Avaliação da citotoxicidade dependente de anticorpos e mediada por células em células cancerígenas usando bioensaio Reporter de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio de citotoxicidade mediada por células (ADCC) dependente de anticorpos usando um kit de bioensaio ADCC. Este método oferece uma ferramenta valiosa para elucidar o mecanismo ADCC e avaliar o potencial terapêutico dos anticorpos na imunoterapia contra o câncer.

Resumo

O método de citotoxicidade dependente de anticorpos e mediada por células (ADCC) representa uma ferramenta importante para avaliar a eficácia de anticorpos terapêuticos na imunoterapia contra o câncer. Avaliar a atividade do ADCC em células cancerígenas é essencial para o desenvolvimento e otimização de tratamentos baseados em anticorpos. Aqui, propomos uma abordagem metodológica de utilização de um kit de bioensaio ADCC para avaliação quantitativa da reação ADCC usando células de câncer de tireoide como células efetoras. O protocolo envolve a co-cultura de células efetoras com células-alvo cancerígenas em diferentes proporções na presença de um anticorpo terapêutico. O kit de bioensaio ADCC usado neste experimento inclui as células efetoras geneticamente modificadas que expressam um gene repórter de luciferase sob o controle de elementos de resposta do Fator Nuclear de Células T Ativadas (NFAT). Após a ligação do antígeno de superfície nas células-alvo com os anticorpos e células efetoras, as células efetoras liberam luciferase, permitindo a quantificação da citotoxicidade por meio da medição do sinal de luminescência. Em contraste com os ensaios convencionais de ADCC, este método provou a ligação do antígeno alvo com anticorpos e células efetoras, que podem produzir resultados confiáveis em um curto período.

Introdução

A citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) é um mecanismo importante pelo qual os anticorpos exercem efeitos de morte celular mediados imunologicamente ^1,2,3. As células imunes são ativadas pela ligação ao anticorpo terapêutico, que interage com os antígenos de superfície das células-alvo para liberar granzimas, a perforina, levando à morte da célula-alvo. Essas células imunes incluem células natural killer (NK) e neutrófilos 2,3,4,5,6,7. O ensaio ADCC tornou-se uma importante ferramenta para avaliar a eficácia do anticorpo terapêutico ^8,9.

No ensaio ADCC convencional, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) ou células assassinas naturais são usadas como células efetoras para monitorar a eficácia de um anticorpo terapêutico, quantificando a taxa de morte celular do alvo. Nosso método usa um kit de bioensaio ADCC que inclui células efetoras geneticamente modificadas que expressam um gene repórter de luciferase sob o controle de elementos de resposta do Fator Nuclear de Células T Ativadas (NFAT). Em seguida, quantificamos a ligação do antígeno de superfície nas células-alvo com o anticorpo e as células efetoras. Este método é baseado na reação ADCC que ocorre em um curto período sem a necessidade de células PBMC humanas. As etapas experimentais incluem a co-cultura de células efetoras com células-alvo na presença de anticorpos terapêuticos.

Durante a incubação, o anticorpo terapêutico se liga ao antígeno alvo na superfície das células-alvo, o que leva à ligação das células efetoras e do fragmento Fc de um anticorpo. Isso ativa o elemento de resposta NFAT e libera sinais de luminescência para a avaliação quantitativa da reação ADCC.

Antes de realizar o experimento, a expressão do antígeno-alvo nas células-alvo deve ser confirmada por citometria de fluxo ou western blotting. As células-alvo são cultivadas e passadas para placas de 96 poços por 24 horas antes do experimento. Diferentes concentrações de um anticorpo terapêutico são adicionadas junto com diferentes contagens de células efetoras para atingir a proporção calculada de células efetoras para células-alvo.

As principais etapas deste método incluem (1) preparação de células-alvo e células efetoras, (2) proporções de células efetoras para células-alvo, (3) preparação de diferentes concentrações do anticorpo e (4) duração variável da incubação. Após a incubação, os sinais de luminescência são medidos usando um luminômetro, fornecendo uma leitura quantitativa da atividade do ADCC. Comparado a outros métodos de medição do ADCC, este método é relativamente simples de operar e os resultados são precisos.

O bioensaio repórter do ADCC indica a ligação do antígeno alvo, anticorpo terapêutico e células imunes na ativação da via ADCC. Essa ligação ativa a transcrição gênica através da via NFAT nas células efetoras projetadas pelas células Jurkat com o receptor FcγRIIIa de expressão estável, a variante V158 (alta afinidade). O elemento de resposta NFAT medeia a expressão da luciferase nas células efetoras^10,11. A atividade biológica do anticorpo no mecanismo de ação (MOA) do ADCC é quantificada através do sinal de luciferase produzido a partir da via NFAT. O sinal da luciferase nas células efetoras - células Jurket que expressam o receptor FcγRIIIa - é quantificado usando um leitor de luminescência (Figura 1). A relação sinal-ruído do ensaio é alta.

Protocolo

1. Detecção da expressão de EGFR e VEGFR em células-alvo

NOTA: Use western blotting para detectar a expressão do antígeno alvo nas células-alvo.

1. Preparação da amostra
   1. Cultive as células (linhagens celulares de câncer de tireoide humano BHT-101 e SW-1736) em frascos T75 usando meio do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de L-glutamina e 1% de antibióticos (penicilina-estreptomicina).
   2. Colha as células quando estiverem 80% confluentes, removendo os meios de cultura e lavando as células com PBS. Adicione 5 mL de PBS e descarte as células usando um raspador de células para remover as células do frasco de cultura. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL.
   3. Conte as células com um contador de células.
   4. Alíquota 5 × 10⁶ de células BHT-101 e SW-1736 em tubos cônicos de 15 mL.
   5. Gire as células a 135 × g por 5 min em temperatura ambiente. Remova o sobrenadante PBS.
   6. Lisar o pellet celular adicionando 100 μL de tampão de lise RIPA contendo inibidores de protease-fosfatase por 5 min em gelo. Transfira o lisado para um tubo de 2 mL, centrifugue a 15.000 × g por 15 min e transfira o sobrenadante para um novo tubo de 2 mL.
   7. Meça a concentração de proteína do lisado celular usando um kit de ensaio de ácido bicinconínico (BCA).
   8. Alíquota de 70 μg de proteína do lisado celular de cada amostra, adicione 2x tampão de amostra Laemmli suplementado com 10% de 2-mercaptoetanol e ferva as amostras a 100 ° C por 5 min para desnaturação das amostras.
2. Eletroforese em gel e transferência de membrana
   1. Prepare o gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio (SDS) a 8% usando água destilada (4.7 mL), acrilamida a 30% (2.7 mL), tampão Tris 1.5 M, pH 8.8 (2.5 mL), dodecil sulfato de sódio a 10% (0.1 mL), persulfato de amônio a 10% (100 μL) e TEMED (10 μL).
   2. Execute 70 μg das amostras desnaturadas no gel de poliacrilamida SDS a 8% a 80 V por 20 min e a 120 V por 100 min.
   3. Transfira a proteína do gel para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) a 100 V por 90 min.
   4. Após a transferência, bloqueie a membrana com leite desnatado a 7% diluído em tampão TBS-T (20 mM Tris pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,2% Tween-20) por 1 h.
3. Incubação de anticorpos
   1. Incube a membrana bloqueada com anticorpos monoclonais anti-receptor do fator de crescimento epidérmico de camundongo (EGFR) e anti-receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR) de coelho (diluídos a 1:1.000 em leite desnatado a 7%) durante a noite a 4 ° C.
   2. Após a incubação, lave bem a membrana com tampão Tween salino tamponada com Tris (TBS-T) (20 mM Tris pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,2% Tween-20) por 7 min e repita 4x.
   3. Incube a membrana com o anticorpo secundário conjugado com HRP (diluído a 1:4.000 em leite desnatado a 7% (TBS-T)) por 1 h.
   4. Após a incubação, lave bem a membrana com tampão TBS-T por 7 min e repita 4 vezes.
4. Detecção de proteínas
   1. Incube a membrana em substrato de HRP quimioluminescente preparado misturando 1 mL de solução de peróxido de substrato HRP com 1 mL de reagente de luminol de substrato HRP (ambos os reagentes são do kit de substrato quimioluminescente) por 2 min.
   2. Visualize a membrana usando um sistema de imagem.

2. Preparação das células-alvo

1. Cultive as células T alvo, células BHT-101 e SW-1736 exponencialmente até 80% confluentes em meio RPMI suplementado com 10% de FBS, 1% de L-glutamina e 1% de antibióticos (penicilina-estreptomicina) em frascos T-75.
2. Depois de remover a mídia, lave as células uma vez com PBS. Incube as células com 1 ml de tampão de dissociação celular não enzimático por 5 min para desalojar as células aderentes. Adicione PBS para interromper a reação do tampão de dissociação celular não enzimático. Gire as células a 135 × g por 5 min e adicione 5 mL de PBS.
   NOTA: Aqui, usamos um tampão de dissociação celular não enzimático para preservar a integridade da proteína da superfície da membrana.
3. Conte as células e semeie-as em 15.000 células/poços em microplacas de poliestireno branco de 96 poços com fundo plano e transparente.

3. Preparação de concentrações variáveis do anticorpo terapêutico

1. Para seguir este protocolo, use Cetuximab (anticorpo quimérico anti-EGFR) para ligar o EGFR e use Bevacizumab (anticorpo anti VEGF-A humanizado) como controle negativo.
2. Prepare o tampão de bioensaio ADCC adicionando 1,4 mL de soro de baixa IgG em 33,6 mL de RPMI-1640 (fornecido no kit).
3. Use o tampão de bioensaio ADCC para a diluição de anticorpos. Prepare 400 μL de cada anticorpo em três concentrações diferentes: 30 μg/mL, 3 μg/mL e 0,3 μg/mL (concentração 3x) para obter a concentração final de 10 μg/mL, 1 μg/mL e 0,1 μg/mL para cobertura de amplo espectro para detectar a dose ideal.
   NOTA: As concentrações finais de anticorpos são baseadas em 25 μL de células-alvo cultivadas, 25 μL de células efetoras e 25 μL de anticorpo em cada poço de uma placa de 96 poços.

4. Preparação de células efetoras

1. Conservar as células efetoras a -80 °C antes de utilizar.
2. Pré-aqueça o tampão de bioensaio ADCC em banho-maria a 37 °C por pelo menos 30 minutos antes de usar.
3. Descongele as células efetoras de bioensaio ADCC de armazenamento a frio a -80 °C, colocando-as em banho-maria a 37 °C (aproximadamente 2-3 min). Balance suavemente e inspecione visualmente o frasco, mas não o inverta durante o processo de descongelamento.
4. Transfira 630ul de células efetoras para um tubo de 15 mL contendo 3,6 mL de tampão de ensaio ADCC. Misture bem invertendo suavemente o tubo 2x.

5. Incubação de células efetoras com anticorpos e células-alvo

1. Após a incubação durante a noite, remova o meio das células-alvo (15.000 células cancerígenas por poço) e adicione 25 μL do tampão de bioensaio ADCC e 25 μL de cetuximabe (antagonista do EGFR) e bevacizumabe (antagonista do VEGF) para obter a concentração final de 0,1 μg/mL, 1 μg/mL ou 10 μg/mL das células-alvo em cada poço de acordo com a Figura 2.
2. Adicione 75.000 células efetoras em 25 μL de tampão de bioensaio ADCC por poço na microplaca de 96 poços contendo células-alvo. Os poços rotulados como Sem mAb atuam como nenhum controle de anticorpos (Figura 2).
3. Adicione o tampão de bioensaio ADCC aos poços rotulados como AB (tampão de bioensaio ADCC) para controle em branco.
4. Incubar a placa durante 6 h.

6. Leitura quantitativa da atividade do ADCC

1. Prepare o reagente do ensaio de luciferase 4 h antes da medição, adicionando tampão de ensaio de luciferase ao substrato de ensaio de luciferase (liofilizado).
2. Após 6 h de incubação das células-alvo, anticorpos e células efetoras, adicione 75 μL do reagente do ensaio de luciferase a cada poço e incube por 30 min.
3. Após o período de incubação, meça o sinal de luminescência em cada poço usando um luminômetro, fornecendo uma leitura quantitativa da atividade do ADCC.
4. Para análise de dados, calcule a indução de dobra da seguinte maneira:
   Indução de dobra = RLU (induzido por anticorpos - fundo) / RLU (sem controle de anticorpos - fundo).
   Onde RLU são unidades de luminescência relativa; Os anticorpos induzidos são os poços B3 a B8 e C3 a C8; Sem controle de anticorpos = B2 e C2; Background = RLU médio do poço A2 a A5 (Figura 2).

Resultados

A expressão de EGFR e VEGFR nas células-alvo BHT-101 e SW-1736 foi detectada usando western blotting. A expressão de EGFR foi detectada em células BHT-101 e SW-1736, mas não a expressão de VEGFR (Figura 3).

Usando o kit de bioensaio ADCC, detectamos a reação ADCC do anticorpo anti-EGFR, cetuximabe, usando linhagens celulares positivas para EGFR, BHT-101 e SW-1736, como células-alvo. O bevacizumabe, um inativador do VEGF, ...

Discussão

Aqui, apresentamos o método de bioensaio ADCC para avaliar a reação ADCC de um anticorpo terapêutico. O método é direto e emprega um formato simples de "adicionar-misturar-ler" para medição.

Antes de fazer o experimento, a expressão do antígeno-alvo nas células-alvo deve ser confirmada por citometria de fluxo ou western blotting. A citometria de fluxo será uma ferramenta melhor para detectar o antígeno de superfície. No entanto, o uso da citomet...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054	Dilute 10x in PBS to make 0.05% Trypsin
1x Tris Buffer Saline (TBS)	1st BASE	BUF-3030-1X1L	For membrane washing in western blotting
1.5 M Tris Buffer, pH 8.8	1st BASE	BUF-1419-1L-pH8.8	For SDS gel preparation
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M7522-100ML	For sample preparation of western blotting
30% Acrylamide/Bis solution	Bio-Rad	#1610158	For SDS gel preparation
4x Laemmli Buffer	Bio-Rad	#1610747	For sample preparation of western blotting
96-well white polystyrene microplate with clear flat bottom	Corning Incorporated	3610	For ADCC assay
ADCC Bioassay Effector cells (0.65 mL)	Promega	G7011	Includes in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 1 vial
ADCC reporter bioassay core kit	Promega	G7010	Mentioned as ADCC bioassay kit for ADCC assay in this experiment
Ammonium Persulfate	Sigma Aldrich	A3678-25G	For SDS gel preparation
Bevacizumab (Humanized Anti VEGF-antibody)	MVASI	-	Use as negative control antibody in ADCC asssay
BHT-101	Leibniz Institute DSMZ	ACC279	Human anaplastic papillary thyroid cancer cell line
Bio-Glo Luciferase Assay Buffer	Promega	G7941	Includes in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 10 mL
Bio-Glo Luciferase Assay Substrate (Lyophilized)	Promega	G7941	Includes in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 1 vial
Cell scraper	GenFollower	GD00235	To remove cell from culture flask
Cetuximab (Chimeric anti-EGFR antibody)	ERBITUX	-	Use as therapeutic antibody in ADCC assay
Chemiluminescent HRP substrate	Merck Millipore	WBKLS0500	For protein detection in western blotting
Distilled water	Gibco	15230-162	For SDS gel preparation
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106	Culture media supplement
iBright CL1500 imaging system	Thermo Scientific	2462621100038	For protein detection in western blotting
L-glutamine, 200 mM	Gibco	25030-081	Culture media supplement
Low IgG Serum	Promega	G7110	Includes in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 4 mL
Megafuge 8R	Thermo Scientific	42876589	Centrifuge
Mouse anti-EGFR monoclonal antibodies	BD Biosciences	610016	Primary antibody in western blotting
Mouse anti-VEGFR monoclonal antibodies	BD Biosciences	571194	Primary antibody in western blotting
non-enzymatic cell dissociation buffer	Sigma Aldrich	C5789-100ML	For cell harvesting from T75 flask
Penicillin-Streptomycin	PAN Biotech	P06-07100	Antibacterial for culture media
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.2, Sterile filtered	1st BASE	CUS-2048-1x1L	Use as washing solution for cells
Pierce BCA assay kit	Thermo Scientific	23225	To measure protein concentration
Protease and phosphatase inhibitor	Thermo Scientific	A32959	For protein digestion in sample preparation for western blotting
PVDF membrane (Immobilin-P)	Merck Millipore	IPVH00010	For protein transfer in western blotting
Rabbit anti-mouse IgG, Fcγ HRP-conjugated secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	315-035-046	Secondary antibody in western blotting
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium	Capricorn Scientific	RPMI-XA	Cell culture media
RPMI-1640	Promega	G7080	Includes in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 36 mL
Skim milk powder	Merck Millipore	70166-500G	For membrane blocking in western blotting
Sodium Dodecyl Sulfate	1st BASE	BIO-2050-500g	For SDS gel preparation
SW-1736	Cytion	300453	Human thyroid squamous cell cancer cell line
T75 culture flasks	SPL Lifesciences	70075	Cell culture flask
Tecan Multimode Reader model Spark 10M	Tecan	1607000294	for luminicence quantification
TEMED	Bio-Rad	#1610801	For SDS gel preparation
Tween-20	Promega	H5151	For membrane washing in western blotting
Vi-cell XR cell viability analyzer	Beckman Coulter	AL15072	Cell counter