Isolierung, Reinigung und Identifizierung von Bacitracin-produzierenden Bacillus licheniformis aus frischem Kot gesunder Schweine

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine vollständige und umfassende Beschreibung des detaillierten Prozesses zur Isolierung, Reinigung und Identifizierung von Bacitracin-produzierenden Bacillus licheniformis aus gesundem Schweinekot.

Zusammenfassung

Bacillus licheniformis und Bacitracin haben einen riesigen Anwendungsmarkt und Wert in den Bereichen Medizin, Chemie, Aquakultur, Landwirtschaft und Nebenprodukte. Daher ist die Selektion von B. licheniformis mit hoher Produktion von Bacitracin von großer Bedeutung. In diesem Versuchsprotokoll wurde Bacillus mit einer hohen Ausbeute an Bacitracin isoliert, gereinigt und aus dem frischen Kot gesunder Schweine identifiziert. Die hemmende Wirkung des Sekundärmetaboliten Bacitracin auf Micrococcus luteus wurde ebenfalls getestet. Für den qualitativen und quantitativen Nachweis von Bacitracin wurden die Dünnschichtchromatographie und die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie eingesetzt. Die physiologischen und biochemischen Eigenschaften von B. licheniformis wurden mit entsprechenden Kits bestimmt. Die phylogenetischen Verwandtschaftsverhältnisse von B. licheniformis wurden mittels Gensequenzdetektion bestimmt und konstruiert. Dieses Protokoll beschreibt und stellt den standardmäßigen Isolierungs-, Reinigungs- und Identifizierungsprozess von B. licheniformis aus tierischem Frischkot aus mehreren Perspektiven vor und bietet eine Methode für den großflächigen Einsatz von B. licheniformis und Bacitracin in Fabriken.

Einleitung

Bacillus licheniformis ist eine Bacillus-Art aus der Familie der Firmicutes, die in verschiedenen Umgebungen wie Wasser, Boden und Tierdärmen weit verbreitet ist¹. B. licheniformis hat eine kurze und kräftige, stäbchenartige Struktur und bewegt sich einzeln². Die Kolonie ist fast rund und stumpf, mit einer mittleren Wölbung und sauberen Rändern von grauweißer³. Es hat eine starke Wachstums- und Fortpflanzungsfähigkeit und kann Nährstoffe aus verschiedenen Kohlenstoffquellen wie Monosacchariden, Polysacchariden, Ketose und organi....

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Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden von der Ethikkommission der Nanjing Tech University dokumentiert und genehmigt. Der Kot stammt von Taihu-Sauen, die etwa 2 Jahre alt sind (siehe Materialtabelle), die auf professionellen und Standard-Schweinefarmen aufgezogen wurden.

1. Vorbereitung der Medien

1. Luria-Bertani (LB) Flüssigmedium: 10 g NaCl, 5 g Hefeextraktpulver und 10 g Trypton in eine konische Flasche geben, destilliertes Wasser auf 1 l geben, umrühren und mit einem Glasstab auflösen. Füllen Sie 100 mL Medium in eine konische 500-ml-Flasche und binden Sie sie....

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Ergebnisse

In diesem Experiment wurden 48 Bacillus-Stämme aus frischem Kot gesunder Schweine isoliert, die von 1001 bis 1048 nummeriert waren. Darunter zeigten 15 Stämme eine antibakterielle Wirkung gegen M. luteus. Von den 15 Stämmen wurden die Titer von Bacitracin mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gemessen, wie in Tabelle 1 dargestellt. Unter ihnen hatte B. licheniformis Nr. 1026 mit 456,35 ± 21,75 U/ml den höchsten Bacitracin-Titer.......

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Diskussion

B. licheniformis wächst schnell unter einfachen Kulturbedingungen und schnellem Zuckerverbrauch, und die ausgereifte Fermentationstechnologie ist hilfreich bei der Einsparung von industriellen Produktionskosten¹³. Die breite Anwendung von B. licheniformis und seinen Sekreten, Bacitracin, hat seinen vielversprechenden Marktwert bestimmt. In der Landwirtschaft wird B. licheniformis als Biodünger eingesetzt, um das Pflanzenwachstum und di.......

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 × Phanta Flash Master Mix	Nanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing,China	P252-01
2kb DNA Marker	Beijing Trans Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China	BM121-01
Acetonitrile	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, China	A104443
Agar powder	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	A800730
Agarose	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, China	A104062
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China	10002917
Autoclave sterilizer	Zealway Instrument Inc., Xiamen, China	GI36DWS
Bacillus biochemical identification strip	Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, China	HBIG14
Bacitracin	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Shanghai, China	B65740
Bacteria DNA Extraction Kit	Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Beijing, China	DP209
Breathable sealing film	Beijing Leiborun Biotechnology Co., Ltd.	BS-QM-01A
Butanol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	B433378
C18 (5 μm, 4.6 × 250 mm) HPLC column	Rizhao Kepuno New Material Co., Ltd., Rizhao, China	C1805-462510
Calcium carbonate (CaCO3)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China	10005717
Centrifuge	New Brunswick Scientific Co., Inc., UK	5452
Chromatographic tank	Nanjing Tenghui Experimental Technology Co., Ltd., Nanjing, China	P-1
Conical bottle	Sichuan Shubo  Co., Ltd., Chengdu, China	18012
Constant temperature incubator	Taist Instrument Co., Ltd., Tianjin, China	GH4500
Dipotassium phosphate (K2HPO4)	Xilong Chemical Co., Ltd., Guangdong, China	XL0015
EDTA-2Na	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, China	E397526
Electronic balance	Mettler Toledo International Co., Ltd.	FA2104
Ethyl alcohol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, China	E130059
Gel Midi Purification Kit	Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Beijing, China	DP302
Glass rod	Chengdu Yibang Kexi Instrument Co., Ltd.	1294
Glucose	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	D823520
Gram 's staining solution kit	Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, China	HB8278
High performance liquid chromatograph	Agilent Technologies, Inc., California, America	1260
Horizontal electrophoresis apparatus	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China	DYCP-31DN BIOMATE
Inoculation ring	Shanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China	3171026
Magnetic stirrer	Wiggens GmbH Co., Ltd., Germany	WH220 PLUS
Methyl alcohol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, China	M116115
Microcentrifuge tube	Shanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China	1351171
Micrococcus luteus	Bena Culture Collection, Suzhou, China	BNCC102589
Microporous filter membrane	Nantong Suri Experimental Equipment Co., Ltd.	PES0.22
Ninhydrin	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	N105629
Optical microscope	Optical Instrument Factory, Shanghai, China	DYS-108
Pig feces	Nanjing Quanfu Pig Farm, Nanjing, China
Polymerase chain reaction (PCR) Amplifier	Suzhou Dongsheng Xingye Scientific Instrument Co., Ltd., Suzhou, China	ETC811
Professional sequencing company	General Biology (Anhui) Co., Ltd., Anhui, China
Pyridine	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	P111516
Shaker	Taicang Qiangle Experimental Equipment Co., Ltd.,Taicang, China	HYL-C
Silica gel GF254 thin layer plate	Yantai Huayang New Material Co., Ltd., Yantai, China	HPT-HSGF5025023
Sodium chloride (NaCl)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	S805275
Sodium citrate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China	C39197100001
Soluble starch	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	S817547
Thermostat water bath	Shanghai Heheng Instrument Equipment Co., Ltd., Shanghai, China	DK-8D
Tryptone	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	T139519
Ultra GelRed	Nanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing,China	GR501-01
Ultra pure water instrument	Merck KGaA Co., Ltd., Germany	Milli Direct-Q8
Ultrasonic cleaner	Jiangsu Huaguan Electric Appliance Group Co., Ltd., Jiangsu, China	SB-100DT
Vernier caliper	Sanfeng Company, Japan	N20P
Yeast extract powder	Vicbio Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China	LP0021