Separación e identificación de microplásticos convencionales de suelos agrícolas

Resumen

Aquí se presenta un método para extraer microplásticos del suelo e identificar sus tipos de polímeros. El método se ha optimizado para la ejecución, la aplicabilidad y la rentabilidad. Sienta las bases científicas para estandarizar el método analítico para identificar microplásticos en los suelos.

Resumen

La contaminación por microplásticos (MP) en el medio ambiente terrestre ha recibido cada vez más atención en la última década, con cada vez más estudios que describen el número y los tipos de MP en diferentes sistemas de suelo y sus impactos en la salud del suelo y los cultivos. Sin embargo, se utilizan diferentes métodos analíticos y de extracción de MP, lo que limita las oportunidades de comparar los resultados y generar pruebas fiables para el asesoramiento de la industria y los responsables de la formulación de políticas. Aquí, presentamos un protocolo que describe la metodología para el muestreo, la separación y la identificación química de los MP convencionales del suelo. El método es de bajo costo y los materiales están fácilmente disponibles. Esto mejora la facilidad operativa y puede ayudar a la adopción generalizada. El protocolo proporciona información detallada sobre la recolección de muestras de los 0 a los 30 cm superiores del suelo utilizando utensilios sin plástico; simulación de diferentes tipos de suelos mediante el uso de diversos medios sólidos (como arcilla de bentonita, dióxido de silicio y suelos no contaminados), con la adición de la misma masa de polietileno(PE)-MP para su posterior cuantificación; separación por densidad de partículas plásticas utilizando una solución saturada de cloruro de sodio (NaCl) y digestión de impurezas orgánicas en el sobrenadante utilizando una solución de hidróxido de sodio (NaOH) 4 M; cuantificación de partículas mediante microscopía fluorescente después de la tinción con rojo de Nilo; y la identificación de polímeros mediante espectroscopía infrarroja por microtransformada de Fourier (μ-FTIR) o espectroscopía de infrarrojo directo por láser (LDIR). La tasa de recuperación de MP osciló entre el 83% y el 90% para los medios antes mencionados. Este protocolo presenta un método eficiente para el análisis de MPs del suelo que está optimizado para la factibilidad, aplicabilidad y rentabilidad. Además, el video que acompaña puede guiar el proceso de análisis de los MP del suelo paso a paso de manera virtual. Este estudio se dedica a estandarizar los métodos para el análisis de MPs del suelo, mejorar la conectividad y la comparabilidad de las mediciones, y establecer una base para una investigación más estandarizada y científica.

Introducción

Se estima que entre 4,8 y 12,7 millones de toneladas métricas de plástico ingresan al océano anualmente desde fuentes terrestres ^1,2. Estas partículas de plástico se degradan gradualmente en fragmentos más pequeños en respuesta a la irradiación ultravioleta, la abrasión mecánica y la biodegradación ^3,4. La contaminación por microplásticos (MP), con partículas de plástico de menos de 5 mm de diámetro, en el suelo se está convirtiendo en una preocupación cada vez mayor, especialmente en términos de su efecto potencial en la salud del suelo y los cultivos. Está impulsado principalmente por el continuo aumento de la producción de plástico y los desafíos que rodean la eliminación adecuada de los residuos plásticos ^5,6.

La acumulación de MP en el suelo puede atribuirse a diversos factores externos. Las fuentes potenciales de MP en los suelos son complejas, incluyendo la utilización de prácticas de plasticultura (por ejemplo, películas de mantillo plástico, tuberías de riego, películas de invernadero e infraestructura asociada)^7,8,9 y el aporte de enmiendas orgánicas (como la aplicación de lodos de aguas residuales, compost agrícola y fertilizantes orgánicos)¹⁰. Además, la eliminación inadecuada de la basura plástica¹¹, la descomposición de los residuos de alimentos digeridos de los residuos de envases de plástico^{de alimentos 12}, la utilización de fertilizantes recubiertos¹³, el desgaste de los neumáticos de goma¹⁴ y la deposición atmosférica¹⁵ también son contribuyentes conocidos a los MP en los suelos. Se ha estimado que China, el principal productor y usuario de plásticos agrícolas, en particular películas de mantillo plástico, tiene una abundancia promedio de MP en tierras agrícolas agrícolas con mantillo muy plástico de aproximadamente 4231 artículos ^kg-1 (suelo seco)¹⁶. En 2018, las cantidades de MP en los suelos de las tierras agrícolas chinas dentro de la profundidad de 0-10 cm oscilaron entre 4,9 × 10⁶ y 1,0 × 10⁷ toneladas, con una contribución significativa de las películas de mantillo agrícola¹⁷. Las aplicaciones de lodos a los suelos agrícolas en Europa y América del Norte pueden aportar más de 63.000 y 44.000 toneladas de MP por año, respectivamente¹⁸. Un estudio realizado en Alemania demostró que las aplicaciones de compost en los campos de cultivo también provocaban un aporte anual de partículas de plástico (>1 mm) en los campos de cultivo. La aplicación de compost generó entre 35 mil millones y 2,2 billones de partículas de plástico¹⁰. La contribución de los MP atmosféricos a los suelos es aún incierta y requiere una mayor cuantificación¹⁵. Por ejemplo, se estima que el aporte promedio anual de MP atmosférico es de 7,9 × 10⁴ artículos ^{m-2 año-1} en China¹⁶. La amplia gama de fuentes de MP en el suelo ha atraído la atención de muchos investigadores, pero debido a la diversidad de métodos de muestreo, extracción y detección analítica, es difícil integrar y comparar los resultados de varios estudios.

La acumulación de MP procedentes de una amplia gama de fuentes supone una amenaza potencial para el medio ambiente de los suelos del mundo¹⁶, lo que pone de manifiesto la clara necesidad de realizar estudios sobre los MP en el suelo. Algunos estudios han demostrado que los efectos de los MP en el suelo agrícola incluyen la alteración de las propiedades del suelo, impidiendo el crecimiento y desarrollo de plantas y organismos del suelo, e impactando la actividad microbiana del suelo^19,20. Otros estudios han encontrado que los MP pueden acumularse en los organismos a niveles tróficos más altos a lo largo de la cadena alimentaria²¹, lo que conduce a un peligro potencial para la salud humana²². Para aclarar los efectos ambientales de los MP en el suelo, primero es necesario comprender el estado actual de su contaminación, incluida su abundancia, identificación de polímeros y características de distribución. Por lo tanto, la identificación y detección precisas de los MP del suelo son de suma importancia.

En la actualidad, un número creciente de artículos exploran la presencia global de MP en el suelo, observándose una variación considerable en los métodos de extracción y detección²³. Después de la recolección cuidadosa de muestras (para minimizar la contaminación por MPs), el protocolo para el análisis de MP generalmente implica tres pasos clave. En primer lugar, la separación por densidad se adopta ampliamente para aislar las partículas de MP de la matriz del suelo. Este proceso suele utilizar reactivos como agua destilada (DI) (1,0 g ^cm-3), cloruro de sodio (NaCl, 1,2 g ^cm-3) o cloruro de zinc (ZnCl₂, 1,6 g ^cm-3). En segundo lugar, los métodos para eliminar las impurezas orgánicas de la superficie de los MP incluyen la limpieza con soluciones ácidas y alcalinas u otros agentes oxidantes y la digestión enzimática²⁴. La digestión de la materia orgánica en la matriz del suelo o adherida a las partículas de MPs se lleva a cabo comúnmente utilizando peróxido de hidrógeno al 30% (_H2O2), ácido nítrico al 65% (_HNO3) o hidróxido de sodio (NaOH) al 50%²⁵. Después de la separación por densidad y la digestión de la materia orgánica, se requiere el examen microscópico de las muestras de MPs para determinar el número de partículas. Este examen se complementa con el análisis de la composición química de los polímeros a través de técnicas como la espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR), la espectroscopia Raman u otras técnicas de espectroscopia de infrarrojo cercano²⁶.

Sin embargo, cada paso en el proceso de extracción y detección de MP conlleva el potencial de sobreestimación o subestimación de la ocurrencia de MPs. Por ejemplo, a pesar del uso generalizado del agua desionizada como reactivo para la separación por densidad debido a su rentabilidad y a la falta de propiedades peligrosas, puede conducir a la exclusión de partículas MPs con mayor densidad²⁷. Por el contrario, la aplicación generalizada de reactivos de alta densidad puede verse limitada por los peligros ambientales y el aumento de los costos²⁸. Además, ciertos reactivos utilizados para la digestión orgánica tienen el potencial de causar daño a las partículas MPs²⁹. Además, la clasificación visual mediante microscopía óptica, estereoscópica y anatómica no está exenta de desafíos^26,30. La determinación de las partículas MP depende en gran medida de la experiencia y el funcionamiento de los analistas, así como de los ajustes del instrumento. Estos hallazgos enfatizan la dificultad de lograr consistencia y precisión cuando se emplean diversas metodologías, lo que complica la comparación de los resultados entre diferentes estudios.

Para garantizar la fiabilidad y la comparabilidad de los datos entre los estudios, es imperativo establecer un protocolo estandarizado para la extracción y detección de MP en el suelo. Esta estandarización no solo mejorará la precisión de las evaluaciones de ocurrencia de MPS, sino que también facilitará una comprensión más completa y unificada del impacto ambiental de los MP en los ecosistemas del suelo. Para hacer frente a las limitaciones de los métodos de extracción y detección, los reactivos seleccionados para los métodos estandarizados deben estar fácilmente disponibles, no deben afectar la integridad o la composición química de las partículas de MP y plantear el menor riesgo ambiental posible. Además, los métodos estandarizados deben demostrar una alta eficiencia tanto en la recuperación de MP como en la eliminación de materia orgánica de la matriz del suelo.

Un protocolo fácil de seguir es vital para la adopción generalizada en diferentes entornos de investigación. Teniendo en cuenta tanto las tasas de recuperación de MP como la rentabilidad, el NaCl saturado es la opción óptima para la separación de la densidad de muestras de suelo a gran escala. Para la digestión de la materia orgánica se utilizó NaOH, ya que los experimentos preliminares de aislamiento han demostrado que la solución de NaOH 4 M descompone eficazmente las impurezas de la muestra de suelo, como los residuos vegetales, sin causar daños significativos a los MP. En general, este método experimental utiliza materiales fácilmente disponibles y rentables, tiene una baja complejidad operativa y garantiza una tasa de extracción confiable.

Recomendamos utilizar la metodología de separación rápida y económica propuesta por la Academia China de Ciencias Agrícolas para determinar los MP recolectados en los campos agrícolas³¹. Para todos los pasos siguientes, asegúrese de que todos los recipientes, instrumentos y cristalería se limpien con agua desionizada antes de usar para minimizar la contaminación. Además, asegúrese de colocar blancos regulares junto a las muestras para tener en cuenta la contaminación introducida por los procedimientos de recolección y extracción.

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Protocolo

NOTA: Las siguientes soluciones deben prepararse a temperatura ambiente antes del proceso de extracción: 1) Solución saturada de NaCl (5,7 M): disuelva 1 kg de NaCl en 3 L DI_{H 2}O; 2) 4 M NaOH - disolver 480 g de NaOH en 3 L DI_{H 2}O; 3) Rojo del Nilo (100 μg ^mL-1): disuelva 10 mg de Rojo del Nilo en 100 mL de solvente apropiado (por ejemplo, metanol, acetona).

1. Toma de muestras y preparación del suelo

1. Recoja una muestra de suelo representativa utilizando un método de muestreo de cinco puntos en forma de "W" en toda el área de estudio (Figura 1). Utilice una barrena de suelo de acero inoxidable de 30 cm para el procedimiento de recolección. Recoja y almacene las muestras en un recipiente que no sea de plástico, como papel de aluminio.
   NOTA: Las muestras de suelo se pueden dividir en las diferentes profundidades deseadas (por ejemplo, 0-10, 10-20 y 20-30 cm). Para minimizar la contaminación plástica, evite el uso de equipos de muestreo de plástico y recipientes de almacenamiento. En su lugar, se utilizan recipientes que no son de plástico, como el papel de aluminio, para recoger y almacenar las muestras. Estas muestras pueden ser agrupadas para proporcionar una muestra compuesta o mantenidas como réplicas independientes.
2. Seque la tierra a temperatura ambiente, lejos de la luz solar directa.
   1. Si dispone de un secador de suelo, utilícelo para procesar varias muestras de suelo simultáneamente, ya que el filtro dentro de las cámaras individuales minimiza el riesgo de contaminación cruzada.
   2. De lo contrario, use un horno a 40 oC y seque la tierra durante un mínimo de 24 h, hasta que esté completamente seca.
   3. Muele y tamiza la tierra seca con un tamiz metálico de 2-5 mm. Retire el material vegetal visible, las piedras y otros materiales inertes.
      NOTA: Cubra sin apretar la tierra con papel de aluminio para minimizar la contaminación en el aire dentro del horno / secadora. Recoja los restos de plástico visibles (> 5 mm) del suelo con pinzas de metal y colóquelos en un recipiente de almacenamiento sin plástico, si se va a realizar un análisis posterior de macroplástico.
3. Con una escala de 2 decimales, pese 5,0 g ± 0,05 g de la muestra de suelo sobre un papel de pesaje sin plástico o papel de aluminio. Utilice un nuevo papel de pesaje para diferentes muestras a fin de minimizar la contaminación cruzada. Las muestras se pueden almacenar en recipientes sin plástico (por ejemplo, viales de vidrio).

2. Flotación por densidad

1. Transfiera la muestra de tierra seca de 5,0 g a un vaso de precipitados de vidrio limpio de 600 ml (vaso A). Garantice el etiquetado preciso de todos los recipientes de almacenamiento y vasos de precipitados.
2. Añada 230 ml de solución saturada de NaCl al vaso de precipitados A. Coloque el vaso de precipitados A sobre una placa de agitación magnética y añada un agitador magnético de vidrio. Agitar la solución durante 30 min a 260 rpm, hasta que esté completamente homogeneizada.
3. Una vez que esté completamente homogeneizado, retire el agitador magnético de la solución y enjuague con una solución de NaCl saturada para evitar que las partículas de plástico salgan de la solución. Coloque el vaso de precipitados sobre una superficie plana sin luz solar directa y déjelo reposar durante la noche, hasta que se haya producido una separación total de la densidad.
   NOTA: Al realizar todo el procedimiento, es necesario cubrir completamente con papel de aluminio para evitar contaminantes plásticos del aire.

3. Digestión de impurezas

1. Una vez que el contenido del vaso A se haya separado completamente, transfiera con cuidado el sobrenadante a un nuevo vaso de vidrio limpio de 600 ml (vaso B). Enjuague cuidadosamente las paredes internas del vaso de precipitados A con una solución saturada de NaCl. Transfiera el sobrenadante al vaso de precipitados B. Realice este procedimiento 2-3 veces.
   NOTA: Se recomienda un total de 200 mL de sobrenadante. Asegúrese de que el volumen total del sobrenadante sea constante mientras mantiene la misma concentración de solución de digestión en el siguiente paso.
2. Añadir 4 M de solución de NaOH a la muestra en el vaso de precipitados B hasta alcanzar un volumen fijo de 500 mL. Coloque el vaso de precipitados B en una placa de agitación magnética, añada un agitador magnético de vidrio y agite la solución durante 30 min a 260 rpm hasta que esté completamente homogeneizada. Mantenga el vaso de precipitados cubierto con papel de aluminio durante este proceso para minimizar la contaminación en el aire.
3. Una vez que esté completamente homogeneizado, retire el agitador magnético de la solución y enjuague con una solución de NaCl saturada para eliminar las partículas adheridas. Coloque el vaso de precipitados B sobre una superficie plana sin luz solar directa y déjelo reposar durante la noche hasta que se haya producido la separación total de la densidad y la digestión de la materia orgánica.
   NOTA: Al realizar todo el procedimiento, es necesario cubrir completamente con papel de aluminio para evitar que los contaminantes plásticos ingresen a la solución desde el aire. La duración de la digestión depende de la cantidad y el tipo de material orgánico. Prolongar el tiempo de digestión si es necesario para asegurar una digestión completa de la materia orgánica. Después de una digestión exitosa, el sobrenadante debe verse claro sin materia orgánica visible flotando en el vaso de precipitados.

4. Coloración con solución de rojo del Nilo

1. Una vez que el contenido del vaso B se haya separado completamente, transfiera con cuidado el sobrenadante a un nuevo vaso de vidrio limpio de 600 ml (vaso C). Enjuague las paredes internas del vaso de precipitados B con agua desionizada para garantizar la máxima transferencia de partículas.
   1. Si el volumen del vaso de precipitados C es inferior a 500 ml, compense el valor hasta 500 ml con agua desionizada para unificar el volumen de la solución.
2. Añadir la solución de rojo del Nilo al vaso de precipitados C hasta alcanzar una concentración máxima final de 0,5 M. Agitar la solución con una varilla de vidrio hasta homogeneizarla por completo, dejar incubar la solución durante 30 min en la oscuridad cubriendo el vaso de precipitados con papel de aluminio.

5. Filtración al vacío

1. Configure los dispositivos de filtración al vacío en el siguiente orden: embudo de vidrio, abrazadera de metal, base de filtración al vacío, vaso de recolección, manguera de conexión, trampa de humedad y bomba de vacío. Retire con cuidado una membrana nueva (tamaño de poro de 0,2 μm, 47 mm de diámetro) de su recipiente de almacenamiento con pinzas metálicas. Coloque la membrana del filtro en el centro y plana en la parte superior de la base de filtración al vacío.
   NOTA: Asegure una conexión segura alineando la base de filtración al vacío con el embudo de vidrio y sujetándola con una abrazadera de metal.
2. Active la filtración al vacío y vierta lentamente el líquido del vaso C en el embudo de vidrio. Enjuague el vaso de precipitados C varias veces con agua desionizada para maximizar la recuperación de partículas. Enjuague los lados del embudo de vidrio con agua desionizada después de la filtración de la muestra para garantizar una pérdida mínima de partículas.
   NOTA: Cubra el embudo de vidrio con papel de aluminio para minimizar la contaminación en el aire durante el proceso de filtración. Si la muestra tiene un número de partículas alto y la velocidad de filtración disminuye, se pueden usar varias membranas para la misma muestra. Esto asegurará una distribución uniforme de las partículas a través de la membrana y minimizará el riesgo de que las partículas se agreguen y se superpongan para su posterior cuantificación.
3. Una vez completada la filtración, recupere con cuidado la membrana del filtro de la placa porosa con pinzas y coloque cada membrana en una placa de Petri de vidrio individual. Deje que la membrana se seque por completo antes de cerrar la placa de Petri y envolverla en papel de aluminio. Guárdelo en un lugar seco y oscuro hasta su posterior análisis.

6. Cuantificación de partículas MPs por microscopía de fluorescencia

1. Si se requiere la ubicación exacta de las partículas fluorescentes en la membrana para la identificación posterior del polímero (por ejemplo, mediante el uso de FTIR), consulte los pasos a continuación:
   1. Use un bolígrafo de gel negro para marcar suavemente la posición inicial y 10 marcas en la membrana del filtro, siguiendo la forma de la "Z" (Figura 2). Coloque la membrana con cuidado sobre los portaobjetos de vidrio en la platina del microscopio con pinzas, asegurando una superficie de muestra plana.
   2. Active el instrumento de fluorescencia en el siguiente orden: el huésped, las fuentes fluorescentes, el monitor y el microscopio de fluorescencia. Encienda el instrumento y ajuste la perilla de luz de la fuente al brillo máximo. Utilice los botones de interruptor de campo claro (BF) y luz fluorescente (FL) para tomar imágenes BF y FL, respectivamente.
   3. Utilizando el software para la observación y el registro de muestras (por ejemplo, DP2-BSW), tome fotografías de campo claro en la posición BF. Gire la perilla a la posición FL y tome fotografías con el filtro de fluorescencia en la oscuridad. Asegúrese de que la secuencia de observación del campo de visión vaya de 1 a 10. Asegúrese de que las imágenes FL y BL estén tomadas en la misma posición.
      NOTA: El análisis microscópico fluorescente debe realizarse dentro de las 24-48 horas posteriores a la filtración para garantizar una fluorescencia óptima de las partículas. Asegúrese de que las imágenes BF y FL se tomen en la misma posición (Figura 3). Asegúrese de que todas las membranas se analicen con la misma ampliación y configuración del instrumento.
2. Para la identificación de polímeros mediante el uso de LDIR, realice los pasos del microscopio como se indica a continuación:
   1. Configure el sistema de microscopía de la siguiente manera: la cámara, los filtros, los aumentos y la etapa del microscopio, y la computadora. Seleccione el modo de filtro apropiado que mejor se adapte a las longitudes de onda de excitación y emisión deseadas (por ejemplo, 470 nm y 495 nm, respectivamente) en función de la fluorescencia de la muestra y del fondo.
   2. Limpie los soportes de la membrana del filtro con pañuelos sin polvo, luego asegure la membrana en el soporte y deslícela sobre la platina del microscopio. Escanee visualmente toda la membrana para garantizar una distribución uniforme de las partículas.
   3. Asegúrese de que la cámara esté conectada y de que el aumento del microscopio sea adecuado para todos los tipos de muestras y coherente en todas las muestras del mismo conjunto. Determine el tamaño del área en mm capturada con la cámara antes de comenzar el análisis utilizando una cinta métrica.
      NOTA: Si las partículas se distribuyen uniformemente, analice un mínimo del 10% del área total de la membrana seleccionando el número requerido de puntos de muestreo en la membrana. Tome una fotografía de cada punto de muestreo con la cámara.

7. Identificación de polímeros MPs mediante espectroscopía FTIR o LDIR

1. Si se utiliza FTIR para identificar partículas de polímero, consulte los pasos a continuación.
   1. Encienda el espectrómetro FTIR y el software correspondiente para la observación y el registro de muestras. Limpie la sonda antes de medir cada muestra.
   2. Identifique las partículas para monitorear a través de la grabación de pantalla en tiempo real. Ajuste la posición y la nitidez manipulando el balancín. Lleve la plataforma operativa al centro y capture el espectro de fondo del aire actual.
      NOTA: Partículas objetivo que corresponden a imágenes BF y FL.
   3. Mida de 3 a 5 puntos fijos en cada partícula para obtener espectros dentro del rango de número de onda infrarrojo de 400 a 4.000 ^cm-1. En la página de resultados, guarde los datos originales, obtenga el espectro y compárelo con el espectro de plástico de la biblioteca estándar para confirmar el índice de calidad de aciertos de la muestra (Figura 4).
      NOTA: En este estudio, debido al pequeño tamaño de los MP y a los desafíos para cuantificarlos en todo el filtro, se seleccionaron de 5 a 7 partículas representativas de cada muestra para el análisis FTIR. Para garantizar una distribución uniforme, se seleccionaron partículas que seguían un patrón en forma de "Z" a través del filtro. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que puede surgir cierta incertidumbre, ya que las partículas se seleccionaron al azar en lugar de escanear todo el filtro.
   4. Se acepta una coincidencia si el índice de calidad de visitas (HQI) ≥ 0,7. La Figura 4 muestra un ejemplo de partículas identificadas por espectroscopia FTIR en una muestra de suelo enriquecida con 0,04% de PE-MPs.
2. Si se utiliza LDIR para la identificación de partículas de polímero, siga los pasos que se indican a continuación:
   1. Una vez completados los pasos del microscopio fluorescente, vuelva a suspender las partículas para su análisis en el LDIR. Coloque la membrana del filtro en un nuevo vial de vidrio y agregue 20 ml de etanol puro. Cierre bien los viales y envuelva las tapas con una película de parafina para evitar fugas.
   2. Sonicar muestras en un baño ultrasónico durante un mínimo de 1 h hasta que todas las partículas se hayan resuspendido. Retire y deseche la membrana del vial de vidrio.
      NOTA: Asegúrese de que el lado de la membrana con partículas mire hacia adentro, es decir, lejos de la pared del vial. El tiempo de sonicación depende del tipo de membrana utilizada; La membrana puede lixiviar el color, pero esto no interferirá con la identificación del polímero.
   3. Confirme el éxito de la resuspensión de partículas volviendo a analizar las membranas bajo el microscopio fluorescente y asegurándose de que la eliminación de partículas esté > del 95%.
   4. Coloque los viales de vidrio con la solución de etanol en una placa de agitación magnética y agregue un pequeño agitador de vidrio magnético al vial. Deje que el etanol se evapore a menos de 5 mL ajustando la temperatura de la placa a 100 °C y agitando a baja velocidad para mantener las partículas en suspensión.
      NOTA: Cubra los viales ligeramente con papel de aluminio para minimizar la contaminación de las muestras en el aire. Opcionalmente, seque la solución bajo un flujo suave de nitrógeno para la evaporación del etanol.
   5. Transfiera la muestra a un pequeño vial de vidrio de 8 mL, usando etanol nuevo para enjuagar el frasco de vidrio de 20 mL para maximizar la recuperación de partículas.
      NOTA: Si es necesario, agregue etanol nuevo al frasco de vidrio pequeño para alcanzar exactamente 5 mL.
   6. Para preparar la muestra para el análisis en el LDIR, agite bien la muestra hasta que todas las partículas estén suspendidas homogéneamente en la solución y pipetee rápidamente 10 μL de la muestra en el portaobjetos y deje que el etanol se evapore. Repita este paso dos veces más para analizar 3 réplicas por muestra en cada portaobjetos.
   7. Utilice la herramienta de análisis de partículas en el software asociado para medir los espectros infrarrojos de cada partícula dentro del rango de tamaño establecido y compararlos con la biblioteca interna para la identificación de polímeros.
      NOTA: Un punto de cada partícula se mide automáticamente en el rango de número de onda infrarrojo de 800-1800 ^cm-1, y las partículas se comparan automáticamente con los espectros de biblioteca conocidos de polímeros y otros materiales orgánicos e inorgánicos.
   8. Si el índice de calidad de visita (HQI) ≥ 0,8, se acepta la coincidencia. La Figura 5 muestra un ejemplo de partículas identificadas por espectroscopia LDIR en una muestra de suelo enriquecida con 0,04% de PE-MPs.
      NOTA: El volumen de la muestra se puede aumentar para muestras con números de partículas bajos.

8. Cuantificación de partículas de imágenes de membranas fluorescentes utilizando ImageJ

1. Abra ImageJ³² (versión 1.54f) y cargue las imágenes en el software. Ajuste la escala de la imagen a las medidas correctas correspondientes al tamaño real de la imagen. Utilice las funciones Analizar > Establecer escala para introducir los valores de píxeles y tamaño (mm) de la imagen y, a continuación, seleccione Global para aplicar estos ajustes a todas las imágenes durante la sesión.
2. Transforme la imagen en una imagen binaria y conviértala en 8 bits, utilizando las funciones Procesar > binario e Imagen > Tipo > 8 bits, respectivamente. Para seleccionar los parámetros para el análisis de partículas, utilice las funciones Analizar > Establecer mediciones y seleccione los parámetros deseados, por ejemplo, Área, Descriptores de forma y Diámetro de Feret. Seleccione Agregar a la superposición y determine el número de decimales para la salida de datos.
3. Para analizar partículas, seleccione Analizar > Analizar partículas y determine el rango de tamaño de partícula de interés. Establezca Circularidad en 0-1, anule la selección de Unidades de píxel, habilite Superposición para que se muestre y seleccione las siguientes casillas: Mostrar resultados, Excluir bordes, Borrar resultados, Incluir agujeros, Resumir y Superponer. Exporte los resultados como archivos .csv desde la ventana de resultados.
   NOTA: El análisis de imágenes fluorescentes solo proporcionará información sobre el número de partículas, no sobre el número de polímero; por lo tanto, se requiere un procedimiento de identificación adicional, por ejemplo, utilizando técnicas de espectroscopia IR.

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Resultados

Para validar las tasas de recuperación de esta metodología, se analizaron muestras de tres matrices sólidas diferentes (dióxido de silicio (SD), arcilla bentonita (BT) y suelo) en conjuntos de tres repeticiones. Las muestras se analizaron con y sin la adición de microplástico de polietileno (PE) blanco al 0,04% p/p (rango de tamaño de partícula 40-48 μm). Se recogieron muestras de suelo en el distrito de Haidian, Pekín, China (Campus Oeste de la Universidad Agrícola d...

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Discusión

La estrategia de muestreo del suelo en el campo, incluidos enfoques como el muestreo aleatorio simple o el muestreo sistemático en cuadrícula, así como el área y la profundidad del muestreo, deben adaptarse a las preguntas de investigación específicas y definirse claramente antes de la recolección de la muestra. Algunos estudios se han centrado en la capa superficial del suelo de 0-10 cm^34,37, mientras que otros recogieron...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-decimal balance	n/a	n/a	Standard 2-decimal balance
40 °C oven	n/a	n/a	Standard large fan-oven with temperature set to 40 °C
8700 LDIR	Agilent Technologies	n/a	LDIR used to identify particles
Aluminum container	n/a	n/a	Standard aluminum food take-away container
Aluminum foil	n/a	n/a	Standard heavy-duty aluminum foil
Axioplan 2	Zeiss	n/a	Fluorescence microscopy is used to observe microplastic particles in the fluorescent state
Bentonite clay	Sigma Aldrich	285234	Bentonite clay used for recovery tests
BX53	Olympus	n/a	Fluorescence microscopy is used to observe microplastic particles in the fluorescent state
Glass beaker (600 ml)	n/a	n/a	Standard glass beaker
Glass bottle (1 l)	n/a	n/a	Standard glass bottle
Glass magnetic stirrer bar	n/a	n/a	Standard glass coated magnetic stirrer bar
Glass measuring cylinder (500 ml)	n/a	n/a	Standard glass measuring cylinder
Glass pipette (10 ml)
Glass vacuum filtration device	Pyrex (purchased via Sigma Aldrich)	SLW5809/KIT	Glass filtration device with 500 ml funnel, porous plate, and 1 l collection beaker
LUMOS Alpha II	Bruker	n/a	FTIR used to analyze suspect microplastics.
Magnetic stirring plate	n/a	n/a	Standard magnetic stirring plate
MCE filter membrane	Jinteng company	JTMF0441/0442	White MCE membranes, 0.2 µm pore size, 50 mm diameter, with FTIR method
Nile Red	Fisher Scientific	10464311	Nile Red powder used to make stock solution of nile red dye using appropriate solvent (e.g. acetone)
PCTE filter membrane	Sterlitech Corporation	1270060	Black PCTE membranes, PVP-free, 0.2 µm pore size, 47 mm diameter, with LDIR method
Silicon dioxide	Sigma Aldrich	18649	Silicon dioxide used for recovery tests
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9888	Sodium chloride used for density separation
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	10675692	Sodium hydroxide used for organic matter digestion
Soil auger	n/a	n/a	Length 30 cm; diameter 2 cm; material stainless steel
Ultra-high molecular weight polyethylene microplastic powder	Sigma Aldrich	434272	Polyethylene microplastic used to spike silicon dioxide, bentonite clay, and soil samples for recovery tests
Vacuum pump	Vacuubrand GmBH Co KG	ME 2C NT	Vacuum pump for vacuum filtration