Valutazione della citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente nelle cellule tumorali utilizzando il biotest del reporter di citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per un test di citotossicità cellulo-mediata (ADCC) anticorpo-dipendente utilizzando un kit di biotest ADCC. Questo metodo offre uno strumento prezioso per chiarire il meccanismo dell'ADCC e valutare il potenziale terapeutico degli anticorpi nell'immunoterapia del cancro.

Abstract

Il metodo per la citotossicità cellulo-mediata (ADCC) anticorpo-dipendente rappresenta uno strumento importante per valutare l'efficacia degli anticorpi terapeutici nell'immunoterapia del cancro. La valutazione dell'attività dell'ADCC nelle cellule tumorali è essenziale per lo sviluppo e l'ottimizzazione di trattamenti basati su anticorpi. Qui, proponiamo un approccio metodologico all'utilizzo di un kit di biodosaggio ADCC per la valutazione quantitativa della reazione ADCC utilizzando cellule tumorali tiroidee come cellule effettrici. Il protocollo prevede la co-coltura di cellule effettrici con cellule tumorali bersaglio in diversi rapporti in presenza di un anticorpo terapeutico. Il kit di biodosaggio ADCC utilizzato in questo esperimento include le cellule effettrici geneticamente modificate che esprimono un gene reporter della luciferasi sotto il controllo degli elementi di risposta del fattore nucleare delle cellule T attivate (NFAT). Dopo il legame dell'antigene di superficie sulle cellule bersaglio con gli anticorpi e le cellule effettrici, le cellule effettrici rilasciano luciferasi, consentendo la quantificazione della citotossicità attraverso la misurazione del segnale di luminescenza. A differenza dei test ADCC convenzionali, questo metodo ha dimostrato il legame dell'antigene bersaglio con gli anticorpi e le cellule effettrici, che possono produrre risultati affidabili in un breve periodo.

Introduzione

La citotossicità cellulo-mediata (ADCC) anticorpo-dipendente è un meccanismo importante attraverso il quale gli anticorpi esercitano effetti immuno-mediati di uccisione cellulare ^1,2,3. Le cellule immunitarie vengono attivate legandosi all'anticorpo terapeutico, che interagisce con gli antigeni di superficie delle cellule bersaglio per rilasciare granzimi, la perforina, portando alla morte delle cellule bersaglio. Queste cellule immunitarie includono cellule natural killer (NK) e neutrofili 2,3,4,5,6,7. Il test ADCC è diventato uno strumento importante per valutare l'efficacia dell'anticorpo terapeutico ^8,9.

Nel test ADCC convenzionale, le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) o le cellule natural killer vengono utilizzate come cellule effettrici per monitorare l'efficacia di un anticorpo terapeutico quantificando il tasso di morte cellulare del bersaglio. Il nostro metodo utilizza un kit di biotest ADCC che include cellule effettrici geneticamente modificate che esprimono un gene reporter della luciferasi sotto il controllo degli elementi di risposta del fattore nucleare delle cellule T attivate (NFAT). Quantifichiamo quindi il legame dell'antigene di superficie sulle cellule bersaglio con l'anticorpo e le cellule effettrici. Questo metodo si basa sulla reazione ADCC che si verifica in un breve periodo senza richiedere cellule PBMC umane. Le fasi sperimentali includono la co-coltura di cellule effettrici con cellule bersaglio in presenza di anticorpi terapeutici.

Durante l'incubazione, l'anticorpo terapeutico si lega all'antigene bersaglio sulla superficie delle cellule bersaglio, il che porta al legame delle cellule effettrici e del frammento Fc di un anticorpo. Questo attiva l'elemento di risposta NFAT e rilascia segnali di luminescenza per la valutazione quantitativa della reazione ADCC.

Prima di eseguire l'esperimento, l'espressione dell'antigene bersaglio nelle cellule bersaglio deve essere confermata mediante citometria a flusso o western blotting. Le cellule bersaglio vengono coltivate e fatte passare in piastre a 96 pozzetti per 24 ore prima dell'esperimento. Diverse concentrazioni di un anticorpo terapeutico vengono sommate insieme a diverse conta cellulare di cellule effettrici per ottenere il rapporto calcolato-cellula effettrice/cellula bersaglio.

Le fasi chiave di questo metodo includono (1) la preparazione delle cellule bersaglio e delle cellule effettrici, (2) i rapporti tra cellule effettrici e cellule bersaglio, (3) la preparazione di diverse concentrazioni dell'anticorpo e (4) la durata variabile dell'incubazione. Dopo l'incubazione, i segnali di luminescenza vengono misurati utilizzando un luminometro, fornendo una lettura quantitativa dell'attività dell'ADCC. Rispetto ad altri metodi per misurare l'ADCC, questo metodo è relativamente semplice da utilizzare e i risultati sono accurati.

Il biotest reporter ADCC indica il legame dell'antigene bersaglio, dell'anticorpo terapeutico e delle cellule immunitarie nell'attivazione della via ADCC. Questo legame attiva la trascrizione genica attraverso la via NFAT nelle cellule effettrici Jurkat ingegnerizzate con recettore FcγRIIIa ad espressione stabile, la variante V158 (ad alta affinità). L'elemento di risposta NFAT media l'espressione della luciferasi nelle cellule effettrici^10,11. L'attività biologica dell'anticorpo nel meccanismo d'azione (MOA) dell'ADCC è quantificata attraverso il segnale della luciferasi prodotto dalla via NFAT. Il segnale della luciferasi nelle cellule effettrici - cellule di Jurket che esprimono il recettore FcγRIIIa - viene quantificato utilizzando un lettore di luminescenza (Figura 1). Il rapporto segnale/rumore del test è elevato.

Protocollo

1. Identificazione dell'espressione di EGFR e VEGFR in cellule bersaglio

NOTA: Utilizzare il western blotting per rilevare l'espressione dell'antigene bersaglio nelle cellule bersaglio.

1. Preparazione del campione
   1. Coltura delle cellule (linee cellulari di carcinoma tiroideo umano BHT-101 e SW-1736) in fiasche T75 utilizzando il terreno del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), l'1% di L-glutammina e l'1% di antibiotici (penicillina-streptomicina).
   2. Raccogliere le cellule quando sono confluenti all'80% rimuovendo il terreno di coltura e lavando le cellule con PBS. Aggiungere 5 mL di PBS e raschiare le cellule utilizzando un raschietto per rimuovere le cellule dal pallone di coltura. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL.
   3. Contare le celle con un contatore di celle.
   4. Aliquotare 5 × 10⁶ cellule BHT-101 e SW-1736 in provette coniche da 15 mL.
   5. Centrifugare le celle a 135 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante PBS.
   6. Lisi il pellet cellulare aggiungendo 100 μl di tampone di lisi RIPA contenente inibitori della proteasi-fosfatasi per 5 minuti su ghiaccio. Trasferire il lisato in una provetta da 2 ml, centrifugare a 15.000 × g per 15 minuti e trasferire il surnatante in una nuova provetta da 2 ml.
   7. Misurare la concentrazione proteica del lisato cellulare utilizzando un kit di dosaggio dell'acido bicinconninico (BCA).
   8. Aliquotare 70 μg di proteine dal lisato cellulare da ciascun campione, aggiungere 2 tamponi per campioni di Laemmli integrati con 2-mercaptoetanolo al 10% e far bollire i campioni a 100 °C per 5 minuti per la denaturazione dei campioni.
2. Elettroforesi su gel e trasferimento di membrana
   1. Preparare il gel di poliacrilammide dodecil solfato di sodio (SDS) all'8% utilizzando acqua distillata (4,7 mL), acrilammide al 30% (2,7 mL), tampone Tris 1,5 M, pH 8,8 (2,5 mL), dodecil solfato di sodio al 10% (0,1 mL), persolfato di ammonio al 10% (100 μL) e TEMED (10 μL).
   2. Eseguire 70 μg di campioni denaturati nel gel di poliacrilammide SDS all'8% a 80 V per 20 minuti e a 120 V per 100 minuti.
   3. Trasferire la proteina sul gel su una membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF) a 100 V per 90 minuti.
   4. Dopo il trasferimento, bloccare la membrana con latte scremato al 7% diluito in tampone TBS-T (20 mM Tris pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,2% Tween-20) per 1 ora.
3. Incubazione degli anticorpi
   1. Incubare la membrana ostruita con anticorpi monoclonali anti-recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) di topo e anti-recettore del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGFR) di coniglio (diluiti a 1:1.000 in latte scremato al 7%) per una notte a 4 °C.
   2. Dopo l'incubazione, lavare accuratamente la membrana con tampone Saline-Tween (TBS-T) tamponato con Tris (20 mM Tris pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,2% Tween-20) per 7 minuti e ripetere 4 volte.
   3. Incubare la membrana con l'anticorpo secondario coniugato HRP (diluito a 1:4.000 in latte scremato al 7% (TBS-T)) per 1 ora.
   4. Dopo l'incubazione, lavare accuratamente la membrana con tampone TBS-T per 7 minuti e ripetere 4 volte.
4. Rilevamento di proteine
   1. Incubare la membrana nel substrato chemiluminescente HRP preparato mescolando 1 mL di soluzione di perossido di substrato HRP con 1 mL di reagente Luminol del substrato HRP (entrambi i reagenti provengono dal kit del substrato chemiluminescente) per 2 minuti.
   2. Visualizzare la membrana utilizzando un sistema di imaging.

2. Preparazione delle cellule bersaglio

1. Colture esponenziali delle cellule T bersaglio, BHT-101 e SW-1736 fino a quando l'80% di confluenza in terreni RPMI integrati con il 10% di FBS, l'1% di L-glutammina e l'1% di antibiotici (penicillina-streptomicina) in fiasche di T-75.
2. Dopo aver rimosso il terreno, lavare le celle una volta con PBS. Incubare le cellule con 1 ml di tampone di dissociazione cellulare non enzimatico per 5 minuti per rimuovere le cellule aderenti. Aggiungere PBS per fermare la reazione del tampone di dissociazione cellulare non enzimatico. Centrifugare le cellule a 135 × g per 5 minuti e aggiungere 5 ml di PBS.
   NOTA: In questo caso, utilizziamo un tampone di dissociazione cellulare non enzimatico per preservare l'integrità delle proteine della superficie di membrana.
3. Contare le cellule e seminarle a 15.000 cellule/pozzetti in micropiastre di polistirene bianco a 96 pozzetti con fondo piatto e trasparente.

3. Preparazione di concentrazioni variabili dell'anticorpo terapeutico

1. Per seguire questo protocollo, utilizzare Cetuximab (anticorpo chimerico anti-EGFR) per legare l'EGFR e utilizzare Bevacizumab (anticorpo umanizzato anti VEGF-A) come controllo negativo.
2. Preparare il tampone ADCC Bioassay aggiungendo 1,4 mL di siero a basse IgG in 33,6 mL di RPMI-1640 (fornito nel kit).
3. Utilizzare il tampone ADCC Bioassay per la diluizione degli anticorpi. Preparare 400 μL di ciascun anticorpo in tre diverse concentrazioni: 30 μg/mL, 3 μg/mL e 0,3 μg/mL (concentrazione 3x) per ottenere la concentrazione finale di 10 μg/mL, 1 μg/mL e 0,1 μg/mL per una copertura ad ampio spettro per rilevare la dose ottimale.
   NOTA: Le concentrazioni finali di anticorpi si basano su 25 μL di cellule bersaglio in coltura, 25 μL di cellule effettrici e 25 μL di anticorpi in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.

4. Preparazione delle cellule effettrici

1. Conservare le celle effettrici a -80 °C prima dell'uso.
2. Preriscaldare il tampone ADCC Bioassay a bagnomaria a 37 °C per almeno 30 minuti prima dell'uso.
3. Scongelare le cellule effettrici ADCC Bioassay da celle frigorifere a -80 °C mettendole in un bagno d'acqua a 37 °C (circa 2-3 minuti). Scuotere delicatamente e ispezionare visivamente la fiala, ma non capovolgerla durante il processo di scongelamento.
4. Trasferire 630 ul di cellule effettrici in una provetta da 15 mL contenente 3,6 mL di tampone per saggi ADCC. Mescolare bene capovolgendo delicatamente il tubo 2 volte.

5. Incubazione di cellule effettrici con anticorpi e cellule bersaglio

1. Dopo un'incubazione notturna, rimuovere il terreno dalle cellule bersaglio (15.000 cellule tumorali per pozzetto) e aggiungere 25 μl del tampone ADCC Bioassay e 25 μl di Cetuximab (antagonista dell'EGFR) e Bevacizumab (antagonista del VEGF) per ottenere la concentrazione finale di 0,1 μg/mL, 1 μg/mL o 10 μg/mL delle cellule bersaglio in ciascun pozzetto secondo la Figura 2.
2. Aggiungere 75.000 cellule effettrici in 25 μl di tampone per biodosaggio ADCC per pozzetto nella micropiastra a 96 pozzetti contenente le cellule bersaglio. I pozzetti etichettati come No mAb agiscono come nessun controllo anticorpale (Figura 2).
3. Aggiungere il tampone ADCC Bioassay ai pozzetti etichettati come AB (ADCC Bioassay buffer) per il controllo in bianco.
4. Incubare la piastra per 6 ore.

6. Lettura quantitativa dell'attività dell'ADCC

1. Preparare il reagente del dosaggio della luciferasi 4 ore prima della misurazione aggiungendo il tampone del saggio della luciferasi al substrato del saggio della luciferasi (liofilizzato).
2. Dopo 6 ore di incubazione delle cellule bersaglio, degli anticorpi e delle cellule effettrici, aggiungere 75 μl di reagente del saggio della luciferasi a ciascun pozzetto e incubare per 30 minuti.
3. Dopo il periodo di incubazione, misurare il segnale di luminescenza in ciascun pozzetto utilizzando un luminometro, fornendo una lettura quantitativa dell'attività dell'ADCC.
4. Per l'analisi dei dati, calcolare l'induzione della piega come segue:
   Induzione del fold = RLU (anticorpi indotti - background) / RLU (nessun controllo anticorpale - background).
   Dove RLU è l'unità di luminescenza relativa; Gli anticorpi indotti sono i pozzetti da B3 a B8 e da C3 a C8; Nessun controllo anticorpale = B2 e C2; Background = RLU medio dal pozzo A2 ad A5 (Figura 2).

Risultati

L'espressione di EGFR e VEGFR nelle cellule bersaglio BHT-101 e SW-1736 è stata rilevata mediante western blotting. L'espressione di EGFR è stata rilevata in entrambe le cellule BHT-101 e SW-1736, ma non l'espressione di VEGFR (Figura 3).

Utilizzando il kit di biodosaggio ADCC, abbiamo rilevato la reazione ADCC dell'anticorpo anti-EGFR, cetuximab, utilizzando linee cellulari EGFR-positive, BHT-101 e SW-1736, come cellule bersagl...

Discussione

Qui, abbiamo presentato il metodo ADCC Bioassay per valutare la reazione ADCC di un anticorpo terapeutico. Il metodo è semplice e utilizza un semplice formato "aggiungi-mix-leggi" per la misurazione.

Prima di eseguire l'esperimento, l'espressione dell'antigene bersaglio nelle cellule bersaglio deve essere confermata mediante citometria a flusso o western blotting. La citometria a flusso sarà uno strumento migliore per rilevare l'antigene di superficie. Tutt...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054	Dilute 10x in PBS to make 0.05% Trypsin
1x Tris Buffer Saline (TBS)	1st BASE	BUF-3030-1X1L	For membrane washing in western blotting
1.5 M Tris Buffer, pH 8.8	1st BASE	BUF-1419-1L-pH8.8	For SDS gel preparation
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M7522-100ML	For sample preparation of western blotting
30% Acrylamide/Bis solution	Bio-Rad	#1610158	For SDS gel preparation
4x Laemmli Buffer	Bio-Rad	#1610747	For sample preparation of western blotting
96-well white polystyrene microplate with clear flat bottom	Corning Incorporated	3610	For ADCC assay
ADCC Bioassay Effector cells (0.65 mL)	Promega	G7011	Includes in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 1 vial
ADCC reporter bioassay core kit	Promega	G7010	Mentioned as ADCC bioassay kit for ADCC assay in this experiment
Ammonium Persulfate	Sigma Aldrich	A3678-25G	For SDS gel preparation
Bevacizumab (Humanized Anti VEGF-antibody)	MVASI	-	Use as negative control antibody in ADCC asssay
BHT-101	Leibniz Institute DSMZ	ACC279	Human anaplastic papillary thyroid cancer cell line
Bio-Glo Luciferase Assay Buffer	Promega	G7941	Includes in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 10 mL
Bio-Glo Luciferase Assay Substrate (Lyophilized)	Promega	G7941	Includes in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 1 vial
Cell scraper	GenFollower	GD00235	To remove cell from culture flask
Cetuximab (Chimeric anti-EGFR antibody)	ERBITUX	-	Use as therapeutic antibody in ADCC assay
Chemiluminescent HRP substrate	Merck Millipore	WBKLS0500	For protein detection in western blotting
Distilled water	Gibco	15230-162	For SDS gel preparation
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106	Culture media supplement
iBright CL1500 imaging system	Thermo Scientific	2462621100038	For protein detection in western blotting
L-glutamine, 200 mM	Gibco	25030-081	Culture media supplement
Low IgG Serum	Promega	G7110	Includes in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 4 mL
Megafuge 8R	Thermo Scientific	42876589	Centrifuge
Mouse anti-EGFR monoclonal antibodies	BD Biosciences	610016	Primary antibody in western blotting
Mouse anti-VEGFR monoclonal antibodies	BD Biosciences	571194	Primary antibody in western blotting
non-enzymatic cell dissociation buffer	Sigma Aldrich	C5789-100ML	For cell harvesting from T75 flask
Penicillin-Streptomycin	PAN Biotech	P06-07100	Antibacterial for culture media
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.2, Sterile filtered	1st BASE	CUS-2048-1x1L	Use as washing solution for cells
Pierce BCA assay kit	Thermo Scientific	23225	To measure protein concentration
Protease and phosphatase inhibitor	Thermo Scientific	A32959	For protein digestion in sample preparation for western blotting
PVDF membrane (Immobilin-P)	Merck Millipore	IPVH00010	For protein transfer in western blotting
Rabbit anti-mouse IgG, Fcγ HRP-conjugated secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	315-035-046	Secondary antibody in western blotting
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium	Capricorn Scientific	RPMI-XA	Cell culture media
RPMI-1640	Promega	G7080	Includes in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 36 mL
Skim milk powder	Merck Millipore	70166-500G	For membrane blocking in western blotting
Sodium Dodecyl Sulfate	1st BASE	BIO-2050-500g	For SDS gel preparation
SW-1736	Cytion	300453	Human thyroid squamous cell cancer cell line
T75 culture flasks	SPL Lifesciences	70075	Cell culture flask
Tecan Multimode Reader model Spark 10M	Tecan	1607000294	for luminicence quantification
TEMED	Bio-Rad	#1610801	For SDS gel preparation
Tween-20	Promega	H5151	For membrane washing in western blotting
Vi-cell XR cell viability analyzer	Beckman Coulter	AL15072	Cell counter