JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מספק תיאור מלא ומקיף של התהליך המפורט לבידוד, טיהור וזיהוי של Bacillus licheniformis המייצר בציטראצין מצואת חזירים בריאה.

Abstract

ל-Bacillus licheniformis ול-bacitracin יש שוק יישומים עצום וערך בתחומי הרפואה, הכימיה, החקלאות הימית, החקלאות החקלאית ומוצרי צד. לכן, יש חשיבות רבה לבחירה של B. licheniformis עם ייצור גבוה של בציטראצין. בפרוטוקול ניסיוני זה, בצילוס עם תפוקה גבוהה של בציטראצין בודד, טוהר וזוהה מצואה טרייה של חזירים בריאים. נבדקה גם ההשפעה המעכבת של מטבוליט משני בציטראצין על Micrococcus luteus . כרומטוגרפיה בשכבה דקה וכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים שימשו לזיהוי איכותי וכמותי של בציטרצין. המאפיינים הפיזיולוגיים והביוכימיים של B. licheniformis נקבעו על ידי ערכות רלוונטיות. הקשרים הפילוגנטיים של B. licheniformis נקבעו ונבנו באמצעות זיהוי רצף גנים. פרוטוקול זה מתאר ומציג את תהליך הבידוד, הטיהור והזיהוי הסטנדרטי של B. licheniformis מצואה טרייה של בעלי חיים מנקודות מבט מרובות, ומספק שיטה לניצול בקנה מידה גדול של B. licheniformis ו-bacitracin במפעלים.

Introduction

בצילוס ליכניפורמיס (שם מדעי: Bacillus licheniformis) הוא מין של בצילוס ממשפחת הפירמיקטיים, הנפוץ באופן נרחב בסביבות שונות כגון מים, אדמה ומעייםשל בעלי חיים. ל-B. licheniformis מבנה דמוי מוט קצר וחזק והוא נע בנפרד2. המושבה כמעט עגולה ומשעממת, עם בליטה מרכזית וקצוות מסודרים בצבע לבןאפרפר 3. יש לו יכולת צמיחה ורבייה חזקה והוא יכול לספוג ולנצל חומרים מזינים ממקורות פחמן שונים, כגון חד סוכרים, פוליסכרידים, קטוז וחומצות אורגניות4. בשלב מאוחר יותר של גדילה והתפתחות, B. licheniformis יכול להתקיים בצורה של נבגים רדומים ולייצר חומרים אנטיבקטריאליים כמו בציטראצין, ליצ'ניסין וסורפקטין. זה יכול גם להתנגד למחסור תזונתי ולסביבה חיצונית קיצונית5. אין העדפה ברורה של קודון, ומערכת ההפרשה היעילה קובעת את הפרשת החלבון ההטרולוגית של B. licheniformis, שהיא כפולה מזו של Bacillus subtilis6. הוא משמש לעתים קרובות לייצור תכשירי אנזימים כגון פרוטאז, עמילאז וצלולאז7. בגלל היעדר רעלנים אנדוגניים, הוא מאושר כזן בטוח למזון ומופיע ב-QPS על ידי EFSA8. לכן, ישנם מספר שימושים פוטנציאליים, כולל ייצור תרכובות ביו-אקטיביות, שיש להם מגוון רחב של יישומים בתעשיות החקלאות הימית, החקלאות, המזון, הביו-רפואה והתרופות. כמו כן, B. licheniformis הוא מרכיב חשוב בפלורת המעיים של בעלי חיים, שיכול לקדם בעלי חיים לשיפור ביצועי הייצור, שיפור איזון חיידקי המעיים ומניעת מחלות. כל הגנום של B. licheniformis ATCC14580 נותח בשנת 2004, ומידע הרקע של תרגום השעתוק, קיפול החלבון ומנגנון ההפרשה הובן בהדרגה9. מידע גנטי זה הופך אותו לתורם לשינוי גנטי ברמה המולקולרית, ותורם להקלה על ייצור בקנה מידה גדול של B. licheniformis.

Bacitracin היא אנטיביוטיקה פפטידית דודקציקלית המיוצרת על ידי סינתטאז פפטיד שאינו ריבוזומלי על ידי חילוף חומרים משני ב-B. subtilis ו-B. licheniformis. בציטראצין הוא תערובת המורכבת ממרכיבים שונים כגון בציטראצין A, B ו-C, כאשר חומצת אמינו אחת או שתיים נבדלות בין כל מרכיב; מבין אלה, לבציטרצין A יש את הפעילות הביולוגית החזקה ביותר10. בציטראצין יכול לעכב חיידקים גרם חיוביים כגון סטפילוקוקוס ומיקרוקוקוס לוטאוס וכמה חיידקים גרם שליליים על ידי עיכוב היווצרות דופן התא ואינטראקציה עם חלבונים קושרי ממברנה11. בינתיים, בציטראצין בטוח ויציב, לא קל לייצר עמידות לתרופות, ויכול להיות תואם לתרופות אנטיבקטריאליות אחרות12. לכן, בציטראצין משמש בפרקטיקה רפואית ווטרינרית. בנוסף, בגלל קצב החיסול המהיר וקצב הספיגה הנמוך, הוא יכול לשמש גם כתוסף למזון לבעלי חיים13.

B. licheniformis יכול ליישב את המעי ולשפר את המיקרו-סביבה של מערכת העיכול. יכולת ההדבקה והרבייה והתפקודים הפיזיולוגיים הקשורים של בצילוס ממקורות שונים במערכת העיכול של בעלי חיים שונים שונים. B. licheniformis שמקורו בחזיר תורם יותר להתיישבות במעיים של חזירים ובעלי חיים אחרים. קיים קשר הדוק בין השפע היחסי של פרוביוטיקה במעי לבין המצב הבריאותי של מארח14. תוסף תזונה עם תערובת B. licheniformis בחזירונים נגמלים משפר את המערכת האקולוגית של המעי על ידי שינוי הרכב המיקרוביוטה והפעילות המטבולית, ומשפיע גם על רירית המעי15. צואת בעלי חיים יכולה לשקף את סוג וכמות פלורת המעיים של בעלי חיים. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והטיהור של Bacillus spp. המייצר בציטראצין מצואת חזירים בריאה. הצואה מופקת מזרעי טאיהו שאינם ניזונים ממזון מורכב ויש להם ביצועי ייצור מצוינים בחוות חזירים. המבודדים זוהו כ-B. licheniformis על סמך המאפיינים המורפולוגיים שלהם, התכונות הפיזיקוכימיות והזיהוי הביוכימי שלהם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הליכי הניסוי תועדו ואושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת נאנג'ינג טק. הצואה הופקה מזרעי טאיהו בני כשנתיים (ראו טבלת חומרים), שגודלו בחוות חזירים מקצועיות וסטנדרטיות.

1. הכנת מדיה

  1. מדיום נוזלי Luria-Bertani (LB): יש להוסיף 10 גרם NaCl, 5 גרם אבקת תמצית שמרים ו-10 גרם טריפטון לבקבוק חרוטי, להוסיף מים מזוקקים ל-1 ליטר, לערבב ולהמיס בעזרת מוט זכוכית. העבירו 100 מ"ל בינוני לבקבוק חרוטי של 500 מ"ל וקשרו אותו היטב עם סרט איטום נושם. יש לעקר בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס בחיטוי למשך 20 דקות (ראה טבלת חומרים).
  2. מדיום מוצק LB: יש להוסיף 10 גרם NaCl, 5 גרם אבקת תמצית שמרים, 10 גרם טריפטון, 20 גרם אבקת אגר לבקבוק חרוטי, להוסיף מים מזוקקים ל-1 ליטר, להמיס עם מוט זכוכית ולקשור היטב עם סרט איטום נושם. מעקרים ב-121 מעלות צלזיוס בחיטוי למשך 20 דקות. כשהמדיום מקורר ל -50 מעלות צלזיוס, יוצקים 20 מ"ל מהמדיום לצלחות פטרי, מניחים להם להתקרר ואז מאחסנים אותם הפוך.
  3. מדיום תסיסה של בציטראצין: מוסיפים 8 גרם קמח סויה, 4 גרם עמילן מסיס, 0.1 גרם (NH4)2SO4, 0.6 גרם CaCO3 ו-100 מ"ל מים מזוקקים לבקבוק חרוטי של 500 מ"ל, מערבבים עם מוט זכוכית להמסה יסודית, וקושרים היטב עם סרט איטום נושם. יש לעקר בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס בחיטוי למשך 20 דקות (ראה טבלת חומרים).
  4. תרחיף M. luteus: בחר טבעת של M. luteus וחסן על צלחת תרבית LB, שהוכנה בשלב 1.2 (ראה טבלת חומרים). תרבית בחממה בטמפרטורה קבועה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות (ראה טבלת חומרים). יש להוסיף 5 מ"ל של מי מלח רגילים לצלחת ולנער בעדינות כדי לנקות את המושבות. מדוד את ה-OD600 ודלל את התמיסה במבחנה כדי לקבל תרחיף עם OD600 של 0.3-0.7. אחסן את התרחיף של M. luteus ב-4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
  5. מדיום בדיקת פעילות אנטיבקטריאלית: הוסף 1 מ"ל של תרחיף M. luteus , שהוכן בשלב 1.4, ל-100 מ"ל של מדיום מוצק LB נוזלי שהוכן בשלב 1.2 ונער מעט. יש ליטול מיד 5 מ"ל של תמיסה זו המכילה M. luteus ולמרוח אותה באופן שווה על צלחת התרבית LB.

2. בידוד וטיהור של בצילוס מצואה טרייה של חזירים בריאים

  1. הוסף 9 מ"ל מי מלח רגילים ו -1.0 גרם צואת חזירים טרייה לבקבוק ארלנמאייר בנפח 150 מ"ל. מערבבים עם מערבל מגנטי (ראה טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר ב-60 סל"ד/דקה למשך 15 דקות.
  2. הכניסו את תמצית הצואה לאמבט מים תרמוסטט של 80 מעלות צלזיוס (ראו טבלת חומרים) למשך 20 דקות כדי להרוג חיידקים שאינם מייצרים נבגים.
  3. הוסף את המתלה ל-100 מ"ל של מדיום נוזלי LB בבקבוק ארלנמאייר 250 מ"ל ותרבית בשייקר (ראה טבלת חומרים) ב-180 סל"ד/דקה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 8 שעות.
  4. בצע דילול סדרתי של תמיסת החיידקים המתורבתת במי מלח רגילים מ-10-1 ל-10-8. מרחו 0.1 מ"ל של מדלל חיידקים 10-6, 10-7 ו-10-8 על צלחות תרבית LB בודדות והניחו להתייבש. לאחר 10 דקות, הניחו צלחות הפוכות באינקובטור בטמפרטורה קבועה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
  5. השתמשו בטבעת החיסון כדי לבחור את המושבות שנראות דומות ל-B. licheniformis (צבע לבן קרמי, עקביות רכה, מראה רירי, קמור וגובה שטוח וצורה לא סדירה)16ופס אותן באמצעות תבנית זיגזג על מדיום בדיקת פעילות אנטיבקטריאלית שהוכן בשלב 1.5 (ראו איור 1).
  6. הכניסו את הצלחות לחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות ושימו לב אם יש אזור עיכוב סביב המושבה.

3. סינון לעיכוב פעילות M. luteus

  1. בחר מושבה בודדת שיצרה אזור מעכב והוסף ל-100 מ"ל של מדיום נוזלי LB, תרבית בשייקר ב-37 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד/דקה למשך 12 שעות.
  2. יש לחסן 5 מ"ל ממדיום התרבית למדיום התסיסה של בציטראצין שהוכן בשלב 1.3 ולתרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
  3. אוספים את מרק התסיסה בצינור צנטריפוגה וצנטריפוגה ב-13,400 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן מסננים באמצעות קרום פילטר מיקרופורוס של 0.22 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים).
  4. הוסף אוקספורד לצלחת בינונית לבדיקת פעילות אנטיבקטריאלית טרייה ולאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר של פילטראט (סופרנטנט תסיסה) לכוס אוקספורד (ראה טבלת חומרים). תרבית בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. לאחר הדגירה יש למדוד את קוטר האזור המעכב בעזרת קליפר ורניר (ראה טבלת חומרים).
  5. בחר את הזנים ואת סופרנטנט התסיסה המתאים עם קוטר אזור מעכב גדול מ-15 מ"מ לניסויים הבאים.

4. זיהוי בציטראצין על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה

  1. הוסף 60 מ"ג של תקן בציטראצין והמיס ב-1% EDTA-2Na (ראה טבלת חומרים) בבקבוק נפחי של 10 מ"ל כדי ליצור תמיסת בציטראצין של 6.0 מ"ג/מ"ל.
  2. יש לדלל 1 מ"ל של חומר התסיסה ל-10 מ"ל עם 1% EDTA-2Na. נקודה של 5 מיקרוליטר של דגימה ו-5 מיקרוליטר של תמיסה סטנדרטית של בציטראצין על צלחת השכבה הדקה של סיליקה ג'ל פעיל (ראה טבלת חומרים).
  3. הוסף 100 מ"ל של n-בוטנול-חומצה אצטית-מים-פירידין-אתנול (60:15:10:6:5) למיכל הכרומטוגרפי (ראה טבלת חומרים). הנח את צלחת השכבה הדקה של סיליקה ג'ל לתוך המיכל הכרומטוגרפי. מכסים ונותנים לו לשבת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  4. הוציאו את צלחת השכבה הדקה של סיליקה ג'ל, רססו תמיסת בוטנול-פירידין (99:1) המכילה 1% נינהידרין (ראו טבלת חומרים), וחממו בחום של 105 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עד להופעת כתמים אדומים חומים. חשב Rf (ערך גורם שמירה) עבור התקן והמדגם לפי הנוסחה הבאה:
    Rf = מרחק נסיעה נקודתי/מרחק נסיעה ממס.

5. איתור בציטראצין על ידי HPLC

  1. הוסף 0.3 מ"ל של סופרנטנט תסיסה ו-1.2 מ"ל של 50% אתנול לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 2 מ"ל, לנער במשך 5 דקות ביד ולהניח לעמוד על 4 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.
  2. צנטריפוגה ב-13,400 x גרם למשך 15 דקות ומסנן לבקבוק דגימה המסומן כ-S1 עם קרום מסנן מיקרו-נקבובי של 0.22 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים).
  3. הכנת תמיסת אם בציטרצין: הוסף 0.4 גרם תקן בציטראצין (60 U/mg; ראה טבלת חומרים), 100 מ"ל של 40 גרם/ליטר EDTA-2Na (ראה טבלת חומרים) לבקבוק נפחי של 100 מ"ל להכנת תמיסת אם בציטראצין של 240 U/mL.
  4. הוסף 3 מ"ל של תמיסת אם בציטראצין ו-21, 9, 3, 1 ו-0 מ"ל של מים טהורים במיוחד למבחנות המסומנות A1, B1, C1, D1 ו-E1, בהתאמה. לאחר סינון עם קרום מסנן מיקרופורי של 0.22 מיקרומטר, הכניסו את המסנן לבקבוקי דגימה המסומנים A2, B2, C2, D2 ו-E2.
    הערה: הריכוזים של תמיסה סטנדרטית של בציטראצין הם 30, 60, 120, 180 ו-240 U/mL.
  5. הנח את A2, B2, C2, D2, E2 ו-S1 לתוך מגש הבדיקה של מכשיר ה-HPLC. הנח 1000 מ"ל של פורמט אמוניום של 50 מ"מ/ליטר ו-1000 מ"ל של אצטוניטריל במגש הפאזה הנייד והגדר אותם כשלבים ניידים A ו-B, בהתאמה.
    הערה: יש להתאים את ה-pH של פורמט אמוניום ל-4.0 עם חומצה פורמית.
  6. התקן את עמודת HPLC C18 (5 מיקרומטר, 4.6 מ"מ x 250 מ"מ) בכיוון המצוין בעמודה (ראה טבלת חומרים).
  7. הגדר את פרמטרי הפאזה הניידת כ- 0 דקות, 77% A ו- 23% B; 30 דקות, 70% A ו-30% B; 40 דקות, 60% A ו-40% B; 50 דקות, 60% A ו-40% B; 51 דקות, 77% A ו-23% B; 58 דקות, 77% A ו-23% B. הגדר את גודל המדגם כ-100 מיקרוליטר; קצב זרימה, 1.0 מ"ל לדקה; טמפרטורת העמודה, 30 מעלות צלזיוס.
  8. לחץ על כפתור ההפעלה כדי להפעיל את התוכנית.

6. זיהוי מורפולוגי

  1. יש לדלל ולצפות את הזן בטיטר הבציטרצין הגבוה ביותר על צלחת תרבית LB ותרבית באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. לצבוע ולהתבונן במורפולוגיה של המושבה כמתואר להלן.
  2. הוסף טיפת מים מטוהרים סטריליים למגלשה, הרם כמות קטנה של מושבות והוסף לטיפת המים. מורחים באופן שווה, נותנים לשקופית להתייבש באופן טבעי ואז מקבעים מעל להבה.
  3. הוסף סגול קריסטל למשך דקה אחת כדי להכתים את הדגימה ולאחר מכן שטוף במי ברז. הוסף יוד למשך דקה אחת כדי להכתים את הדגימה ולאחר מכן שטוף במים מזוקקים.
  4. יש להוסיף 95% אלכוהול, לנער את השקף עד להסרת צבע למשך דקה אחת, ולאחר מכן לשטוף במים מזוקקים.
  5. הוסף זעפרן למשך דקה אחת כדי להכתים את הדגימה ולאחר מכן שטוף במים מזוקקים. הניחו למגלשה להתייבש באופן טבעי והתבוננו במורפולוגיה של המושבה תחת מיקרוסקופ עם טבילת שמן (ראו טבלת חומרים).

7. זיהוי פיזיולוגי וביוכימי

  1. הוסף 2 מ"ל של מי מלח סטריליים למבחנה וחסן מושבה בודדת מהצלחת לתמיסת המלח הסטרילית באמצעות טבעת חיסון לקבלת תרחיף חיידקים.
  2. הוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף החיידקים לכל חור למדידת V-P, ציטראט, ג'לטין, 7% נתרן כלורי, pH 5.7, הפחתת חנקות והידרוליזה של עמילן על רצועת הזיהוי הביוכימית של Bacillus (ראה טבלת חומרים).
  3. השתמש בטבעת החיסון כדי לבחור מושבה בודדת נוספת ולפס אותה בתבנית הזיגזג על הצינור הביוכימי של הצמיחה האנאירובית של רצועת הזיהוי הביוכימית של Bacillus .
  4. השתמש בטבעת החיסון כדי לבחור את המושבות האחרות ולנקב אותן אנכית לתוך הנקבוביות לזיהוי פרופיונט, D-xylose, L-arabinose ו-D-מניטול ברצועת הזיהוי הביוכימית של Bacillus .

8. קביעת רצף הגנים של הזן

  1. חלץ את ה-DNA של הזן באמצעות ערכת מיצוי DNA של חיידקים (ראה טבלת חומרים): הוסף 2 מ"ל של נוזל זרעים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 5 מ"ל וצנטריפוגה ב-11,500 x גרם למשך דקה אחת. השליכו את הסופרנטנט והוסיפו לגלולה 110 מיקרוליטר של מאגר (המכיל 20 מ"מ טריס, pH8.0; 2 מ"מ Na 2-EDTA ו-1.2% טריטון) ו-70 מיקרוליטר של תמיסת ליזוזים של 50 מ"ג/מ"ל ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  2. מוסיפים 4 מיקרוליטר של 100 מ"ג/מ"ל RNase A למשך 15 שניות ומשאירים למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מוסיפים 20 מיקרוליטר תמיסת פרוטאינאז K ומערבבים היטב.
  3. הוסף 220 מיקרוליטר של מאגר GB, לנער במשך 15 שניות עד שהגלולה מושעית, להניח בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להבהיר את התמיסה, ולבצע סיבוב קצר כדי להסיר את חרוזי המים על דופן הצינור.
  4. הוסף 220 מיקרוליטר אתנול נטול מים, הלם מלא למשך 15 שניות, הפרדה קצרה. העבירו את התמיסה ואת משקעי הפלוקולציה לעמודת הספיחה CB3 של צינור האיסוף, צנטריפוגה ב-13,400 x גרם למשך 30 שניות, והשליכו את הסופרנטנט.
  5. הוסף 500 מיקרוליטר של GD מאגר לעמודת הספיחה, צנטריפוגה למשך 30 שניות ב-13,400 x גרם, והשליך את הסופרנטנט. הוסף 600 מיקרוליטר של PW לעמודה, צנטריפוגה למשך 30 שניות ב-13,400 x גרם, והשליך את הסופרנטנט.
  6. החזירו את עמודת הספיחה לצינור האיסוף, צנטריפוגה למשך 2 דקות בטמפרטורה של 13,400 x גרם, והשליכו את הסופרנטנט.
  7. הנח את עמוד הספיחה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לייבוש. העבירו את העמודה לצינור הצנטריפוגה והוסיפו 100 מיקרוליטר של מאגר TE לאמצע קרום הספיגה.
  8. השאירו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות כדי לאסוף את הזרימה לתוך צינור הצנטריפוגה והצנטריפוגה למשך 2 דקות בטמפרטורה של 13,400 x גרם.
  9. הוסף 25 מיקרוליטר של תערובת מאסטר 2x (ראה טבלת חומרים), 2.5 מיקרוליטר של דגימת DNA שהתקבלה בשלב 8.8, 2 מיקרוליטר של פריימר 27F קדימה, 2 מיקרוליטר של פריימר הפוך 1492R ו-18.5 מיקרוליטר של H2O מזוקק כפול לצינור PCR של 0.1 מ"ל.
    הערה: רצפי הגנים של הפריימרים הם 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ו-1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'.
  10. הכנס את צינור ה-PCR למכונת ה-PCR (ראה טבלת חומרים) בתנאים הבאים: קדם-דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, חישול ב-55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, הארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות, הארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות. הפעל את מחזור שלושת השלבים של דנטורציה, חישול והארכה למשך 32x.
  11. קח 5 מיקרוליטר מהמוצר ובצע אלקטרופורזה עם ג'ל אגרוז 1% ב -120 וולט למשך 30 דקות.
    1. ממיסים 500 מ"ג אגרוז ב-50 מ"ל של מאגר TAE 1x. מחממים את התמיסה במיקרוגל למשך 1-2 דקות עד להמסה מלאה של האגרוז. מוסיפים 5 מיקרוליטר של צבע מכתים DNA, ואז יוצקים למגש ג'ל ומכניסים את לוחית הפתח. מניחים לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות עד שהוא מתמצק; הכניסו את הג'ל למיכל האלקטרופורזה והוסיפו 1x מאגר TAE כדי להטביע את הג'ל. הוסף 2 מיקרוליטר של סולם DNA של 2 קילו-בייט (10 מ"ג/מיקרוליטר) לבאר הראשונה ומוצר PCR של 5 מיקרוליטר מעורבב עם 1 מיקרוליטר של צבע טעינה לבארות הנותרות בג'ל.
  12. מניחים את הג'ל במערכת הדמיית הג'ל ומצלמים תמונה. חותכים את רצועות ה- DNA במהירות באור אולטרה סגול ומשקלים.
  13. הוסף רצועות לצינור מיקרו-צנטריפוגה והוסף נפח שווה של תמיסת PN. שמור את הצינור באמבט מים בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס עד שהג'ל נמס לחלוטין.
  14. הוסף 500 מיקרוליטר של נוזל שיווי משקל BL לעמודת הספיחה CA2, צנטריפוגה ב-13,400 x גרם למשך דקה אחת, והשליך את הסופרנטנט.
  15. הוסף את תמיסת הג'ל המומסת לעמוד הספיחה CA2 והניח אותה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות, צנטריפוגה אותה ב-13,400 x גרם למשך 30 שניות, והשליך את הסופרנטנט.
  16. הוסף 600 מיקרוליטר של PW לעמודת הספיחה CA2, צנטריפוגה ב-13,400 x g למשך דקה אחת, השליך את הסופרנטנט וחזור על 1x.
  17. הנח את עמוד הספיחה CA2 לתוך צינור איסוף, צנטריפוגה ב-13,400 x גרם למשך 2 דקות, והשליך את הסופרנטנט.
  18. הנח את עמוד הספיחה CA2 בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לייבוש יסודי ולאחר מכן הכניס אותו לצינור צנטריפוגה נקי.
  19. הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר EB לסרט הספיחה התלוי בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות, ואסוף את תמיסת ה-DNA על ידי צנטריפוגה ב-13,400 x גרם למשך 2 דקות.
    הערה: התמיסות או הריאגנטים שהוזכרו לעיל כלולים בערכת הטיהור (ראה טבלת חומרים).
    1. שלח את תמיסת ה-DNA שנאספה לחברת ריצוף מקצועית (ראה טבלת חומרים) לריצוף. השווה את תוצאות הריצוף של Blast במסד הנתונים של GenBank של NCBI. על פי הומולוגיה של רצף, בחר זנים שונים ובנה עצים פילוגנטיים בשיטת הסבירות המקסימלית ב-MEGA-X כדי לקבוע את יחסי המינים של הזנים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בניסוי זה, 48 זנים של בצילוס בודדו מצואה טרייה של חזירים בריאים, שמספרם נע בין 1001 ל-1048. ביניהם, ל-15 זנים הייתה פעילות אנטיבקטריאלית נגד M. luteus. מתוך 15 הזנים, הטיטר של בציטראצין נמדד על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, כפי שמוצג בטבלה 1. ביניהם, ל...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

B. licheniformis גדל במהירות בתנאי גידול פשוטים וצריכת סוכר מהירה, וטכנולוגיית התסיסה הבוגרת מסייעת בחיסכון בעלויות הייצור התעשייתי13. היישום הנרחב של B. licheniformis והפרשותיו, Bacitracin, קבע את שווי השוק המבטיח שלו. בחקלאות, B. licheniformis משמש כדשן ביולוגי לשיפור ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי התוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח של סין (מס' 2022YFC2104800), ופרויקט שש פסגות הכישרונות במחוז ג'יאנגסו (מס' 2019-NY-058).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2 × Phanta Flash Master MixNanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing,ChinaP252-01
2kb DNA MarkerBeijing Trans Biotechnology Co., Ltd., Beijing, ChinaBM121-01
AcetonitrileShanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, ChinaA104443
Agar powderShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaA800730
AgaroseShanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, ChinaA104062
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China10002917
Autoclave sterilizerZealway Instrument Inc., Xiamen, ChinaGI36DWS
Bacillus biochemical identification stripQingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, ChinaHBIG14
BacitracinShanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaB65740
Bacteria DNA Extraction KitTiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaDP209
Breathable sealing filmBeijing Leiborun Biotechnology Co., Ltd.BS-QM-01A
ButanolShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaB433378
C18 (5 μm, 4.6 × 250 mm) HPLC columnRizhao Kepuno New Material Co., Ltd., Rizhao, ChinaC1805-462510
Calcium carbonate (CaCO3)Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China10005717
CentrifugeNew Brunswick Scientific Co., Inc., UK5452
Chromatographic tank Nanjing Tenghui Experimental Technology Co., Ltd., Nanjing, ChinaP-1
Conical bottleSichuan Shubo  Co., Ltd., Chengdu, China18012
Constant temperature incubatorTaist Instrument Co., Ltd., Tianjin, ChinaGH4500
Dipotassium phosphate (K2HPO4)Xilong Chemical Co., Ltd., Guangdong, ChinaXL0015
EDTA-2NaShanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, ChinaE397526
Electronic balanceMettler Toledo International Co., Ltd.FA2104
Ethyl alcoholShanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, ChinaE130059
Gel Midi Purification KitTiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaDP302
Glass rodChengdu Yibang Kexi Instrument Co., Ltd.1294
GlucoseShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaD823520
Gram 's staining solution kitQingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, ChinaHB8278
High performance liquid chromatographAgilent Technologies, Inc., California, America1260
Horizontal electrophoresis apparatusBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd., Beijing, ChinaDYCP-31DN BIOMATE
Inoculation ringShanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China3171026
Magnetic stirrerWiggens GmbH Co., Ltd., GermanyWH220 PLUS
Methyl alcoholShanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, ChinaM116115
Microcentrifuge tubeShanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China1351171
Micrococcus luteusBena Culture Collection, Suzhou, ChinaBNCC102589
Microporous filter membraneNantong Suri Experimental Equipment Co., Ltd.PES0.22
NinhydrinShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaN105629
Optical microscopeOptical Instrument Factory, Shanghai, ChinaDYS-108
Pig fecesNanjing Quanfu Pig Farm, Nanjing, China
Polymerase chain reaction (PCR) AmplifierSuzhou Dongsheng Xingye Scientific Instrument Co., Ltd., Suzhou, ChinaETC811
Professional sequencing companyGeneral Biology (Anhui) Co., Ltd., Anhui, China
PyridineShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaP111516
ShakerTaicang Qiangle Experimental Equipment Co., Ltd.,Taicang, ChinaHYL-C
Silica gel GF254 thin layer plateYantai Huayang New Material Co., Ltd., Yantai, ChinaHPT-HSGF5025023
Sodium chloride (NaCl)Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaS805275
Sodium citrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, ChinaC39197100001
Soluble starchShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaS817547
Thermostat water bathShanghai Heheng Instrument Equipment Co., Ltd., Shanghai, ChinaDK-8D
TryptoneShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaT139519
Ultra GelRedNanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing,ChinaGR501-01
Ultra pure water instrumentMerck KGaA Co., Ltd., GermanyMilli Direct-Q8
Ultrasonic cleanerJiangsu Huaguan Electric Appliance Group Co., Ltd., Jiangsu, ChinaSB-100DT
Vernier caliper Sanfeng Company, JapanN20P
Yeast extract powderVicbio Biotechnology Co., Ltd., Beijing, ChinaLP0021

References

  1. Shleeva, M. O., Kondratieva, D. A., Kaprelyants, A. S. Bacillus licheniformis: A producer of antimicrobial substances, including antimycobacterials, which are feasible for medical applications. Pharmaceutics. 15 (7), 1893(2023).
  2. Muras, A., Romero, M., Mayer, C., Otero, A. Biotechnological applications of Bacillus licheniformis. Crit. Rev. Biotechnol. 41 (4), 609-627 (2021).
  3. He, H., et al. Biotechnological and food synthetic biology potential of platform strain: Bacillus licheniformis. Syn Syst Biotechno. 8 (2), 281-291 (2023).
  4. Sun, Y., et al. Enhanced β-mannanase production by Bacillus licheniformis by optimizing carbon source and feeding regimes. Prep Biochem Biotech. 52 (7), 845-853 (2022).
  5. Trunet, C., et al. Suboptimal Bacillus licheniformis and Bacillus weihenstephanensis spore incubation conditions increase heterogeneity of spore outgrowth time. Appl Environ Microb. 86 (6), e02061-e02119 (2020).
  6. Lee, N. K., Kim, W. S., Paik, H. D. Bacillus strains as human probiotics: characterization, safety, microbiome, and probiotic carrier. Food Sci Biotechnol. 28 (5), 1297-1305 (2019).
  7. Yi, W., et al. Dietary novel alkaline protease from Bacillus licheniformis improves broiler meat nutritional value and modulates intestinal microbiota and metabolites. Anim Microbiome. 6 (1), 1-16 (2024).
  8. Vasileios, B., et al. Safety and efficacy of Bacillus licheniformis DSM 32457 as a silage additive for all animal species. EFSA Journal. 17 (8), e05787(2019).
  9. Birgit, V., et al. The complete genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13, an organism with great industrial potential. J Mol Microb Biotech. 7 (4), 204-211 (2004).
  10. Zhu, J., et al. Microbial synthesis of bacitracin: Recent progress, challenges, and prospects. Synth Syst Biotechnol. 8 (2), 314-322 (2023).
  11. Shleeva, M. O., Kondratieva, D. A., Kaprelyants, A. S. Bacillus licheniformis: A producer of antimicrobial substances, including antimycobacterials, which are feasible for medical applications. Pharmaceutics. 15 (7), 1893(2023).
  12. Willdigg, J. R., et al. The Bacillus subtilis cell envelope stress-inducible ytpAB operon modulates membrane properties and contributes to bacitracin resistance. J Bacteriol. 206 (3), e0001524(2024).
  13. Silva, K. G. S., et al. Effects of bacterial direct-fed microbial mixtures offered to beef cattle consuming finishing diets on intake, nutrient digestibility, feeding behavior, and ruminal kinetics/fermentation profile. J Anim Sci. 102, skae003 (2024).
  14. Jia, D., et al. Probiotic Bacillus licheniformis ZW3 alleviates DSS-induced colitis and enhances gut homeostasis. Int J Mol Sci. 25 (1), 561(2024).
  15. Wang, X., et al. Dietary supplementation with Bacillus mixture modifies the intestinal ecosystem of weaned piglets in an overall beneficial way. J Appl Microbiol. 130 (1), 233-246 (2021).
  16. James, N., et al. Unravelling the potential plant growth activity of halotolerant Bacillus licheniformis NJ04 isolated from soil and its possible use as a green bioinoculant on Solanum lycopersicum L. Environ. Res. 216 (2), 114620(2024).
  17. Shen, P., et al. Exploitation of ammonia-inducible promoters for enzyme overexpression in Bacillus licheniformis. J Ind Microbiol Biot. 48 (5-6), kuab037 (2021).
  18. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).
  19. Fan, B., Chen, T. Y., Zhang, S., Wu, B., He, B. F. Mining of efficient microbial UDP-glycosyltransferases by motif evolution cross plant kingdom for application in biosynthesis of salidroside. Sci Rep. 7 (1), 463(2017).
  20. Hugo, R. O., Bernardo, R. B., Alejandra, C. S. R. Potential application of the probiotic Bacillus licheniformis as an adjuvant in the treatment of diseases in humans and animals: A systematic review. Front Microbiol. 13, 993451(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Bacillus licheniformisBacitracin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved