Separação e identificação de microplásticos convencionais de solos agrícolas

Resumo

Aqui é apresentado um método para extrair microplásticos do solo e identificar seus tipos de polímeros. O método foi otimizado para execução, aplicabilidade e custo-benefício. Ele estabelece uma base científica para padronizar o método analítico para identificar microplásticos em solos.

Resumo

A poluição por microplásticos (MPs) no ambiente terrestre tem recebido atenção crescente na última década, com estudos crescentes descrevendo o número e os tipos de MPs em diferentes sistemas de solo e seus impactos na saúde do solo e das culturas. No entanto, diferentes métodos analíticos e de extração de MPs são usados, limitando as oportunidades de comparar resultados e gerar evidências confiáveis para conselhos da indústria e formuladores de políticas. Aqui, apresentamos um protocolo que descreve a metodologia para amostragem, separação e identificação química de MPs convencionais do solo. O método é de baixo custo e os materiais estão prontamente disponíveis. Isso aumenta a facilidade operacional e pode ajudar na adoção generalizada. O protocolo fornece informações detalhadas sobre a coleta de amostras do topo de 0-30 cm de solo usando utensílios sem plástico; simulação de diferentes tipos de solo através do uso de vários meios sólidos (como argila bentonítica, dióxido de silício e solo não contaminado), com a adição da mesma massa de polietileno(PE)-MPs para posterior quantificação; separação por densidade de partículas plásticas utilizando solução saturada de cloreto de sódio (NaCl) e digestão de impurezas orgânicas no sobrenadante utilizando solução de hidróxido de sódio (NaOH) 4 M; quantificação de partículas usando microscopia fluorescente após coloração com Vermelho do Nilo; e identificação de polímeros usando espectroscopia de infravermelho por micro transformada de Fourier (μ-FTIR) ou espectroscopia de infravermelho direto a laser (LDIR). A taxa de recuperação de MPs variou de 83% a 90% para a mídia acima mencionada. Este protocolo apresenta um método eficiente para análise de MPs de solo que é otimizado para viabilidade, aplicabilidade e custo-efetividade. Além disso, o vídeo que acompanha pode orientar o processo de análise dos MPs do solo passo a passo virtualmente. Este estudo é dedicado a padronizar os métodos de análise de MPs do solo, aprimorando a conectividade e comparabilidade das medições e estabelecendo uma base para pesquisas mais padronizadas e científicas.

Introdução

Estima-se que 4,8 a 12,7 milhões de toneladas métricas de plástico entrem no oceano anualmente a partir de fontes terrestres ^1,2. Essas partículas plásticas se degradam gradualmente em fragmentos menores em resposta à irradiação ultravioleta, abrasão mecânica e biodegradação ^3,4. A poluição por microplásticos (MPs), com partículas plásticas de diâmetro inferior a 5 mm, no solo está se tornando uma preocupação crescente, principalmente em termos de seu efeito potencial na saúde do solo e das culturas. É impulsionado principalmente pelo aumento contínuo da produção de plástico e pelos desafios em torno do descarte adequado de resíduos plásticos ^5,6.

O acúmulo de MPs no solo pode ser atribuído a vários fatores externos. As fontes potenciais de MPs nos solos são complexas, incluindo a utilização de práticas de plasticultura (por exemplo, filmes plásticos de cobertura morta, tubos de irrigação, filmes de estufa e infraestrutura associada)^7,8,9 e entrada de aditivos orgânicos (como aplicação de lodo de esgoto, composto agrícola e fertilizante orgânico)¹⁰. Além disso, o descarte inadequado de lixo plástico¹¹, a decomposição de resíduos alimentares digeridos de resíduos de embalagens plásticas de alimentos¹², a utilização de fertilizantes revestidos¹³, o desgaste dos pneus de borracha¹⁴ e a deposição atmosférica¹⁵ também são contribuintes conhecidos para MPs nos solos. Estima-se que a China, o principal produtor e usuário de plásticos agrícolas, particularmente filmes plásticos de cobertura morta, tenha uma abundância média de MPs em terras agrícolas com cobertura de plástico de cerca de 4231 itens ^kg-1 (solo seco)¹⁶. Em 2018, as quantidades de MPs em solos agrícolas chineses dentro da profundidade de 0-10 cm variaram de 4,9 × 10⁶ a 1,0 × 10⁷ toneladas, com uma contribuição significativa de filmes de cobertura agrícola¹⁷. As aplicações de lodo em solos agrícolas na Europa e na América do Norte podem inserir mais de 63.000 e 44.000 toneladas de MPs por ano, respectivamente¹⁸. Um estudo na Alemanha mostrou que as aplicações de composto em campos aráveis também levaram a uma entrada anual de partículas de plástico (>1 mm) em campos aráveis. A aplicação de composto levou a 35 bilhões a 2,2 trilhões de partículas de plástico¹⁰. A contribuição dos MPs atmosféricos para os solos ainda é incerta e requer quantificação adicional¹⁵. Por exemplo, a entrada média anual de MPs atmosféricas é estimada em 7,9 × 10⁴ itens ^{m-2 ano-1} na China¹⁶. A gama extremamente ampla de fontes de MPs no solo atraiu a atenção de muitos pesquisadores, mas devido à diversidade de métodos de amostragem, extração e detecção analítica, é difícil integrar e comparar os resultados de vários estudos.

O acúmulo de MPs de uma ampla gama de fontes representa uma ameaça ambiental potencial para os solos globais¹⁶, destacando a clara necessidade de estudos de MPs no solo. Alguns estudos mostraram que os efeitos dos MPs no solo agrícola incluem alterar as propriedades do solo, impedir o crescimento e o desenvolvimento de plantas e organismos do solo e afetar a atividade microbiana do solo^19,20. Outros estudos descobriram que os MPs podem se acumular em organismos em níveis tróficos mais altos ao longo da cadeia alimentar²¹, levando a um risco potencial para a saúde humana²². Para esclarecer os efeitos ambientais do solo dos MPs, primeiro é necessário entender o status atual de sua contaminação, incluindo sua abundância, identificação de polímeros e características de distribuição. Portanto, a identificação e detecção precisas de MPs do solo são de suma importância.

Atualmente, um número crescente de artigos está explorando a presença global de MPs no solo, com considerável variação observada nos métodos de extração e detecção²³. Após a coleta cuidadosa de amostras (para minimizar a contaminação por MPs), o protocolo para análise de MPs normalmente envolve três etapas principais. Primeiro, a separação por densidade é amplamente adotada para isolar partículas de MPs da matriz do solo. Este processo geralmente utiliza reagentes como água destilada (DI) (1,0 g ^cm-3), cloreto de sódio (NaCl, 1,2 g ^cm-3) ou cloreto de zinco (ZnCl₂, 1,6 g ^cm-3). Em segundo lugar, os métodos para remover impurezas orgânicas da superfície dos MPs incluem limpeza com soluções ácidas e alcalinas ou outros agentes oxidantes e digestão enzimática²⁴. A digestão da matéria orgânica na matriz do solo ou aderida a partículas de MPs é comumente realizada com peróxido de hidrogênio a 30% (H₂O₂), ácido nítrico a 65% (HNO₃) ou hidróxido de sódio (NaOH) a 50%²⁵. Após a separação da densidade e a digestão da matéria orgânica, o exame microscópico das amostras de MPs é necessário para determinar o número de partículas. Este exame é complementado com a análise da composição química dos polímeros por meio de técnicas como Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR), espectroscopia Raman ou outras técnicas de espectroscopia de infravermelho próximo²⁶.

No entanto, cada etapa do processo de extração e detecção de MPs carrega o potencial de superestimação ou subestimação da ocorrência de MPs. Por exemplo, apesar do uso generalizado de água DI como reagente para separação de densidade devido à sua relação custo-benefício e falta de propriedades perigosas, pode levar à exclusão de partículas de MPs com maior densidade²⁷. Por outro lado, a aplicação generalizada de reagentes de alta densidade pode ser limitada por riscos ambientais e aumento de custos²⁸. Além disso, certos reagentes usados para digestão orgânica têm o potencial de causar danos às partículas MPs²⁹. Além disso, a classificação visual usando microscopia óptica, estereoscópica e anatômica não é isenta de desafios^26,30. A determinação de partículas de MPs depende muito da experiência e operação dos analistas, bem como das configurações do instrumento. Esses achados enfatizam a dificuldade em alcançar consistência e precisão ao empregar várias metodologias, dificultando a comparação dos resultados entre diferentes estudos.

Para garantir a confiabilidade e comparabilidade dos dados entre os estudos, é imperativo estabelecer um protocolo padronizado para extração e detecção de MPs no solo. Essa padronização não apenas aumentará a precisão das avaliações de ocorrência de MPs, mas também facilitará uma compreensão mais abrangente e unificada do impacto ambiental dos MPs nos ecossistemas do solo. Para lidar com as limitações dos métodos de extração e detecção, os reagentes selecionados para métodos padronizados devem estar prontamente disponíveis, não devem afetar a integridade ou a composição química das partículas de MPs e representar o menor risco ambiental possível. Além disso, métodos padronizados devem demonstrar alta eficiência tanto na recuperação de MPs quanto na remoção de matéria orgânica da matriz do solo.

Um protocolo fácil de seguir é vital para a adoção generalizada em diferentes ambientes de pesquisa. Considerando as taxas de recuperação de MPs e a relação custo-benefício, o NaCl saturado é a escolha ideal para a separação da densidade de amostras de solo em larga escala. Para a digestão da matéria orgânica, o NaOH foi utilizado, pois experimentos preliminares de isolamento mostraram que a solução de NaOH 4 M decompõe efetivamente as impurezas da amostra de solo, como resíduos vegetais, sem causar danos significativos aos MPs. Em geral, este método experimental utiliza materiais prontamente disponíveis e econômicos, tem baixa complexidade operacional e garante uma taxa de extração confiável.

Recomendamos o uso da metodologia de separação rápida e econômica proposta pela Academia Chinesa de Ciências Agrícolas para determinar MPs coletados em campos agrícolas³¹. Para todas as etapas a seguir, certifique-se de que todos os recipientes, instrumentos e vidrarias sejam limpos com água DI antes de usar para minimizar a contaminação. Além disso, certifique-se de passar brancos regulares ao lado das amostras para levar em conta a contaminação introduzida pelos procedimentos de coleta e extração.

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Protocolo

NOTA: As seguintes soluções precisam ser preparadas à temperatura ambiente antes do processo de extração: 1) Solução saturada de NaCl (5,7 M) - dissolver 1 kg de NaCl em 3 L DI H₂O; 2) NaOH 4 M - dissolver 480 g de NaOH em 3 L DI H₂O; 3) Vermelho do Nilo (100 μg ^mL-1) - dissolver 10 mg de Vermelho do Nilo em 100 mL de solvente apropriado (por exemplo, metanol, acetona).

1. Amostragem e preparação do solo

1. Colete uma amostra representativa do solo usando um método de amostragem de cinco pontos em forma de "W" em toda a área de estudo (Figura 1). Use uma broca de aço inoxidável de 30 cm para o procedimento de coleta. Colete e armazene as amostras em um recipiente que não seja de plástico, como papel alumínio.
   NOTA: As amostras de solo podem ser divididas em diferentes profundidades desejadas (por exemplo, 0-10, 10-20 e 20-30 cm). Para minimizar a contaminação por plástico, evite usar equipamentos de amostragem de plástico e recipientes de armazenamento. Em vez disso, recipientes não plásticos, como papel alumínio, são usados para coletar e armazenar as amostras. Essas amostras podem ser agrupadas para fornecer uma amostra composta ou mantidas como réplicas independentes.
2. Seque o solo em temperatura ambiente, longe da luz solar direta.
   1. Se um secador de solo estiver disponível, use-o para processar várias amostras de solo simultaneamente, pois o filtro dentro das câmaras individuais minimiza o risco de contaminação cruzada.
   2. Caso contrário, utilizar uma estufa regulada para 40 oC e secar o solo durante um mínimo de 24 h, até secar completamente.
   3. Moa e peneire o solo seco usando uma peneira de metal de 2-5 mm. Remova material vegetal visível, pedras e outros materiais inertes.
      NOTA: Cubra frouxamente o solo com papel alumínio para minimizar a contaminação do ar dentro do forno/secador. Colete os detritos plásticos visíveis (> 5 mm) do solo com uma pinça de metal e coloque-os em um recipiente de armazenamento sem plástico, se for realizada uma análise posterior do macroplástico.
3. Usando uma balança de 2 casas decimais, pesar 5,0 g ± 0,05 g da amostra de solo em um papel de pesagem sem plástico ou papel alumínio. Use um novo papel de pesagem para diferentes amostras para minimizar a contaminação cruzada. As amostras podem ser armazenadas em recipientes sem plástico (por exemplo, frascos de vidro).

2. Flutuação de densidade

1. Transfira a amostra de 5,0 g de solo seco para um copo de vidro limpo de 600 mL (Copo A). Garanta a rotulagem precisa de todos os recipientes e copos de armazenamento.
2. Adicione 230 mL de solução saturada de NaCl ao béquer A. Coloque o béquer A em uma placa de agitação magnética e adicione um agitador magnético de vidro. Agitar a solução durante 30 min a 260 rpm até homogeneizar totalmente.
3. Uma vez totalmente homogeneizado, remova o agitador magnético da solução e enxágue com solução saturada de NaCl para evitar que partículas de plástico sejam retiradas da solução. Colocar o copo sobre uma superfície plana e sem luz solar directa e deixá-lo em repouso durante a noite, até que se verifique a separação total da densidade.
   NOTA: Ao realizar todo o procedimento, é necessário cobrir totalmente com papel alumínio para evitar contaminantes plásticos do ar.

3. Digestão de impurezas

1. Uma vez que o conteúdo do copo A esteja completamente separado, transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo copo de vidro limpo de 600 ml (copo B). Enxágue cuidadosamente as paredes internas do béquer A com solução saturada de NaCl. Transfira o sobrenadante para o béquer B. Execute este procedimento 2-3 vezes.
   NOTA: Recomenda-se um total de 200 mL de sobrenadante. Certifique-se de que o volume total do sobrenadante seja consistente, mantendo a mesma concentração de solução de digestão na próxima etapa.
2. Adicionar solução de NaOH 4 M à amostra no copo B para atingir um volume fixo de 500 ml. Colocar o copo B numa placa de agitação magnética, adicionar um agitador magnético de vidro e agitar a solução durante 30 minutos a 260 rpm até homogeneizar completamente. Mantenha o copo coberto com papel alumínio durante este processo para minimizar a contaminação do ar.
3. Depois de totalmente homogeneizado, remova o agitador magnético da solução e enxágue com solução saturada de NaCl para remover quaisquer partículas aderidas. Colocar o copo B sobre uma superfície plana e sem luz solar directa e deixá-lo em repouso durante a noite até que se verifique a separação total da densidade e a digestão da matéria orgânica.
   NOTA: Ao realizar todo o procedimento, é necessário cobrir totalmente com papel alumínio para evitar que contaminantes plásticos entrem na solução vindos do ar. A duração da digestão depende da quantidade e do tipo de material orgânico. Estenda o tempo de digestão, se necessário, para garantir a digestão completa da matéria orgânica. Após uma digestão bem-sucedida, o sobrenadante deve ter um aspecto límpido, sem matéria orgânica visível a flutuar no copo.

4. Coloração com solução de Vermelho do Nilo

1. Uma vez que o conteúdo do copo B esteja completamente separado, transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo copo de vidro limpo de 600 ml (copo C). Enxágue as paredes internas do béquer B com água DI para garantir a máxima transferência de partículas.
   1. Se o volume no copo C for inferior a 500 ml, completar o valor para 500 ml com água DI para unificar o volume da solução.
2. Adicionar a solução de vermelho do Nilo ao copo C para obter uma concentração máxima final de 0,5 M. Agitar a solução com uma vareta de vidro até ficar completamente homogeneizada e, em seguida, deixar incubar durante 30 minutos no escuro, cobrindo o copo com papel de alumínio.

5. Filtragem a vácuo

1. Configure os dispositivos de filtragem a vácuo na seguinte ordem: funil de vidro, braçadeira de metal, base de filtragem a vácuo, copo de coleta, mangueira de conexão, coletor de umidade e bomba de vácuo. Remova cuidadosamente uma nova membrana (tamanho de poro de 0,2 μm, 47 mm de diâmetro) de seu recipiente de armazenamento usando uma pinça de metal. Coloque a membrana do filtro centralmente e plana na parte superior da base de filtração a vácuo.
   NOTA: Garanta uma conexão segura alinhando a base de filtragem a vácuo com o funil de vidro e prendendo-a com um metal clamp.
2. Activar a filtração a vácuo e deitar lentamente o líquido do copo C no funil de vidro. Enxágue o béquer C várias vezes com água DI para maximizar a recuperação de partículas. Enxágue as laterais do funil de vidro com água DI após a filtração da amostra para garantir a perda mínima de partículas.
   NOTA: Cubra o funil de vidro com papel alumínio para minimizar a contaminação do ar durante o processo de filtração. Se a amostra tiver um alto número de partículas e a velocidade de filtração diminuir, várias membranas podem ser usadas para a mesma amostra. Isso garantirá uma distribuição uniforme das partículas através da membrana e minimizará o risco de agregação e sobreposição de partículas para posterior quantificação.
3. Quando a filtração estiver concluída, recupere cuidadosamente a membrana do filtro da placa porosa usando uma pinça e coloque cada membrana em uma placa de Petri de vidro individual. Deixe a membrana secar completamente antes de fechar a placa de Petri e envolvê-la em papel alumínio. Guarde-o em local seco e escuro até uma análise mais aprofundada.

6. Quantificação de partículas de MPs por microscopia de fluorescência

1. Se a localização exata das partículas fluorescentes na membrana for necessária para identificação posterior do polímero (por exemplo, usando FTIR), consulte as etapas abaixo:
   1. Use uma caneta de gel preta para marcar suavemente a posição inicial e 10 marcas na membrana do filtro, seguindo a forma do "Z" (Figura 2). Coloque a membrana cuidadosamente nas lâminas de vidro na platina do microscópio usando uma pinça, garantindo uma superfície plana da amostra.
   2. Ative o instrumento de fluorescência na seguinte ordem: o hospedeiro, fontes fluorescentes, monitor e microscópio de fluorescência. Ligue o instrumento e ajuste o botão de luz da fonte para o brilho máximo. Utilize os botões de comutação de campo claro (BF) e luz fluorescente (FL) para obter imagens BF e FL, respectivamente.
   3. Usando o software para observação e gravação de amostras (por exemplo, DP2-BSW), tire fotos de campo claro na posição BF. Gire o botão para a posição FL e tire fotos com o filtro de fluorescência no escuro. Certifique-se de que a sequência de observação do campo de visão seja de 1 a 10. Certifique-se de que as fotos FL e BL sejam tiradas na mesma posição.
      NOTA: A análise microscópica fluorescente deve ser realizada dentro de 24-48 h após a filtração para garantir a fluorescência ideal das partículas. Certifique-se de que as imagens BF e FL sejam tiradas na mesma posição (Figura 3). Certifique-se de que todas as membranas sejam analisadas usando a mesma ampliação e configurações do instrumento.
2. Para identificação de polímeros usando LDIR, execute as etapas do microscópio conforme abaixo:
   1. Configure o sistema de microscopia da seguinte forma: a câmera, filtros, ampliações e platina do microscópio e computador. Selecione o modo de filtro apropriado mais adequado para os comprimentos de onda de excitação e emissão desejados (por exemplo, 470 nm e 495 nm, respectivamente) dependendo da amostra e da fluorescência de fundo.
   2. Limpe os suportes da membrana do filtro com lenços de papel sem poeira, prenda a membrana no suporte e deslize para o microscópio stage. Escaneie toda a membrana visualmente para garantir uma distribuição uniforme das partículas.
   3. Certifique-se de que a câmera esteja conectada e que a ampliação do microscópio seja apropriada para todos os tipos de amostra e consistente em todas as amostras do mesmo conjunto. Determine o tamanho da área em mm capturada com a câmera antes de iniciar a análise usando uma fita métrica.
      NOTA: Se as partículas estiverem distribuídas uniformemente, analise um mínimo de 10% da área total da membrana selecionando o número necessário de pontos de amostragem na membrana. Tire uma foto de cada ponto de amostragem usando a câmera.

7. Identificação de polímeros de MPs usando espectroscopia FTIR ou LDIR

1. Se o FTIR for usado para identificar partículas de polímero, consulte as etapas abaixo.
   1. Ligue o espectrômetro FTIR e o software correspondente para observação e registro de amostras. Limpe a sonda antes de medir cada amostra.
   2. Identifique as partículas para monitoramento por meio de gravação de tela em tempo real. Ajuste a posição e a nitidez manipulando o balancim. Traga a plataforma operacional para o centro e capture o espectro de fundo do ar atual.
      NOTA: Partículas alvo que correspondem a imagens BF e FL.
   3. Meça 3-5 pontos fixos em cada partícula para obter espectros dentro da faixa de número de onda infravermelho de 400-4.000 ^cm-1. Na página de resultados, salve os dados originais, obtenha o espectro e compare-o com o espectro plástico na biblioteca padrão para confirmar o índice de qualidade de acerto da amostra (Figura 4).
      NOTA: Neste estudo, devido ao pequeno tamanho dos MPs e aos desafios em quantificá-los em todo o filtro, 5-7 partículas representativas foram selecionadas de cada amostra para análise FTIR. Para garantir uma distribuição uniforme, foram selecionadas partículas que seguem um padrão em "forma de Z" através do filtro. No entanto, deve-se notar que pode surgir alguma incerteza, pois as partículas foram selecionadas aleatoriamente em vez de escanear todo o filtro.
   4. Uma correspondência será aceita se o índice de qualidade do acerto (HQI) ≥ 0,7. A Figura 4 mostra um exemplo de partículas identificadas por espectroscopia FTIR em uma amostra de solo enriquecida com 0,04% de PE-MPs.
2. Se o LDIR for usado para identificação de partículas de polímero, siga as etapas abaixo:
   1. Depois que as etapas do microscópio fluorescente forem concluídas, ressuspenda as partículas para análise no LDIR. Coloque a membrana do filtro em um novo frasco de vidro e adicione 20 mL de etanol puro. Feche bem os frascos e envolva as tampas com filme de parafina para evitar vazamentos.
   2. Sonicar as amostras num banho ultra-sónico durante um mínimo de 1 h até que todas as partículas tenham sido ressuspensas. Remova e descarte a membrana do frasco de vidro.
      NOTA: Certifique-se de que o lado da membrana com as partículas está voltado para dentro, ou seja, longe da parede do frasco. O tempo de sonicação depende do tipo de membrana usado; A membrana pode lixiviar a cor, mas isso não interferirá na identificação do polímero.
   3. Confirme a ressuspensão de partículas bem-sucedida reanalisando as membranas sob o microscópio fluorescente e garantindo que a remoção de partículas seja > 95%.
   4. Coloque os frascos de vidro com a solução de etanol em uma placa de agitação magnética e adicione um pequeno agitador de vidro magnético ao frasco. Deixe o etanol evaporar para menos de 5 mL ajustando a temperatura da placa para 100 °C e mexendo em baixa velocidade para manter as partículas suspensas.
      NOTA: Cubra os frascos levemente com papel alumínio para minimizar a contaminação das amostras pelo ar. Opcionalmente, secar a solução sob uma corrente suave de azoto para evaporação do etanol.
   5. Transfira a amostra para um pequeno frasco de vidro de 8 mL, usando etanol novo para enxaguar o frasco de vidro de 20 mL para maximizar a recuperação de partículas.
      NOTA: Se necessário, adicione etanol novo ao pequeno frasco de vidro para atingir exatamente 5 mL.
   6. Para preparar a amostra para análise no LDIR, agitar bem a amostra até que todas as partículas estejam homogeneamente suspensas na solução e pipetar rapidamente 10 μL da amostra na lâmina e deixar o etanol evaporar. Repita esta etapa mais duas vezes para analisar 3 réplicas por amostra em cada lâmina.
   7. Use a ferramenta de análise de partículas no software associado para medir os espectros infravermelhos de cada partícula dentro da faixa de tamanho definida e compará-los com a biblioteca interna para identificação de polímeros.
      NOTA: Um ponto em cada partícula é medido automaticamente na faixa de número de onda infravermelho de 800-1800 ^cm-1, e as partículas são automaticamente comparadas com espectros de biblioteca conhecidos de polímeros e outros materiais orgânicos e inorgânicos.
   8. Se o índice de qualidade do acerto (HQI) ≥ 0,8, a correspondência será aceita. A Figura 5 mostra um exemplo de partículas identificadas por espectroscopia LDIR em uma amostra de solo enriquecida com 0,04% de PE-MPs.
      NOTA: O volume da amostra pode ser aumentado para amostras com baixo número de partículas.

8. Quantificação de partículas de imagens de membranas fluorescentes usando ImageJ

1. Abra o ImageJ³² (versão 1.54f) e carregue as imagens no software. Ajuste a escala da imagem para as medidas corretas correspondentes ao tamanho real da imagem. Use as funções Analisar > Definir escala para inserir valores de pixel e tamanho (mm) da imagem e selecione Global para aplicar essas configurações a todas as imagens durante a sessão.
2. Transforme a imagem em uma imagem binária e converta-a em 8 bits, usando as funções Processar > Binário e Imagem > Tipo > 8 bits, respectivamente. Para selecionar os parâmetros para análise de partículas, use as funções Analisar > Definir medidas e selecione os parâmetros desejados, por exemplo, Área, Descritores de forma e Diâmetro de Feret. Selecione Adicionar à sobreposição e determine o número de casas decimais para a saída de dados.
3. Para analisar partículas, selecione Analisar > Analisar partículas e determine o intervalo de tamanho de partícula de interesse. Defina Circularidade como 0-1, desmarque Unidades de pixel, ative a exibição de Sobreposição e selecione as seguintes caixas: Exibir resultados, Excluir bordas, Limpar resultados, Incluir furos, Resumir e Sobrepor. Exporte os resultados como arquivos .csv da janela de resultados.
   NOTA: A análise de imagens fluorescentes fornecerá apenas informações sobre o número de partículas, não o número de polímeros; portanto, um procedimento de identificação adicional é necessário, por exemplo, usando técnicas de espectroscopia IR.

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Resultados

Para validar as taxas de recuperação dessa metodologia, amostras de três diferentes matrizes sólidas (dióxido de silício (SD), argila bentonítica (BT) e solo) foram analisadas em conjuntos de três repetições. As amostras foram analisadas com e sem adição de microplástico de polietileno (PE) branco 0,04% p/p (faixa de tamanho de partícula de 40-48 μm). Amostras de solo foram coletadas no distrito de Haidian, Pequim, China (Campus Oeste da Universidade Agrícola da ...

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Discussão

A estratégia de amostragem de solos no terreno, incluindo abordagens como a amostragem aleatória simples ou a amostragem sistemática em grelha, bem como a área e a profundidade de amostragem, devem ser adaptadas às questões específicas de investigação e claramente definidas antes da colheita da amostra. Alguns estudos se concentraram na camada superficial do solo de 0-10 cm ^34,37, enquanto outros coletaram amostras de so...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-decimal balance	n/a	n/a	Standard 2-decimal balance
40 °C oven	n/a	n/a	Standard large fan-oven with temperature set to 40 °C
8700 LDIR	Agilent Technologies	n/a	LDIR used to identify particles
Aluminum container	n/a	n/a	Standard aluminum food take-away container
Aluminum foil	n/a	n/a	Standard heavy-duty aluminum foil
Axioplan 2	Zeiss	n/a	Fluorescence microscopy is used to observe microplastic particles in the fluorescent state
Bentonite clay	Sigma Aldrich	285234	Bentonite clay used for recovery tests
BX53	Olympus	n/a	Fluorescence microscopy is used to observe microplastic particles in the fluorescent state
Glass beaker (600 ml)	n/a	n/a	Standard glass beaker
Glass bottle (1 l)	n/a	n/a	Standard glass bottle
Glass magnetic stirrer bar	n/a	n/a	Standard glass coated magnetic stirrer bar
Glass measuring cylinder (500 ml)	n/a	n/a	Standard glass measuring cylinder
Glass pipette (10 ml)
Glass vacuum filtration device	Pyrex (purchased via Sigma Aldrich)	SLW5809/KIT	Glass filtration device with 500 ml funnel, porous plate, and 1 l collection beaker
LUMOS Alpha II	Bruker	n/a	FTIR used to analyze suspect microplastics.
Magnetic stirring plate	n/a	n/a	Standard magnetic stirring plate
MCE filter membrane	Jinteng company	JTMF0441/0442	White MCE membranes, 0.2 µm pore size, 50 mm diameter, with FTIR method
Nile Red	Fisher Scientific	10464311	Nile Red powder used to make stock solution of nile red dye using appropriate solvent (e.g. acetone)
PCTE filter membrane	Sterlitech Corporation	1270060	Black PCTE membranes, PVP-free, 0.2 µm pore size, 47 mm diameter, with LDIR method
Silicon dioxide	Sigma Aldrich	18649	Silicon dioxide used for recovery tests
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9888	Sodium chloride used for density separation
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	10675692	Sodium hydroxide used for organic matter digestion
Soil auger	n/a	n/a	Length 30 cm; diameter 2 cm; material stainless steel
Ultra-high molecular weight polyethylene microplastic powder	Sigma Aldrich	434272	Polyethylene microplastic used to spike silicon dioxide, bentonite clay, and soil samples for recovery tests
Vacuum pump	Vacuubrand GmBH Co KG	ME 2C NT	Vacuum pump for vacuum filtration