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Method Article
* 这些作者具有相同的贡献
在这里,我们提出了一种使用 ADCC 生物测定试剂盒进行抗体依赖性、细胞介导的细胞毒性 (ADCC) 测定的方案。该方法为阐明 ADCC 机制和评估抗体在癌症免疫治疗中的治疗潜力提供了有价值的工具。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC) 方法代表了评估治疗性抗体在癌症免疫治疗中疗效的重要工具。评估癌细胞中的 ADCC 活性对于开发和优化基于抗体的治疗方法至关重要。在这里,我们提出了一种利用 ADCC 生物测定试剂盒使用甲状腺癌细胞作为效应细胞定量评估 ADCC 反应的方法。该方案涉及在治疗性抗体存在下以不同比例将效应细胞与靶癌细胞共培养。本实验中使用的 ADCC 生物测定试剂盒包括在活化 T 细胞核因子 (NFAT) 反应元件控制下表达荧光素酶报告基因的基因工程效应细胞。当靶细胞上的表面抗原与抗体和效应细胞结合后,效应细胞释放荧光素酶,从而能够通过测量发光信号来定量细胞毒性。与传统的 ADCC 检测相比,该方法证明了靶抗原与抗体和效应细胞的结合,可以在短时间内产生可靠的结果。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC) 是抗体发挥免疫介导的细胞杀伤作用的重要机制 1,2,3。免疫细胞通过与治疗性抗体结合而被激活,治疗性抗体与靶细胞的表面抗原相互作用,释放出颗粒酶、穿孔素,导致靶细胞死亡。这些免疫细胞包括自然杀伤 (NK) 细胞和中性粒细胞 2,3,4,5,6,7。ADCC 测定已成为评估治疗性抗体疗效的重要工具 8,9。
在传统的 ADCC 测定中,外周血单核细胞 (PBMC) 或自然杀伤细胞用作效应细胞,通过定量靶标的细胞死亡率来监测治疗性抗体的疗效。我们的方法使用 ADCC 生物测定试剂盒,该试剂盒包括在活化 T 细胞核因子 (NFAT) 反应元件控制下表达荧光素酶报告基因的基因工程效应细胞。然后,我们量化靶细胞上的表面抗原与抗体和效应细胞的结合。该方法基于短时间内发生的 ADCC 反应,无需人 PBMC 细胞。实验步骤包括在治疗性抗体存在下效应细胞与靶细胞共培养。
在孵育过程中,治疗性抗体与靶细胞表面的靶抗原结合,从而导致效应细胞与抗体的 Fc 片段结合。这会激活 NFAT 响应元件并释放发光信号,用于定量评估 ADCC 反应。
在进行实验之前,必须通过流式细胞术或蛋白质印迹法确认靶抗原在靶细胞中的表达。在实验前培养靶细胞并传代到96孔板中24小时。将不同浓度的治疗性抗体与不同细胞计数的效应细胞相加,以达到计算出的效应细胞与靶细胞比率。
该方法的关键步骤包括 (1) 制备靶细胞和效应细胞,(2) 效应细胞与靶细胞的比例,(3) 制备不同浓度的抗体,以及 (4) 不同的孵育持续时间。孵育后,使用发光计测量发光信号,提供 ADCC 活性的定量读数。与其他测量 ADCC 的方法相比,这种方法作相对简单,结果准确。
ADCC 报告基因生物测定表明靶抗原、治疗性抗体和免疫细胞在 ADCC 通路激活中的结合。这种结合通过效应细胞工程 Jurkat 细胞中的 NFAT 通路激活基因转录,该细胞具有稳定表达的 FcγRIIIa 受体,即 V158(高亲和力)变体。NFAT 反应元件介导效应细胞中荧光素酶的表达10,11。抗体在 ADCC 作用机制 (MOA) 中的生物活性通过 NFAT 通路产生的荧光素酶信号进行量化。使用发光读取器定量效应细胞 - 表达FcγRIIIa受体的Jurket细胞 - 中的荧光素酶信号(图1)。该测定的信噪比很高。
1. 检测靶细胞中的 EGFR 和 VEGFR 表达
注:使用 western blotting 检测靶细胞中靶抗原的表达。
2. 靶细胞的制备
3. 制备不同浓度的治疗性抗体
4. 效应细胞的制备
5. 效应细胞与抗体和靶细胞的孵育
6. ADCC 活性的定量读数
使用 western blotting 检测靶 BHT-101 和 SW-1736 细胞中 EGFR 和 VEGFR 的表达。在 BHT-101 和 SW-1736 细胞中均检测到 EGFR 表达,但未检测到 VEGFR 表达(图 3)。
使用 ADCC 生物测定试剂盒,我们以 EGFR 阳性细胞系 BHT-101 和 SW-1736 作为靶细胞检测抗 EGFR 抗体西妥昔单抗的 ADCC 反应。贝伐珠单抗是一种 VEGF 灭活剂,用作阴性对照抗体。将不同浓度...
在这里,我们提出了用于评估治疗性抗体的 ADCC 反应的 ADCC 生物测定方法。该方法简单明了,采用简单的 "add-mix-read" 格式进行测量。
在进行实验之前,必须通过流式细胞术或 western blotting 确认靶抗原在靶细胞中的表达。流式细胞术将是检测表面抗原的更好工具。然而,使用流式细胞术会给细胞带来压力,导致细胞凋亡并影响细胞活力,从而影响整?...
所有作者均声明无利益冲突。
我们感谢 Zeng 教授 (IMCB, A*STAR) 对这项工作的支持。本研究得到了国家自然科学基金 (NSFC) 青年基金 (82202231) 和浙江省医疗健康科技项目 (2021KY110,2024KY824) 的支持。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Dilute 10x in PBS to make 0.05% Trypsin |
1x Tris Buffer Saline (TBS) | 1st BASE | BUF-3030-1X1L | For membrane washing in western blotting |
1.5 M Tris Buffer, pH 8.8 | 1st BASE | BUF-1419-1L-pH8.8 | For SDS gel preparation |
2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M7522-100ML | For sample preparation of western blotting |
30% Acrylamide/Bis solution | Bio-Rad | #1610158 | For SDS gel preparation |
4x Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610747 | For sample preparation of western blotting |
96-well white polystyrene microplate with clear flat bottom | Corning Incorporated | 3610 | For ADCC assay |
ADCC Bioassay Effector cells (0.65 mL) | Promega | G7011 | Includes in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 1 vial |
ADCC reporter bioassay core kit | Promega | G7010 | Mentioned as ADCC bioassay kit for ADCC assay in this experiment |
Ammonium Persulfate | Sigma Aldrich | A3678-25G | For SDS gel preparation |
Bevacizumab (Humanized Anti VEGF-antibody) | MVASI | - | Use as negative control antibody in ADCC asssay |
BHT-101 | Leibniz Institute DSMZ | ACC279 | Human anaplastic papillary thyroid cancer cell line |
Bio-Glo Luciferase Assay Buffer | Promega | G7941 | Includes in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 10 mL |
Bio-Glo Luciferase Assay Substrate (Lyophilized) | Promega | G7941 | Includes in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 1 vial |
Cell scraper | GenFollower | GD00235 | To remove cell from culture flask |
Cetuximab (Chimeric anti-EGFR antibody) | ERBITUX | - | Use as therapeutic antibody in ADCC assay |
Chemiluminescent HRP substrate | Merck Millipore | WBKLS0500 | For protein detection in western blotting |
Distilled water | Gibco | 15230-162 | For SDS gel preparation |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | Culture media supplement |
iBright CL1500 imaging system | Thermo Scientific | 2462621100038 | For protein detection in western blotting |
L-glutamine, 200 mM | Gibco | 25030-081 | Culture media supplement |
Low IgG Serum | Promega | G7110 | Includes in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 4 mL |
Megafuge 8R | Thermo Scientific | 42876589 | Centrifuge |
Mouse anti-EGFR monoclonal antibodies | BD Biosciences | 610016 | Primary antibody in western blotting |
Mouse anti-VEGFR monoclonal antibodies | BD Biosciences | 571194 | Primary antibody in western blotting |
non-enzymatic cell dissociation buffer | Sigma Aldrich | C5789-100ML | For cell harvesting from T75 flask |
Penicillin-Streptomycin | PAN Biotech | P06-07100 | Antibacterial for culture media |
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.2, Sterile filtered | 1st BASE | CUS-2048-1x1L | Use as washing solution for cells |
Pierce BCA assay kit | Thermo Scientific | 23225 | To measure protein concentration |
Protease and phosphatase inhibitor | Thermo Scientific | A32959 | For protein digestion in sample preparation for western blotting |
PVDF membrane (Immobilin-P) | Merck Millipore | IPVH00010 | For protein transfer in western blotting |
Rabbit anti-mouse IgG, Fcγ HRP-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 315-035-046 | Secondary antibody in western blotting |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium | Capricorn Scientific | RPMI-XA | Cell culture media |
RPMI-1640 | Promega | G7080 | Includes in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 36 mL |
Skim milk powder | Merck Millipore | 70166-500G | For membrane blocking in western blotting |
Sodium Dodecyl Sulfate | 1st BASE | BIO-2050-500g | For SDS gel preparation |
SW-1736 | Cytion | 300453 | Human thyroid squamous cell cancer cell line |
T75 culture flasks | SPL Lifesciences | 70075 | Cell culture flask |
Tecan Multimode Reader model Spark 10M | Tecan | 1607000294 | for luminicence quantification |
TEMED | Bio-Rad | #1610801 | For SDS gel preparation |
Tween-20 | Promega | H5151 | For membrane washing in western blotting |
Vi-cell XR cell viability analyzer | Beckman Coulter | AL15072 | Cell counter |
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