Isolamento, purificação e identificação de bacitracina

Resumo

Este protocolo fornece uma descrição completa e abrangente do processo detalhado para o isolamento, purificação e identificação de Bacillus licheniformis produtores de bacitracina a partir de fezes de porcos saudáveis.

Resumo

Bacillus licheniformis e bacitracina têm um enorme mercado de aplicação e valor nas áreas de medicina, química, aquicultura, produtos agrícolas e secundários. Portanto, a seleção de B. licheniformis com alta produção de bacitracina é de grande importância. Neste protocolo experimental, o bacilo com alto rendimento de bacitracina foi isolado, purificado e identificado a partir das fezes frescas de suínos saudáveis. O efeito inibitório do metabólito secundário bacitracina sobre Micrococcus luteus também foi testado. A cromatografia em camada delgada e a cromatografia líquida de alta eficiência foram utilizadas para a detecção qualitativa e quantitativa da bacitracina. As características fisiológicas e bioquímicas de B. licheniformis foram determinadas por kits relevantes. As relações filogenéticas de B. licheniformis foram determinadas e construídas usando detecção de sequência gênica. Este protocolo descreve e apresenta o processo padrão de isolamento, purificação e identificação de B. licheniformis a partir de fezes frescas de animais de várias perspectivas, fornecendo um método para a utilização em larga escala de B. licheniformis e bacitracina em fábricas.

Introdução

Bacillus licheniformis é uma espécie de Bacillus da família Firmicutes, amplamente distribuída em vários ambientes, como água, solo e intestino de animais¹. B. licheniformis tem uma estrutura curta e robusta em forma de bastonete e se move individualmente². A colônia é quase redonda e opaca, com uma protuberância central e bordas limpas de branco acinzentado³. Possui forte capacidade de crescimento e reprodução e pode absorver e utilizar nutrientes de várias fontes de carbono, como monossacarídeos, polissacarídeos, cetose e ácidos orgânicos⁴. No estágio posterior de crescimento e desenvolvimento, B . licheniformis pode existir na forma de esporos dormentes e produzir substâncias antibacterianas, como bacitracina, liquenisina e surfactina. Também pode resistir à deficiência nutricional e ao ambiente externo extremo⁵. Não há preferência óbvia de códons, e o sistema de secreção eficiente determina a secreção proteica heteróloga de B. licheniformis, que é o dobro da de Bacillus subtilis⁶. É frequentemente usado para produzir preparações enzimáticas como protease, amilase e celulase⁷. Devido à sua falta de toxinas endógenas, é certificada como uma estirpe segura para alimentos e listada no QPS pela EFSA⁸. Portanto, existem vários usos potenciais, incluindo a produção de compostos bioativos, que têm uma ampla gama de aplicações nas indústrias de aquicultura, agricultura, alimentos, biomedicina e farmacêutica. Além disso, B. licheniformis é um componente importante da flora intestinal animal, que pode promover os animais a melhorar o desempenho da produção, melhorar o equilíbrio da flora intestinal e prevenir doenças. Todo o genoma de B. licheniformis ATCC14580 foi analisado em 2004, e as informações básicas de tradução da transcrição, dobramento de proteínas e mecanismo de secreção foram gradualmente compreendidas⁹. Essa informação genética o torna propício para a modificação genética em nível molecular, contribuindo para facilitar a produção em larga escala de B. licheniformis.

A bacitracina é um antibiótico peptídico dodecacíclico produzido pela peptídeo sintetase não ribossômica por metabolismo secundário em B. subtilis e B. licheniformis. A bacitracina é uma mistura composta por vários componentes, como bacitracina A, B e C, onde um ou dois aminoácidos diferem entre cada componente; entre estes, a bacitracina A tem a atividade biológica mais forte¹⁰. A bacitracina pode inibir bactérias gram-positivas, como Staphylococcus e Micrococcus luteus , e algumas bactérias gram-negativas, inibindo a formação da parede celular e interagindo com proteínas de ligação à membrana¹¹. Enquanto isso, a bacitracina é segura e estável, não é fácil de produzir resistência aos medicamentos e pode ser compatível com outros medicamentos antibacterianos¹². Portanto, a bacitracina é usada na prática médica e veterinária. Além disso, devido à sua rápida taxa de eliminação e baixa taxa de absorção, também pode ser usado como aditivo para ração animal¹³.

B. licheniformis pode colonizar o intestino e melhorar o microambiente gastrointestinal. A capacidade de adesão e reprodução e as funções fisiológicas relacionadas de Bacillus de diferentes fontes no trato gastrointestinal de diferentes animais são diferentes. O B. licheniformis derivado de porco é mais propício à colonização no intestino de porcos e outros animais. Existe uma estreita relação entre a abundância relativa de probióticos intestinais e o estado de saúde do hospedeiro¹⁴. A suplementação dietética com mistura de B. licheniformis em leitões desmamados melhora o ecossistema intestinal, alterando a composição da microbiota e a atividade metabólica, além de afetar a mucosa intestinal¹⁵. As fezes dos animais podem refletir o tipo e a quantidade da flora intestinal animal. Este protocolo descreve o isolamento e purificação de Bacillus spp. produtores de bacitracina de fezes de suínos saudáveis. As fezes são derivadas de porcas Taihu que não são alimentadas com ração composta e têm excelente desempenho de produção em fazendas de suínos. Os isolados foram identificados como B. licheniformis com base em suas características morfológicas, propriedades físico-químicas e identificação bioquímica.

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Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram documentados e aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Tecnológica de Nanjing. As fezes foram derivadas de porcas Taihu com cerca de 2 anos de idade (ver Tabela de Materiais), que foram criadas em fazendas de porcos profissionais e padrão.

1. Preparação de mídia

1. Meio líquido Luria-Bertani (LB): Adicione 10 g de NaCl, 5 g de extrato de levedura em pó e 10 g de triptona em uma garrafa cônica, adicione água destilada a 1 L, mexa e dissolva com uma haste de vidro. Transfira 100 mL de meio para um frasco cônico de 500 mL e amarre-o firmemente com filme de vedação respirável. Esterilize a 121 °C em autoclave por 20 min (consulte a Tabela de Materiais).
2. LB meio sólido: Adicione 10 g de NaCl, 5 g de extrato de levedura em pó, 10 g de triptona, 20 g de ágar pó a uma garrafa cônica, adicione água destilada a 1 L, dissolva com uma haste de vidro e amarre firmemente com um filme de vedação respirável. Esterilizar a 121 °C em autoclave durante 20 min. Quando o meio for resfriado a 50 °C, despeje 20 mL do meio em placas de Petri, deixe-as esfriar e guarde-as de cabeça para baixo.
3. Meio de fermentação de bacitracina: Adicione 8 g de farelo de soja, 4 g de amido solúvel, 0,1 g (NH₄)₂SO₄, 0,6 g de CaCO₃ e 100 mL de água destilada a um frasco cônico de 500 mL, mexa com uma haste de vidro para dissolver completamente e amarre firmemente com um filme de vedação respirável. Esterilize a 121 °C em autoclave por 20 min (consulte a Tabela de Materiais).
4. Suspensão de M. luteus : Selecione um anel de M. luteus e inocule em uma placa de cultura LB, preparada na etapa 1.2 (consulte a Tabela de Materiais). Cultura em estufa a temperatura constante a 37 °C durante 16 h (ver quadro de materiais). Adicione 5 mL de solução salina normal à placa e agite suavemente para eluir as colônias. Meça o OD600 e dilua a solução em um tubo de ensaio para obter uma suspensão com OD600 de 0,3-0,7. Conservar a suspensão de M. luteus a 4 °C para utilização posterior.
5. Meio de ensaio de atividade antibacteriana: Adicione 1 mL de suspensão de M. luteus , preparada na etapa 1.4, a 100 mL de meio sólido LB líquido preparado na etapa 1.2 e agite levemente. Tome imediatamente 5 mL desta solução contendo M. luteus e espalhe-a uniformemente na placa de cultura LB.

2. Isolamento e purificação de Bacillus de fezes frescas de suínos saudáveis

1. Adicione 9 mL de solução salina normal e 1,0 g de fezes frescas de porco em um erlenmeyer de 150 mL. Mexa com um agitador magnético (consulte a Tabela de Materiais) à temperatura ambiente a 60 rpm / min por 15 min.
2. Coloque o extrato fecal em banho-maria com termostato a 80 °C (consulte a Tabela de Materiais) por 20 minutos para matar bactérias não produtoras de esporos.
3. Adicionar a suspensão a 100 ml de LB de meio líquido num balão Erlenmeyer de 250 ml e cultivar num shaker (ver Tabela de Materiais) a 180 rpm/min a 37 °C durante 8 h.
4. Realize a diluição em série da solução bacteriana cultivada com solução salina normal de ^10-1 a ^10-8. Aplique 0,1 mL de diluente bacteriano ^10-6, ^10-7 e ^10-8 em placas de cultura LB individuais e deixe secar. Após 10 min, coloque as placas de cabeça para baixo em uma incubadora de temperatura constante a 37 ° C por 48 h.
5. Use o anel de inoculação para escolher as colônias que se parecem com B. licheniformis (cor branca cremosa, consistência macia, aparência mucóide, elevação convexa e plana e formato irregular)¹⁶e risque-as usando um padrão em zigue-zague no meio de ensaio de atividade antibacteriana preparado na etapa 1.5 (ver Figura 1).
6. Colocar as placas na incubadora a 37 °C durante 48 h e observar se existe uma zona de inibição em redor da colónia.

3. Triagem para inibição da atividade de M. luteus

1. Selecione uma única colônia que gerou uma zona inibitória e adicione a 100 mL de meio líquido LB, cultive no agitador a 37 ° C e 180 rpm / min por 12 h.
2. Inocular 5 ml do meio de cultura no meio de fermentação de bacitracina preparado no passo 1.3 e cultivar a 37 °C durante 48 h.
3. Colete o caldo de fermentação em um tubo de centrífuga e centrifugue a 13.400 x g a 4 ° C por 15 min e, em seguida, filtre usando uma membrana filtrante microporosa de 0,22 μm (consulte a Tabela de Materiais).
4. Adicione uma xícara Oxford a uma placa média de ensaio de atividade antibacteriana fresca e, em seguida, adicione 50 μL de filtrado (sobrenadante de fermentação) à xícara Oxford (consulte a Tabela de Materiais). Cultura em incubadora a 37 °C durante 12 h. Após a incubação, meça o diâmetro da zona inibitória com um paquímetro (consulte a Tabela de Materiais).
5. Selecionar as cepas e o sobrenadante de fermentação correspondente com um diâmetro de zona inibitória superior a 15 mm para experimentos subsequentes.

4. Identificação da bacitracina por cromatografia em camada delgada

1. Adicione 60 mg de bacitracina padrão e dissolva em EDTA-2Na a 1% (ver Tabela de Materiais) em um frasco volumétrico de 10 mL para fazer uma solução de bacitracina de 6,0 mg / mL.
2. Diluir 1 mL do sobrenadante de fermentação para 10 mL com 1% de EDTA-2Na. Localize 5 μL de amostra e 5 μL de solução-padrão de bacitracina na placa de camada fina de sílica gel ativada (consulte a Tabela de Materiais).
3. Adicione 100 mL de ácido n-butanol-acético-água-piridina-etanol (60:15:10:6:5) ao tanque cromatográfico (ver Tabela de Materiais). Colocar a placa de camada fina de sílica-gel na cuba cromatográfica. Cubra e deixe descansar em temperatura ambiente por 30 min.
4. Retire a placa de camada fina de sílica gel, borrife solução de butanol-piridina (99:1) contendo 1% de ninidrina (consulte a Tabela de Materiais) e aqueça a 105 ° C por 5 min até que apareçam manchas vermelhas acastanhadas. Calcular R_f (valor do fator de retenção) para a norma e a amostra de acordo com a seguinte fórmula:
   R_f = Distância de deslocamento do ponto/Distância de deslocamento do solvente.

5. Detecção de bacitracina por HPLC

1. Adicione 0,3 mL de sobrenadante de fermentação e 1,2 mL de etanol a 50% em um tubo de microcentrífuga de 2 mL, agite por 5 min com a mão e deixe descansar a 4 ° C por 12 h.
2. Centrifugue a 13.400 x g por 15 min e filtre em um sample frasco rotulado como S1 com uma membrana filtrante microporosa de 0,22 μm (ver Tabela de Materiais).
3. Preparação da solução-mãe de bacitracina: Adicione 0,4 g de bacitracina padrão (60 U / mg; consulte a Tabela de Materiais), 100 mL de 40 g / L de EDTA-2Na (consulte a Tabela de Materiais) em um balão volumétrico de 100 mL para preparar 240 U / mL de solução-mãe de bacitracina.
4. Adicione 3 mL de solução-mãe de bacitracina e 21, 9, 3, 1 e 0 mL de água ultrapura aos tubos de ensaio rotulados como A1, B1, C1, D1 e E1, respectivamente. Após filtração com membrana filtrante microporosa de 0,22 μm, coloque o filtrado em frascos de amostra rotulados como A2, B2, C2, D2 e E2.
   NOTA: As concentrações da solução padrão de bacitracina são 30, 60, 120, 180 e 240 U / mL.
5. Colocar A2, B2, C2, D2, E2 e S1 no tabuleiro de ensaio do instrumento de HPLC. Coloque 1000 mL de 50 mM / L de formiato de amônio e 1000 mL de acetonitrila na bandeja de fase móvel e defina-os como fases móveis A e B, respectivamente.
   NOTA: O pH do formiato de amônio deve ser ajustado para 4,0 com ácido fórmico.
6. Instale a coluna de HPLC C18 (5 μm, 4.6 mm x 250 mm) na direção indicada na coluna (consulte a Tabela de Materiais).
7. Defina os parâmetros da fase móvel como 0 min, 77% A e 23% B; 30 min, 70% A e 30% B; 40 min, 60% A e 40% B; 50 min, 60% A e 40% B; 51 min, 77% A e 23% B; 58 min, 77% A e 23% B. Defina o tamanho da amostra como 100 μL; Vazão, 1,0 mL/min; Temperatura da coluna, 30 °C.
8. Clique no botão Executar para executar o programa.

6. Identificação morfológica

1. Diluir e revestir a estirpe com o título de bacitracina mais elevado numa placa de cultura LB e cultivar numa incubadora a 37 °C durante 48 h. Manchar e observar a morfologia da colônia conforme descrito abaixo.
2. Adicione uma gota de água purificada estéril à lâmina, pegue uma pequena quantidade de colônias e adicione à gota de água. Espalhe uniformemente, deixe a lâmina secar naturalmente e fixe sobre uma chama.
3. Adicione violeta cristal por 1 min para manchar a amostra e depois enxágue com água da torneira. Adicione iodo por 1 min para manchar a amostra e depois enxágue com água destilada.
4. Adicione álcool 95%, agite a lâmina para descolorir por 1 min e depois enxágue com água destilada.
5. Adicione o açafrão por 1 min para manchar a amostra e depois enxágue com água destilada. Deixe a lâmina secar naturalmente e observe a morfologia da colônia sob um microscópio com imersão em óleo (ver Tabela de Materiais).

7. Identificação fisiológica e bioquímica

1. Adicione 2 mL de solução salina estéril no tubo de ensaio e inocule uma única colônia da placa na solução salina estéril usando um anel de inoculação para obter a suspensão bacteriana.
2. Adicione 100 μL da suspensão bacteriana em cada orifício para medir V-P, citrato, gelatina, cloreto de sódio a 7%, pH 5,7, redução de nitrato e hidrólise de amido na tira de identificação bioquímica de Bacillus (ver Tabela de Materiais).
3. Use o anel de inoculação para escolher outra colônia única e risque-as no padrão de zigue-zague no tubo bioquímico de crescimento anaeróbico da tira de identificação bioquímica do Bacilo
4. Use o anel de inoculação para pegar as outras colônias e perfurá-las verticalmente nos poros para identificação de propionato, D-xilose, L-arabinose e D-manitol na tira de identificação bioquímica do Bacillus .

8. Determinação da sequência do gene da estirpe

1. Extraia o DNA da cepa usando um kit de extração de DNA de bactérias (consulte a Tabela de Materiais): Adicione 2 mL de líquido de semente em um tubo de microcentrífuga de 5 mL e centrifugue a 11.500 x g por 1 min. Rejeitar o sobrenadante e adicionar 110 μL de tampão (contendo 20 mM de Tris, pH 8,0; 2 mM de_{Na 2-EDTA} e 1,2% de Triton) e 70 μL de solução de lisozima a 50 mg/ml ao pellet e incubar a 37 °C durante 30 min.
2. Adicione 4 μL de 100 mg / mL de RNase A por 15 s e deixe por 5 min em temperatura ambiente. Adicione 20 μL de solução de proteinase K e misture bem.
3. Adicione 220 μL de tampão GB, agite por 15 s até que o pellet esteja suspenso, coloque a 70 ° C por 10 min para tornar a solução clara e faça uma pequena centrifugação para remover as contas de água na parede do tubo.
4. Adicione 220 μL de etanol anidro, choque totalmente por 15 s, separação curta. Transferir a solução e a precipitação de floculação para a coluna de adsorção CB3 do tubo de recolha, centrifugar a 13,400 x g durante 30 s e rejeitar o sobrenadante.
5. Adicione 500 μL de tampão GD na coluna de adsorção, centrifugue por 30 s a 13.400 x g e descarte o sobrenadante. Adicione 600 μL de PW à coluna, centrifugue por 30 s a 13.400 x g e descarte o sobrenadante.
6. Voltar a colocar a coluna de adsorção no tubo de recolha, centrifugar durante 2 min a 13.400 x g e rejeitar o sobrenadante.
7. Coloque a coluna de adsorção em temperatura ambiente por 10 min para secar. Transferir a coluna para o tubo de centrifugação e adicionar 100 μL de tampão de eluição TE no meio da membrana de adsorção.
8. Deixe em temperatura ambiente por 5 min para coletar o fluxo para o tubo da centrífuga e centrifugue por 2 min a 13.400 x g.
9. Adicione 25 μL de mistura principal 2x (consulte a Tabela de Materiais), 2,5 μL de amostra de DNA obtida na etapa 8.8, 2 μL de primer direto 27F, 2 μL de primer reverso 1492R e 18,5 μL de H₂O destilado duplo a um tubo de PCR de 0,1 mL.
   NOTA: As sequências gênicas dos primers são 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' e 1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'.
10. Coloque o tubo de PCR na máquina de PCR (consulte a Tabela de Materiais) nas seguintes condições: pré-desnaturação a 95 °C por 10 min, desnaturação a 95 °C por 30 s, recozimento a 55 °C por 30 s, extensão a 72 °C por 90 s, extensão a 72 °C por 7 min. Execute o ciclo de três etapas de desnaturação, recozimento e extensão por 32x.
11. Pegue 5 μL do produto e faça eletroforese com gel de agarose a 1% a 120 V por 30 min.
    1. Dissolva 500 mg de agarose em 50 mL de tampão 1x TAE. Aqueça a solução no micro-ondas por 1-2 min até que a agarose esteja completamente dissolvida. Adicione 5 μL de corante de coloração de DNA, despeje em uma bandeja de gel e insira a placa de orifício. Deixe repousar em temperatura ambiente por 30 min até solidificar; coloque o gel no tanque de eletroforese e adicione 1x tampão TAE para submergir o gel. Adicione 2 μL de escada de DNA de 2 kb (10 mg / μL) no primeiro poço e 5 μL de produto de PCR misturado com 1 μL de corante de carga nos poços restantes no gel.
12. Coloque o gel no sistema de imagem de gel e tire uma foto. Corte as tiras de DNA rapidamente sob luz ultravioleta e pese.
13. Adicione tiras a um tubo de microcentrífuga e adicione um volume igual de solução de NP. Manter o tubo em banho-maria a 50 °C até que o gel esteja totalmente dissolvido.
14. Adicionar 500 μL de BL líquido de equilíbrio à coluna de adsorção CA2, centrifugar a 13.400 x g durante 1 min e rejeitar o sobrenadante.
15. Adicione a solução de gel dissolvido à coluna de adsorção CA2 e coloque-a à temperatura ambiente por 2 min, centrifugue-a a 13.400 x g por 30 s e descarte o sobrenadante.
16. Adicionar 600 μL de PW à coluna de adsorção CA2, centrifugar a 13.400 x g durante 1 min, rejeitar o sobrenadante e repetir 1x.
17. Colocar a coluna de adsorção CA2 num tubo de recolha, centrifugar a 13.400 x g durante 2 minutos e rejeitar o sobrenadante.
18. Coloque a coluna de adsorção CA2 em temperatura ambiente por 10 min para secar completamente e, em seguida, coloque-a em um tubo de centrífuga limpo.
19. Adicione 50 μL de tampão eluidor EB ao filme de adsorção suspenso à temperatura ambiente por 2 min e colete a solução de DNA por centrifugação a 13.400 x g por 2 min.
    NOTA: As soluções ou reagentes acima mencionados estão incluídos no Kit de Purificação (consulte a Tabela de Materiais).
    1. Envie a solução de DNA coletada para uma empresa de sequenciamento profissional (consulte a Tabela de Materiais) para sequenciamento. Compare os resultados do sequenciamento por Blast no banco de dados GenBank do NCBI. De acordo com a homologia de sequência, selecione diferentes linhagens e construa árvores filogenéticas pelo método de Máxima Verossimilhança no MEGA-X para determinar as relações entre as espécies das linhagens.

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Resultados

Neste experimento, 48 cepas de Bacillus foram isoladas de fezes frescas de suínos saudáveis, numeradas de 1001 a 1048. Dentre elas, 15 cepas apresentaram atividade antibacteriana contra M. luteus. Das 15 cepas, os títulos de bacitracina foram medidos por cromatografia líquida de alta eficiência, conforme mostrado na Tabela 1. Dentre eles, B. licheniformis nº 1026 apresentou o maior título de bacitracina, 456,35 ± 21,75 U/mL, de modo que...

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Discussão

B. licheniformis cresce rapidamente com condições de cultura simples e consumo rápido de açúcar, e a tecnologia de fermentação madura é útil para economizar custos de produção industrial¹³. A ampla aplicação de B. licheniformis e suas secreções, a bacitracina, determinou seu valor de mercado promissor. Na agricultura, B. licheniformis é empregado como biofertilizante para melhorar o crescimento das plantas e a absorção ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 × Phanta Flash Master Mix	Nanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing,China	P252-01
2kb DNA Marker	Beijing Trans Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China	BM121-01
Acetonitrile	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, China	A104443
Agar powder	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	A800730
Agarose	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, China	A104062
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China	10002917
Autoclave sterilizer	Zealway Instrument Inc., Xiamen, China	GI36DWS
Bacillus biochemical identification strip	Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, China	HBIG14
Bacitracin	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Shanghai, China	B65740
Bacteria DNA Extraction Kit	Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Beijing, China	DP209
Breathable sealing film	Beijing Leiborun Biotechnology Co., Ltd.	BS-QM-01A
Butanol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	B433378
C18 (5 μm, 4.6 × 250 mm) HPLC column	Rizhao Kepuno New Material Co., Ltd., Rizhao, China	C1805-462510
Calcium carbonate (CaCO3)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China	10005717
Centrifuge	New Brunswick Scientific Co., Inc., UK	5452
Chromatographic tank	Nanjing Tenghui Experimental Technology Co., Ltd., Nanjing, China	P-1
Conical bottle	Sichuan Shubo  Co., Ltd., Chengdu, China	18012
Constant temperature incubator	Taist Instrument Co., Ltd., Tianjin, China	GH4500
Dipotassium phosphate (K2HPO4)	Xilong Chemical Co., Ltd., Guangdong, China	XL0015
EDTA-2Na	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, China	E397526
Electronic balance	Mettler Toledo International Co., Ltd.	FA2104
Ethyl alcohol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, China	E130059
Gel Midi Purification Kit	Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Beijing, China	DP302
Glass rod	Chengdu Yibang Kexi Instrument Co., Ltd.	1294
Glucose	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	D823520
Gram 's staining solution kit	Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, China	HB8278
High performance liquid chromatograph	Agilent Technologies, Inc., California, America	1260
Horizontal electrophoresis apparatus	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China	DYCP-31DN BIOMATE
Inoculation ring	Shanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China	3171026
Magnetic stirrer	Wiggens GmbH Co., Ltd., Germany	WH220 PLUS
Methyl alcohol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, China	M116115
Microcentrifuge tube	Shanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China	1351171
Micrococcus luteus	Bena Culture Collection, Suzhou, China	BNCC102589
Microporous filter membrane	Nantong Suri Experimental Equipment Co., Ltd.	PES0.22
Ninhydrin	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	N105629
Optical microscope	Optical Instrument Factory, Shanghai, China	DYS-108
Pig feces	Nanjing Quanfu Pig Farm, Nanjing, China
Polymerase chain reaction (PCR) Amplifier	Suzhou Dongsheng Xingye Scientific Instrument Co., Ltd., Suzhou, China	ETC811
Professional sequencing company	General Biology (Anhui) Co., Ltd., Anhui, China
Pyridine	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	P111516
Shaker	Taicang Qiangle Experimental Equipment Co., Ltd.,Taicang, China	HYL-C
Silica gel GF254 thin layer plate	Yantai Huayang New Material Co., Ltd., Yantai, China	HPT-HSGF5025023
Sodium chloride (NaCl)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	S805275
Sodium citrate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China	C39197100001
Soluble starch	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	S817547
Thermostat water bath	Shanghai Heheng Instrument Equipment Co., Ltd., Shanghai, China	DK-8D
Tryptone	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	T139519
Ultra GelRed	Nanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing,China	GR501-01
Ultra pure water instrument	Merck KGaA Co., Ltd., Germany	Milli Direct-Q8
Ultrasonic cleaner	Jiangsu Huaguan Electric Appliance Group Co., Ltd., Jiangsu, China	SB-100DT
Vernier caliper	Sanfeng Company, Japan	N20P
Yeast extract powder	Vicbio Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China	LP0021