Evaluación de la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos en células cancerosas mediante el bioensayo reportero de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de citotoxicidad mediada por células (ADCC) dependiente de anticuerpos utilizando un kit de bioensayo ADCC. Este método ofrece una valiosa herramienta para dilucidar el mecanismo ADCC y evaluar el potencial terapéutico de los anticuerpos en la inmunoterapia contra el cáncer.

Resumen

El método para la citotoxicidad mediada por células (ADCC, por sus siglas en inglés) dependiente de anticuerpos representa una herramienta importante para evaluar la eficacia de los anticuerpos terapéuticos en la inmunoterapia contra el cáncer. La evaluación de la actividad de ADCC en las células cancerosas es esencial para el desarrollo y la optimización de tratamientos basados en anticuerpos. Aquí, proponemos un enfoque metodológico de utilizar un kit de bioensayo ADCC para la evaluación cuantitativa de la reacción ADCC utilizando células de cáncer de tiroides como células efectoras. El protocolo consiste en el cocultivo de células efectoras con células cancerosas diana en diferentes proporciones en presencia de un anticuerpo terapéutico. El kit de bioensayo ADCC utilizado en este experimento incluye las células efectoras modificadas genéticamente que expresan un gen reportero de luciferasa bajo el control de los elementos de respuesta del factor nuclear de células T activadas (NFAT). Tras la unión del antígeno de superficie en las células diana con los anticuerpos y las células efectoras, las células efectoras liberan luciferasa, lo que permite la cuantificación de la citotoxicidad mediante la medición de la señal de luminiscencia. A diferencia de los ensayos ADCC convencionales, este método demostró la unión del antígeno diana con anticuerpos y células efectoras, lo que puede producir resultados fiables en un corto período de tiempo.

Introducción

La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) es un mecanismo importante por el cual los anticuerpos ejercen^{efectos de} destrucción celular inmunomediados ^1,2,3. Las células inmunitarias se activan uniéndose al anticuerpo terapéutico, que interactúa con los antígenos de superficie de las células diana para liberar granzimas, perforina, lo que provoca la muerte de la célula diana. Estas células inmunitarias incluyen las células asesinas naturales (NK) y los neutrófilos 2,3,4,5,6,7. El ensayo ADCC se ha convertido en una herramienta importante para evaluar la eficacia de los anticuerpos terapéuticos ^8,9.

En el ensayo ADCC convencional, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o las células asesinas naturales se utilizan como células efectoras para controlar la eficacia de un anticuerpo terapéutico mediante la cuantificación de la tasa de mortalidad celular del objetivo. Nuestro método utiliza un kit de bioensayo ADCC que incluye células efectoras modificadas genéticamente que expresan un gen reportero de luciferasa bajo el control de elementos de respuesta del factor nuclear de células T activadas (NFAT). A continuación, cuantificamos la unión del antígeno de superficie en las células diana con el anticuerpo y las células efectoras. Este método se basa en la reacción ADCC que ocurre en un corto período sin necesidad de células PBMC humanas. Los pasos experimentales incluyen el cocultivo de células efectoras con células diana en presencia de anticuerpos terapéuticos.

Durante la incubación, el anticuerpo terapéutico se une al antígeno diana en la superficie de las células diana, lo que conduce a la unión de las células efectoras y el fragmento Fc de un anticuerpo. Esto activa el elemento de respuesta NFAT y libera señales de luminiscencia para la evaluación cuantitativa de la reacción ADCC.

Antes de realizar el experimento, la expresión del antígeno diana en las células diana debe confirmarse mediante citometría de flujo o Western blot. Las células objetivo se cultivan y se introducen en placas de 96 pocillos durante 24 horas antes del experimento. Se suman diferentes concentraciones de un anticuerpo terapéutico junto con diferentes recuentos celulares de células efectoras para lograr la proporción calculada de células efectoras a células objetivo.

Los pasos clave de este método incluyen (1) la preparación de las células diana y las células efectoras, (2) la proporción de células efectoras a dianas, (3) la preparación de diferentes concentraciones del anticuerpo y (4) la duración variable de la incubación. Después de la incubación, las señales de luminiscencia se miden con un luminómetro, proporcionando una lectura cuantitativa de la actividad de ADCC. En comparación con otros métodos para medir ADCC, este método es relativamente simple de operar y los resultados son precisos.

El bioensayo indicador de ADCC indica la unión del antígeno diana, el anticuerpo terapéutico y las células inmunitarias en la activación de la vía ADCC. Esta unión activa la transcripción génica a través de la vía NFAT en las células Jurkat modificadas con células efectoras con un receptor FcγRIIIa que expresa de manera estable, la variante V158 (alta afinidad). El elemento de respuesta NFAT media la expresión de luciferasa en las células efectoras ^10,11. La actividad biológica del anticuerpo en el Mecanismo de Acción (MOA) de ADCC se cuantifica a través de la señal de luciferasa producida a partir de la vía NFAT. La señal de luciferasa en las células efectoras (células Jurket que expresan el receptor FcγRIIIa) se cuantifica utilizando un lector de luminiscencia (Figura 1). La relación señal-ruido del ensayo es alta.

Protocolo

1. Detección de la expresión de EGFR y VEGFR en células diana

NOTA: Utilice la Western blot para detectar la expresión del antígeno diana en las células diana.

1. Preparación de la muestra
   1. Cultivo de las células (líneas celulares de cáncer de tiroides humano BHT-101 y SW-1736) en frascos T75 utilizando medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% L-glutamina y 1% de antibióticos (penicilina-estreptomicina).
   2. Coseche las células cuando estén confluentes en un 80% retirando los medios de cultivo y lavando las células con PBS. Agregue 5 mL de PBS y raspe las células con un raspador de células para eliminar las células del matraz de cultivo. Transfiera las células a un tubo cónico de 15 ml.
   3. Cuente las celdas con un contador de celdas.
   4. Alícuotas 5 × 10⁶ de las células BHT-101 y SW-1736 en tubos cónicos de 15 mL.
   5. Centrifugar las celdas a 135 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante PBS.
   6. Lisear el pellet celular añadiendo 100 μL de tampón de lisis RIPA que contiene inhibidores de la proteasa-fosfatasa durante 5 min en hielo. Transfiera el lisado a un tubo de 2 mL, centrifugue a 15.000 × g durante 15 mL y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 2 mL.
   7. Mida la concentración de proteínas del lisado celular mediante el uso de un kit de ensayo de ácido bicinconínico (BCA).
   8. Alícuota 70 μg de proteína de lisado celular de cada muestra, añadir 2 veces tampón de muestra Laemmli suplementado con 2-mercaptoetanol al 10% y hervir las muestras a 100 °C durante 5 min para la desnaturalización de las muestras.
2. Electroforesis en gel y transferencia de membrana
   1. Prepare el gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 8% con agua destilada (4,7 mL), acrilamida al 30% (2,7 mL), tampón Tris 1,5 M, pH 8,8 (2,5 mL), dodecil sulfato de sodio al 10% (0,1 mL), persulfato de amonio al 10% (100 μL) y TEMED (10 μL).
   2. Ejecute 70 μg de las muestras desnaturalizadas en el gel de poliacrilamida SDS al 8% a 80 V durante 20 min y a 120 V durante 100 min.
   3. Transfiera la proteína del gel a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) a 100 V durante 90 min.
   4. Después de la transferencia, bloquee la membrana con leche desnatada al 7% diluida en tampón TBS-T (20 mM Tris pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,2% Tween-20) durante 1 h.
3. Incubación de anticuerpos
   1. Incubar la membrana bloqueada con anticuerpos monoclonales anti-receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y anti-receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) de conejo (diluidos a 1:1.000 en leche desnatada al 7%) durante la noche a 4 °C.
   2. Después de la incubación, lave bien la membrana con tampón Tween de solución salina (TBS-T) (20 mM de Tris pH 7,6, 140 mM de NaCl, 0,2% de Tween-20) durante 7 min y repita 4 veces.
   3. Incubar la membrana con el anticuerpo secundario conjugado con HRP (diluido a 1:4.000 en leche desnatada al 7% (TBS-T)) durante 1 h.
   4. Después de la incubación, lave bien la membrana con tampón TBS-T durante 7 minutos y repita 4 veces.
4. Detección de proteínas
   1. Incubar la membrana en un sustrato HRP quimioluminiscente preparado mezclando 1 mL de solución de peróxido de sustrato HRP con 1 mL de reactivo Luminol de sustrato HRP (ambos reactivos son del kit de sustrato quimioluminiscente) durante 2 min.
   2. Visualice la membrana mediante un sistema de imágenes.

2. Preparación de las células diana

1. Cultivo exponencial de las células T diana, BHT-101 y SW-1736 hasta que confluenten al 80% en medios RPMI suplementados con 10% de FBS, 1% de L-glutamina y 1% de antibióticos (penicilina-estreptomicina) en matraces T-75.
2. Después de retirar el medio, lave las celdas una vez con PBS. Incubar las células con 1 ml de tampón de disociación celular no enzimática durante 5 min para desalojar las células adherentes. Agregue PBS para detener la reacción del tampón de disociación celular no enzimática. Gire las células a 135 × g durante 5 minutos y agregue 5 ml de PBS.
   NOTA: Aquí, utilizamos un tampón de disociación celular no enzimática para preservar la integridad de la proteína de la superficie de la membrana.
3. Cuente las células y siembrójelas en 15,000 celdas/pocillos en microplacas de poliestireno blanco de 96 pocillos con un fondo transparente y plano.

3. Preparación de concentraciones variables del anticuerpo terapéutico

1. Para seguir este protocolo, use Cetuximab (anticuerpo quimérico anti-EGFR) para unirse al EGFR y use Bevacizumab (anticuerpo anti VEGF-A humanizado) como control negativo.
2. Prepare el tampón de bioensayo ADCC agregando 1,4 mL de suero de IgG baja en 33,6 mL de RPMI-1640 (suministrado en el kit).
3. Utilice el tampón de bioensayo ADCC para la dilución de anticuerpos. Prepare 400 μL de cada anticuerpo en tres concentraciones diferentes: 30 μg/mL, 3 μg/mL y 0,3 μg/mL (concentración 3x) para obtener la concentración final de 10 μg/mL, 1 μg/mL y 0,1 μg/mL para una cobertura de amplio espectro para detectar la dosis óptima.
   NOTA: Las concentraciones finales de anticuerpos se basan en 25 μL de células diana cultivadas, 25 μL de células efectoras y 25 μL de anticuerpo en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.

4. Preparación de las células efectoras

1. Almacene las pilas efectoras a -80 °C antes de usarlas.
2. Precaliente el tampón de bioensayo ADCC en un baño de agua a 37 °C durante al menos 30 minutos antes de su uso.
3. Descongele las células efectoras de bioensayo ADCC de almacenamiento en frío a -80 °C colocándolas en un baño de agua a 37 °C (aproximadamente 2-3 min). Mecione suavemente e inspeccione visualmente el vial, pero no lo invierta durante el proceso de descongelación.
4. Transfiera 630 ml de células efectoras a un tubo de 15 mL que contenga 3,6 mL de tampón de ensayo ADCC. Mezcle bien invirtiendo suavemente el tubo 2 veces.

5. Incubación de células efectoras con anticuerpos y células diana

1. Después de la incubación durante la noche, retire el medio de las células objetivo (15.000 células cancerosas por pocillo) y agregue 25 μL del tampón de bioensayo ADCC y 25 μL de cetuximab (antagonista del EGFR) y bevacizumab (antagonista del VEGF) para obtener la concentración final de 0,1 μg/mL, 1 μg/mL o 10 μg/mL de las células objetivo en cada pocillo según la Figura 2.
2. Añada 75.000 células efectoras en 25 μL de tampón de bioensayo ADCC por pocillo en la microplaca de 96 pocillos que contiene las células objetivo. Los pocillos marcados como Sin mAb actúan como ningún control de anticuerpos (Figura 2).
3. Agregue tampón de bioensayo ADCC a los pocillos etiquetados como AB (tampón de bioensayo ADCC) para el control en blanco.
4. Incubar la placa durante 6 h.

6. Lectura cuantitativa de la actividad de ADCC

1. Prepare el reactivo de ensayo de luciferasa 4 h antes de la medición añadiendo tampón de ensayo de luciferasa al sustrato del ensayo de luciferasa (liofilizado).
2. Después de 6 h de incubación de las células diana, el anticuerpo y las células efectoras, agregue 75 μL del reactivo de ensayo de luciferasa a cada pocillo e incube durante 30 minutos.
3. Después del período de incubación, mida la señal de luminiscencia en cada pozo mediante el uso de un luminómetro, proporcionando una lectura cuantitativa de la actividad de ADCC.
4. Para el análisis de datos, calcule la inducción de pliegue de la siguiente manera:
   Inducción de pliegue = RLU (inducida por anticuerpos - antecedentes) / RLU (sin control de anticuerpos - antecedentes).
   Donde RLU son unidades de luminiscencia relativas; Los anticuerpos inducidos son los pocillos B3 a B8 y C3 a C8; Sin control de anticuerpos = B2 y C2; Antecedentes = RLU promedio del pozo A2 al A5 (Figura 2).

Resultados

La expresión de EGFR y VEGFR en las células diana BHT-101 y SW-1736 se detectó mediante Western blot. Se detectó la expresión de EGFR en las células BHT-101 y SW-1736, pero no la expresión de VEGFR (Figura 3).

Utilizando el kit de bioensayo ADCC, detectamos la reacción ADCC del anticuerpo anti-EGFR, cetuximab, utilizando líneas celulares positivas para EGFR, BHT-101 y SW-1736, como células diana. El bevacizumab, un inact...

Discusión

Aquí, hemos presentado el método ADCC Bioassay para evaluar la reacción ADCC de un anticuerpo terapéutico. El método es sencillo y emplea un formato simple de "agregar-mezclar-leer" para la medición.

Antes de realizar el experimento, la expresión del antígeno diana en las células diana debe confirmarse mediante citometría de flujo o Western blot. La citometría de flujo será una mejor herramienta para detectar el antígeno de superficie. Sin embarg...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054	Dilute 10x in PBS to make 0.05% Trypsin
1x Tris Buffer Saline (TBS)	1st BASE	BUF-3030-1X1L	For membrane washing in western blotting
1.5 M Tris Buffer, pH 8.8	1st BASE	BUF-1419-1L-pH8.8	For SDS gel preparation
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M7522-100ML	For sample preparation of western blotting
30% Acrylamide/Bis solution	Bio-Rad	#1610158	For SDS gel preparation
4x Laemmli Buffer	Bio-Rad	#1610747	For sample preparation of western blotting
96-well white polystyrene microplate with clear flat bottom	Corning Incorporated	3610	For ADCC assay
ADCC Bioassay Effector cells (0.65 mL)	Promega	G7011	Includes in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 1 vial
ADCC reporter bioassay core kit	Promega	G7010	Mentioned as ADCC bioassay kit for ADCC assay in this experiment
Ammonium Persulfate	Sigma Aldrich	A3678-25G	For SDS gel preparation
Bevacizumab (Humanized Anti VEGF-antibody)	MVASI	-	Use as negative control antibody in ADCC asssay
BHT-101	Leibniz Institute DSMZ	ACC279	Human anaplastic papillary thyroid cancer cell line
Bio-Glo Luciferase Assay Buffer	Promega	G7941	Includes in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 10 mL
Bio-Glo Luciferase Assay Substrate (Lyophilized)	Promega	G7941	Includes in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 1 vial
Cell scraper	GenFollower	GD00235	To remove cell from culture flask
Cetuximab (Chimeric anti-EGFR antibody)	ERBITUX	-	Use as therapeutic antibody in ADCC assay
Chemiluminescent HRP substrate	Merck Millipore	WBKLS0500	For protein detection in western blotting
Distilled water	Gibco	15230-162	For SDS gel preparation
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106	Culture media supplement
iBright CL1500 imaging system	Thermo Scientific	2462621100038	For protein detection in western blotting
L-glutamine, 200 mM	Gibco	25030-081	Culture media supplement
Low IgG Serum	Promega	G7110	Includes in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 4 mL
Megafuge 8R	Thermo Scientific	42876589	Centrifuge
Mouse anti-EGFR monoclonal antibodies	BD Biosciences	610016	Primary antibody in western blotting
Mouse anti-VEGFR monoclonal antibodies	BD Biosciences	571194	Primary antibody in western blotting
non-enzymatic cell dissociation buffer	Sigma Aldrich	C5789-100ML	For cell harvesting from T75 flask
Penicillin-Streptomycin	PAN Biotech	P06-07100	Antibacterial for culture media
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.2, Sterile filtered	1st BASE	CUS-2048-1x1L	Use as washing solution for cells
Pierce BCA assay kit	Thermo Scientific	23225	To measure protein concentration
Protease and phosphatase inhibitor	Thermo Scientific	A32959	For protein digestion in sample preparation for western blotting
PVDF membrane (Immobilin-P)	Merck Millipore	IPVH00010	For protein transfer in western blotting
Rabbit anti-mouse IgG, Fcγ HRP-conjugated secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	315-035-046	Secondary antibody in western blotting
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium	Capricorn Scientific	RPMI-XA	Cell culture media
RPMI-1640	Promega	G7080	Includes in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 36 mL
Skim milk powder	Merck Millipore	70166-500G	For membrane blocking in western blotting
Sodium Dodecyl Sulfate	1st BASE	BIO-2050-500g	For SDS gel preparation
SW-1736	Cytion	300453	Human thyroid squamous cell cancer cell line
T75 culture flasks	SPL Lifesciences	70075	Cell culture flask
Tecan Multimode Reader model Spark 10M	Tecan	1607000294	for luminicence quantification
TEMED	Bio-Rad	#1610801	For SDS gel preparation
Tween-20	Promega	H5151	For membrane washing in western blotting
Vi-cell XR cell viability analyzer	Beckman Coulter	AL15072	Cell counter