农田土壤中常规微塑料的分离和鉴定

摘要

这里介绍的是一种从土壤中提取微塑料并鉴定其聚合物类型的方法。该方法已针对执行、适用性和成本效益进行了优化。它为标准化识别土壤中塑料微粒的分析方法奠定了科学基础。

摘要

在过去十年中，陆地环境中的微塑料 （MP） 污染越来越受到关注，越来越多的研究描述了不同土壤系统中微塑料的数量和类型及其对土壤和作物健康的影响。然而，使用了不同的 MP 提取和分析方法，限制了比较结果和为行业建议和政策制定者提供可靠证据的机会。在这里，我们提出了一个协议，描述了从土壤中对常规 MP 进行采样、分离和化学鉴定的方法。该方法成本低，材料容易获得。这提高了作的便利性，并可能有助于广泛采用。该协议提供了有关使用无塑料器具从顶部 0-30 厘米土壤收集样品的详细信息;通过使用各种固体介质（如膨润土、二氧化硅和未受污染的土壤）模拟不同的土壤类型，并添加相同质量的聚乙烯 （PE）-MPs 进行后续量化;使用饱和氯化钠 （NaCl） 溶液对塑料颗粒进行密度分离，并使用 4 M 氢氧化钠 （NaOH） 溶液消解上清液中的有机杂质;尼罗红染色后使用荧光显微镜对颗粒进行定量;以及使用微傅里叶变换红外光谱 （μ-FTIR） 或激光直接红外 （LDIR） 光谱进行聚合物鉴定。上述媒体的 MP 回收率在 83% - 90% 之间。该协议提供了一种有效的土壤 MPs 分析方法，该方法针对可行性、适用性和成本效益进行了优化。此外，随附的视频可以指导逐步虚拟分析土壤 MP 的过程。本研究致力于标准化土壤 MPS 分析方法，增强测量的连通性和可比性，并为更加标准化和科学的研究奠定基础。

引言

据估计，每年有 4.8 至 1270 万吨塑料从陆地来源进入海洋 ^1,2。这些塑料颗粒在紫外线照射、机械磨损和生物降解的作用下逐渐降解成更小的碎片 ^3,4。土壤中的塑料微粒 （MP） 污染（直径小于 5 毫米的塑料颗粒）正成为一个越来越令人担忧的问题，尤其是其对土壤和作物健康的潜在影响。这主要是由于塑料产量的持续增长以及围绕塑料废物的适当处置所面临的挑战 ^5,6。

MPS 在土壤中的积累可归因于各种外部因素。土壤中 MP 的潜在来源很复杂，包括利用塑料栽培做法（例如，塑料地膜、灌溉管道、温室薄膜和相关基础设施）^7,8,9 和有机改良剂的输入（例如污水污泥应用、农业堆肥和有机肥料）¹⁰。此外，塑料垃圾¹¹ 的不当处理、食品塑料包装残渣中消化的食物垃圾^{的分解 12}、涂膜肥料的利用¹³、橡胶轮胎的磨损¹⁴ 和大气沉积¹⁵ 也是土壤中 MP 的已知贡献者。中国是农业塑料，尤其是塑料地膜的主要生产国和用户，据估计，在大量塑料覆盖的农业农田中，纤维素的平均含量约为 4231 公斤^-1（干土）¹⁶。2018 年，中国农田 0-10 cm 深度土壤中 MPS 的数量在 4.9 × 10⁶ 至 1.0 × 10⁷ 吨之间，其中农业地膜的贡献很大¹⁷。在欧洲和北美，将污泥应用于农业土壤每年可能分别输入超过 63,000 吨和 44,000 吨 MP¹⁸。德国的一项研究表明，将堆肥应用于耕地也导致每年向耕地输入塑料颗粒 （>1 毫米）。堆肥的应用导致了 350 亿到 2.2 万亿个塑料颗粒¹⁰。大气中 MPS 对土壤的贡献仍不确定，需要进一步量化¹⁵。例如，中国大气 MP 的年平均输入估计为 7.9 × 10⁴ 项 ^{m-2 yr-1 16}。土壤中 MPs 的来源极其广泛，引起了许多研究人员的关注，但由于采样、提取和分析检测方法的多样性，难以整合和比较各种研究的结果。

来自广泛来源的 MPS 积累对全球土壤构成潜在的环境威胁¹⁶，这凸显了对土壤中 MP 进行研究的明确必要性。一些研究表明，MPS 对农业土壤的影响包括改变土壤特性、阻碍植物和土壤生物的生长和发育以及影响土壤微生物活动^19,20。其他研究发现，MP 可以在食物链中较高营养级的生物体内积累²¹，对人类健康造成潜在危害²²。为了阐明 MPS 对土壤环境的影响，首先需要了解其污染的现状，包括它们的丰度、聚合物鉴定和分布特征。因此，土壤 MP 的准确鉴定和检测至关重要。

目前，越来越多的文章正在探索土壤中 MP 的全球存在，在提取和检测方法中观察到相当大的差异²³。在仔细收集样品后（以尽量减少 MP 污染），MP 分析方案通常包括三个关键步骤。首先，密度分离被广泛用于从土壤基质中分离 MPs 颗粒。该工艺通常使用蒸馏 （DI） 水 （1.0 g ^cm-3）、氯化钠 （NaCl， 1.2 g ^cm-3） 或氯化锌 （ZnCl₂， 1.6 g ^cm-3） 等试剂。其次，去除 MP 表面有机杂质的方法包括用酸性和碱性溶液或其他氧化剂清洗和酶消化²⁴。土壤基质中的有机物或粘附在 MPS 颗粒上的消化通常使用 30% 的过氧化氢 （H₂O₂）、65% 硝酸 （HNO₃） 或 50% 氢氧化钠 （NaOH） ²⁵。在密度分离和有机物消解之后，需要对 MPS 样品进行显微镜检查以确定颗粒的数量。该检查辅以通过傅里叶变换红外光谱 （FTIR）、拉曼光谱或其他近红外光谱技术等技术分析聚合物的化学成分²⁶。

然而，MPS 提取和检测过程中的每一步都有可能高估或低估 MP 的发生率。例如，尽管由于去离子水的成本效益和无危险特性，其作为密度分离的试剂被广泛使用，但它可能会导致排除密度更高的 MPs 颗粒²⁷。相反，高密度试剂的广泛应用可能会受到环境危害和成本增加的限制²⁸。此外，某些用于有机消化的试剂有可能对 MPS 颗粒造成损害²⁹。此外，使用光学、立体和解剖显微镜进行视觉分类并非没有挑战^26,30。MPS 颗粒的测定在很大程度上取决于分析人员的专业知识和作，以及仪器设置。这些发现强调了在采用各种方法时难以实现一致性和准确性，从而使不同研究的结果比较复杂。

为了确保不同研究数据的可靠性和可比性，必须建立土壤中 MPs 提取和检测的标准化方案。这种标准化不仅将提高 MPS 发生评估的准确性，还有助于更全面、更统一地了解 MPS 对土壤生态系统的环境影响。为了解决提取和检测方法的局限性，为标准化方法选择的试剂应随时可用，不应影响 MPs 颗粒的完整性或化学成分，并且构成最低的可行环境风险。此外，标准化方法应证明在回收 MP 和从土壤基质中去除有机物方面具有很高的效率。

易于遵循的实验步骤对于在不同研究环境中的广泛采用至关重要。考虑到 MPs 回收率和成本效益，饱和 NaCl 是大规模土壤样品密度分离的最佳选择。对于有机物的消化，使用了 NaOH，因为初步分离实验表明，4 M NaOH 溶液可有效分解土壤样品杂质，例如植物残留物，而不会对 MP 造成重大损害。通常，这种实验方法利用现成的且具有成本效益的材料，作复杂性低，并确保可靠的提取率。

我们建议使用中国农业科学院提出的快速经济的分离方法来确定在农田中收集的 MP³¹。对于以下所有步骤，请确保在使用前用去离子水清洁所有容器、仪器和玻璃器皿，以尽量减少污染。此外，请确保在样品旁边定期运行空白样，以解决收集和提取程序引入的污染。

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研究方案

注：在提取过程之前，需要在环境温度下制备以下溶液：1） 饱和 NaCl 溶液 （5.7 M） - 将 1 kg NaCl 溶于 3 L DI H₂O 中;2） 4 M NaOH - 将 480 g NaOH 溶于 3 L DI H₂O 中;3） 尼罗红 （100 μg ^mL-1） - 将 10 mg 尼罗红溶于 100 mL 适溶剂（如甲醇、丙酮）中。

1. 土壤取样和准备

1. 使用五点采样方法以 “W ”形方式在整个研究区域收集具有代表性的土壤样本（图 1）。使用 30 厘米的不锈钢土壤螺旋钻进行收集程序。收集样品并将其储存在非塑料容器中，例如铝箔。
   注意：土壤样品可以分成不同的所需深度（例如，0-10、10-20 和 20-30 厘米）。为了尽量减少塑料污染，请避免使用塑料采样设备和储存容器。相反，使用铝箔等非塑料容器来收集和储存样品。这些样品可以批量提供一个复合样品，也可以作为独立的重复保存。
2. 在室温下干燥土壤，避免阳光直射。
   1. 如果有土壤干燥器，请使用它来同时处理多个土壤样品，因为各个腔室内的过滤器可将交叉污染的风险降至最低。
   2. 否则，使用设置为 40 oC 的烤箱并将土壤干燥至少 24 小时，直到完全干燥。
   3. 使用 2-5 毫米金属筛研磨和筛分干燥的土壤。去除可见的植物材料、石头和其他惰性材料。
      注意：用铝箔松散地覆盖土壤，以尽量减少烤箱/干燥器内的空气污染。用金属镊子从土壤中收集可见的塑料碎片 （> 5 mm），并将它们放入无塑料的储存容器中，以便稍后要进行大型塑料分析。
3. 使用 2 位小数秤，将 5.0 g ± 0.05 g 的土壤样品称量到无塑料的称量纸或铝箔上。对不同的样品使用新的称量纸，以尽可能减少交叉污染。样品可以储存在无塑料容器（例如玻璃瓶）中。

2. 密度浮选

1. 将 5.0 g 干燥土壤样品转移到干净的 600 mL 玻璃烧杯（烧杯 A）中。确保所有储存容器和烧杯的准确贴标。
2. 将 230 mL 饱和 NaCl 溶液加入烧杯 A。将烧杯 A 放在磁力搅拌板上，并加入玻璃磁力搅拌器。以 260 rpm 的速度搅拌溶液 30 分钟，直至完全均质化。
3. 完全均质后，从溶液中取出磁力搅拌器，并用饱和的 NaCl 溶液冲洗，以防止塑料颗粒从溶液中带出。将烧杯放在没有阳光直射的平坦表面上，静置过夜，直到发生全密度分离。
   注意：执行整个程序时，必须用铝箔完全覆盖，以避免空气中的塑料污染物。

3. 杂质消化

1. 烧杯 A 的内容物完全分离后，小心地将上清液转移到一个新的、干净的 600 mL 玻璃烧杯（烧杯 B）中。用饱和 NaCl 溶液小心冲洗烧杯 A 的内壁。将上清液转移到烧杯 B 中。执行此过程 2-3 次。
   注：建议总共使用 200 mL 的上清液。确保总上清液体积一致，同时在下一步中保持相同浓度的消化液。
2. 向烧杯 B 中的样品中加入 4 M NaOH 溶液，以达到 500 mL 的固定体积。将烧杯 B 放在磁力搅拌板上，加入玻璃磁力搅拌器，并以 260 rpm 的速度搅拌溶液 30 分钟，直至完全均质。在此过程中，请用铝箔覆盖烧杯，以尽量减少空气污染。
3. 完全均质后，从溶液中取出磁力搅拌器，用饱和 NaCl 溶液冲洗以去除任何附着的颗粒。将烧杯 B 放在没有阳光直射的平坦表面上，静置过夜，直到发生全密度分离和有机物消解。
   注意：执行整个程序时，必须用铝箔完全覆盖，以避免塑料污染物从空气中进入溶液。消解时间取决于有机材料的数量和类型。如果需要，延长消解时间，以确保有机物完全消解。成功消化后，上清液应看起来清晰，烧杯中没有可见的有机物漂浮。

4. 用尼罗红溶液着色

1. 烧杯 B 的内容物完全分离后，小心地将上清液转移到新的、干净的 600 mL 玻璃烧杯（烧杯 C）中。用去离子水冲洗烧杯 B 的内壁，以确保最大的颗粒转移。
   1. 如果烧杯 C 中的体积小于 500 mL，则用去离子水补足至 500 mL，以统一溶液体积。
2. 将尼罗红溶液加入烧杯 C 中，以达到 0.5 M 的最终最大浓度。用玻璃棒搅拌溶液直至完全均质，然后用铝箔覆盖烧杯，让溶液在黑暗中孵育 30 分钟。

5. 真空过滤

1. 按以下顺序设置真空过滤设备：玻璃漏斗、金属夹、真空过滤底座、收集烧杯、连接软管、集水阱和真空泵。使用金属镊子小心地从其储存容器中取出新膜（孔径 0.2 μm，直径 47 mm）。将滤膜放在真空过滤底座顶部的中央和平放置。
   注意： 将真空过滤底座与玻璃漏斗对齐并用金属夹固定，确保连接牢固。
2. 激活真空过滤，将烧杯 C 中的液体缓慢倒入玻璃漏斗中。用去离子水冲洗烧杯 C 数次，以最大限度地提高颗粒回收率。样品过滤后，用去离子水冲洗玻璃漏斗的侧面，以确保颗粒损失最小。
   注：用铝箔覆盖玻璃漏斗，以尽量减少过滤过程中的空气污染。如果样品的颗粒数较高且过滤速度降低，则可以对同一样品使用多个膜。这将确保颗粒在膜上的均匀分布，并最大限度地降低颗粒聚集和重叠的风险，以便以后进行定量。
3. 过滤完成后，使用镊子小心地从多孔板中取出滤膜，并将每个膜放入单独的玻璃培养皿中。在关闭培养皿并将其用铝箔包裹之前，让膜完全干燥。将其存放在干燥避光处，直到进一步分析。

6. 通过荧光显微镜定量 MPs 颗粒

1. 如果以后的聚合物鉴定需要荧光颗粒在膜上的确切位置（例如，使用 FTIR），请参阅以下步骤：
   1. 使用黑色中性笔在滤膜上轻轻标记开始位置和 10 个标记，遵循“Z”的形状（图 2）。使用镊子将膜小心地放在显微镜载物台上的载玻片上，确保样品表面平坦。
   2. 按以下顺序激活荧光仪器：主机、荧光源、监视器和荧光显微镜。打开乐器并将源的 Light 旋钮设置为最大亮度。利用 明场 （BF） 和 荧光灯 （FL） 开关按钮分别拍摄 BF 和 FL 图像。
   3. 使用软件进行样品观察和记录（例如 DP2-BSW），在 BF 位置下拍摄明场照片。将旋钮转到 FL 位置，并在黑暗中使用荧光滤光片拍照。确保视野观察序列从 1 到 10。确保 FL 和 BL 照片拍摄在同一位置。
      注：荧光显微镜分析应在过滤后 24-48 小时内进行，以确保颗粒的最佳荧光。确保 BF 和 FL 图像在同一位置拍摄（图 3）。确保使用相同的放大倍率和仪器设置分析所有膜。
2. 要使用 LDIR 进行聚合物鉴定，请执行以下显微镜步骤：
   1. 按如下方式设置显微镜系统：相机、滤光片、放大倍率和显微镜载物台以及计算机。根据样品和背景荧光，选择最适合所需激发和发射波长（例如，分别为 470 nm 和 495 nm）的滤光片模式。
   2. 用无尘纸巾擦拭滤膜支架，然后将膜固定在支架中并滑到显微镜载物台上。目视扫描整个膜，以确保颗粒分布均匀。
   3. 确保相机已连接，并且显微镜放大倍率适用于所有样品类型，并且在同一组的所有样品中保持一致。在使用卷尺开始分析之前，确定用相机捕获的区域大小（以毫米为单位）。
      注：如果颗粒分布均匀，则通过在膜上选择所需数量的采样点来分析至少 10% 的总膜面积。使用相机拍摄每个采样点的照片。

7. 使用 FTIR 或 LDIR 光谱法进行 MP 聚合物鉴定

1. 如果使用 FTIR 鉴定聚合物颗粒，请参考以下步骤。
   1. 打开 FTIR 光谱仪和相应的软件进行样品观察和记录。在测量每个样品之前清洁探头。
   2. 通过实时屏幕录制识别要监控的颗粒。通过纵摇杆调整位置和清晰度。将作平台置于中心并捕获当前的空气背景光谱。
      注意：与 BF 和 FL 图像对应的目标粒子。
   3. 测量每个粒子上的 3-5 个固定点，以获得 400-4,000 ^cm-1 红外波数范围内的光谱。在结果页面上，保存原始数据，获取光谱，并将其与标准库中的塑料光谱进行比较，以确认样品的命中质量指数（图 4）。
      注：在本研究中，由于 MP 体积小且在整个过滤器中定量它们存在挑战，因此从每个样品中选择 5-7 个代表性颗粒进行 FTIR 分析。为了确保均匀分布，选择了在滤镜上遵循“Z 形”图案的粒子。但是，应该注意的是，可能会出现一些不确定性，因为颗粒是随机选择的，而不是通过扫描整个过滤器。
   4. 如果点击质量指数 （HQI） ≥ 0.7，则接受匹配。 图 4 显示了通过 FTIR 光谱法在加标 0.04% PE-MP 的土壤样品中鉴定颗粒的示例。
2. 如果使用 LDIR 进行聚合物颗粒鉴定，请按照以下步骤作：
   1. 荧光显微镜步骤完成后，重悬颗粒以在 LDIR 上进行分析。将滤膜放入新的玻璃瓶中，加入 20 mL 纯乙醇。盖紧样品瓶，并用石蜡膜包裹盖子以防止泄漏。
   2. 在超声波浴中对样品进行超声处理至少 1 小时，直到所有颗粒都已重悬。从玻璃瓶中取出并丢弃膜。
      注：确保带有颗粒的膜面朝内，即远离样品瓶壁。超声处理时间取决于所使用的膜类型;膜可能会浸出颜色，但这不会干扰聚合物鉴定。
   3. 通过在荧光显微镜下重新分析膜并确保颗粒去除率> 95%，确认颗粒重悬成功。
   4. 将装有乙醇溶液的玻璃瓶放在磁力搅拌板上，并在样品瓶中加入一个小的磁性玻璃搅拌器。将板温度设置为 100 °C，并低速搅拌以保持颗粒悬浮，让乙醇蒸发至 5 mL 以下。
      注：用铝箔轻轻盖住样品瓶，以尽量减少样品的空气污染。可选择在温和的氮气流下干燥溶液以进行乙醇蒸发。
   5. 将样品转移至一个 8 mL 小玻璃样品瓶中，使用新乙醇冲洗 20 mL 玻璃样品瓶，以最大限度地提高颗粒回收率。
      注：如果需要，将新乙醇添加到小玻璃瓶中，使其正好达到 5 mL。
   6. 要制备用于 LDIR 分析的样品，请彻底摇晃样品，直到所有颗粒均均匀地悬浮在溶液中，然后快速将 10 μL 样品移液到载玻片上，让乙醇蒸发。再重复此步骤两次，以分析每张载玻片上每个样品的 3 个重复。
   7. 使用相关软件中的颗粒分析工具测量设定粒径范围内每个颗粒的红外光谱，并将其与内部库进行匹配以进行聚合物鉴定。
      注：在 800-1800 ^cm-1 的红外波数范围内自动测量每个颗粒上的一个点，并且颗粒自动与聚合物和其他有机和无机材料的已知库光谱匹配。
   8. 如果点击质量指数 （HQI） ≥ 0.8，则接受匹配。 图 5 显示了在 0.04% PE-MP 加标的土壤样品中通过 LDIR 光谱鉴定颗粒的示例。
      注：对于颗粒数较少的样品，可以增加样品量。

8. 使用 ImageJ 对荧光膜图像进行颗粒定量

1. 打开 ImageJ³² （版本 1.54f）并将图像加载到软件中。将图像的比例调整为与实际图像大小相对应的正确测量值。使用功能 分析 > 设置比例 输入图像像素和大小 （mm） 值，然后选择 全局 在会话期间将这些设置应用于所有图像。
2. 分别使用 Process > Binary 和 Image > Type > 8 位函数将图像转换为二进制图像并将其转换为 8 位。要选择用于颗粒分析的参数，请使用“分析”>“设置测量值”功能并选择所需的参数，例如“面积”、“形状描述符”和“费雷特直径”。选择 Add to overlay 并确定数据输出的小数位数。
3. 要分析颗粒，请选择 Analyze > Analyze particles 并确定感兴趣的颗粒粒径范围。将圆度设置为 0-1，取消选择像素单位，启用要显示的叠加，然后选中以下框：显示结果、排除边缘、清除结果、包括孔、汇总和叠加。将结果导出为 .csv 个结果窗口中的文件。
   注意：荧光图像的分析将仅提供颗粒数量信息，而不是聚合物数量信息;因此，需要额外的鉴定程序，例如，使用红外光谱技术。

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结果

为了验证该方法的回收率，对来自三种不同固体基质（二氧化硅 （SD）、膨润土 （BT） 和土壤）的样品进行了三次重复分析。分析样品时添加和不添加 0.04% w/w 白色聚乙烯 （PE） 微塑料（粒径范围 40-48 μm）。土壤样品采集于中国北京市海淀区（中国农业大学西校区），土壤被归类为棕褐色土壤。此外，还包括三个重复样的空白，以说明整个萃取和分析过程中引入?...

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讨论

现场土壤采样策略，包括简单随机采样或系统网格采样等方法，以及采样面积和深度，必须根据具体的研究问题进行定制，并在样本采集前明确定义。一些研究集中在 0-10 cm^34,37 的表土层，而其他研究则收集了 0-40 cm³⁸ 深度的土壤样品。由于 MP 的大小和丰度在不同土壤深度不同，因此有必要统一土壤采样的深?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-decimal balance	n/a	n/a	Standard 2-decimal balance
40 °C oven	n/a	n/a	Standard large fan-oven with temperature set to 40 °C
8700 LDIR	Agilent Technologies	n/a	LDIR used to identify particles
Aluminum container	n/a	n/a	Standard aluminum food take-away container
Aluminum foil	n/a	n/a	Standard heavy-duty aluminum foil
Axioplan 2	Zeiss	n/a	Fluorescence microscopy is used to observe microplastic particles in the fluorescent state
Bentonite clay	Sigma Aldrich	285234	Bentonite clay used for recovery tests
BX53	Olympus	n/a	Fluorescence microscopy is used to observe microplastic particles in the fluorescent state
Glass beaker (600 ml)	n/a	n/a	Standard glass beaker
Glass bottle (1 l)	n/a	n/a	Standard glass bottle
Glass magnetic stirrer bar	n/a	n/a	Standard glass coated magnetic stirrer bar
Glass measuring cylinder (500 ml)	n/a	n/a	Standard glass measuring cylinder
Glass pipette (10 ml)
Glass vacuum filtration device	Pyrex (purchased via Sigma Aldrich)	SLW5809/KIT	Glass filtration device with 500 ml funnel, porous plate, and 1 l collection beaker
LUMOS Alpha II	Bruker	n/a	FTIR used to analyze suspect microplastics.
Magnetic stirring plate	n/a	n/a	Standard magnetic stirring plate
MCE filter membrane	Jinteng company	JTMF0441/0442	White MCE membranes, 0.2 µm pore size, 50 mm diameter, with FTIR method
Nile Red	Fisher Scientific	10464311	Nile Red powder used to make stock solution of nile red dye using appropriate solvent (e.g. acetone)
PCTE filter membrane	Sterlitech Corporation	1270060	Black PCTE membranes, PVP-free, 0.2 µm pore size, 47 mm diameter, with LDIR method
Silicon dioxide	Sigma Aldrich	18649	Silicon dioxide used for recovery tests
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9888	Sodium chloride used for density separation
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	10675692	Sodium hydroxide used for organic matter digestion
Soil auger	n/a	n/a	Length 30 cm; diameter 2 cm; material stainless steel
Ultra-high molecular weight polyethylene microplastic powder	Sigma Aldrich	434272	Polyethylene microplastic used to spike silicon dioxide, bentonite clay, and soil samples for recovery tests
Vacuum pump	Vacuubrand GmBH Co KG	ME 2C NT	Vacuum pump for vacuum filtration