bacillus mixture modifies the intestinal ecosystem of weaned piglets in an overall beneficial way. J Appl Microbiol. 130 (1), 233-246 (2021).
  16. James, N., et al. Unravelling the potential plant growth activity of halotolerant Bacillus licheniformis NJ04 isolated from soil and its possible use as a green bioinoculant on Solanum lycopersicum L. Environ. Res. 216 (2), 114620(2024).
  17. Shen, P., et al. Exploitation of ammonia-inducible promoters for enzyme overexpression in Bacillus licheniformis. J Ind Microbiol Biot. 48 (5-6), kuab037 (2021).
  18. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).
  19. Fan, B., Chen, T. Y., Zhang, S., Wu, B., He, B. F. Mining of efficient microbial UDP-glycosyltransferases by motif evolution cross plant kingdom for application in biosynthesis of salidroside. Sci Rep. 7 (1), 463(2017).
  20. Hugo, R. O., Bernardo, R. B., Alejandra, C. S. R. Potential application of the probiotic Bacillus licheniformis as an adjuvant in the treatment of diseases in humans and animals: A systematic review. Front Microbiol. 13, 993451(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Bacillus licheniformisMicrococcus luteus

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены