Оценка антителозависимой, клеточно-опосредованной цитотоксичности в раковых клетках с помощью антителозависимого клеточно-опосредованного репортерного биоанализа

Резюме

Здесь мы представляем протокол антителозависимого, клеточно-опосредованного анализа цитотоксичности (ADCC) с использованием набора для биотестирования ADCC. Этот метод является ценным инструментом для выяснения механизма ADCC и оценки терапевтического потенциала антител в иммунотерапии рака.

Аннотация

Метод антителозависимой, клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) представляет собой важный инструмент для оценки эффективности терапевтических антител в иммунотерапии рака. Оценка активности ADCC в раковых клетках имеет важное значение для разработки и оптимизации методов лечения на основе антител. В данной работе мы предлагаем методологический подход к использованию набора для биотестирования ADCC для количественной оценки реакции ADCC с использованием клеток рака щитовидной железы в качестве эффекторных клеток. Протокол предполагает совместное культивирование эффекторных клеток с раковыми клетками-мишенями в различных соотношениях в присутствии терапевтического антитела. Набор для биотестирования ADCC, использованный в этом эксперименте, включает в себя генетически модифицированные эффекторные клетки, экспрессирующие репортерный ген люциферазы под контролем элементов ответа ядерного фактора активированных Т-клеток (NFAT). При связывании поверхностного антигена на клетках-мишенях с антителами и эффекторными клетками эффекторные клетки высвобождают люциферазу, что позволяет количественно оценить цитотоксичность путем измерения сигнала люминесценции. В отличие от обычных анализов ADCC, этот метод доказал связывание целевого антигена с антителами и эффекторными клетками, что может дать достоверные результаты за короткий промежуток времени.

Введение

Антителозависимая, клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) является важным механизмом, с помощью которого антитела оказывают иммуноопосредованное действие на уничтожение клеток ^1,2,3. Иммунные клетки активируются путем связывания с терапевтическим антителом, которое взаимодействует с поверхностными антигенами клеток-мишеней для высвобождения гранзимов, перфорина, что приводит к гибели клеток-мишеней. Эти иммунные клетки включают естественные киллеры (NK) клетки и нейтрофилы 2,3,4,5,6,7. Анализ ADCC стал важным инструментом для оценки эффективности терапевтического антитела ^8,9.

В традиционном анализе ADCC мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) или естественные клетки-киллеры используются в качестве эффекторных клеток для мониторинга эффективности терапевтического антитела путем количественного определения уровня смертности клеток-мишеней. В нашем методе используется набор для биотестирования ADCC, который включает в себя генетически модифицированные эффекторные клетки, экспрессирующие репортерный ген люциферазы под контролем элементов ответа ядерного фактора активированных Т-клеток (NFAT). Затем мы количественно оцениваем связывание поверхностного антигена на клетках-мишенях с антителом и эффекторными клетками. Этот метод основан на том, что реакция ADCC протекает за короткий промежуток времени без необходимости использования клеток PBMC человека. Экспериментальные этапы включают совместное культивирование эффекторных клеток с клетками-мишенями в присутствии терапевтических антител.

Во время инкубации терапевтическое антитело связывается с антигеном-мишенью на поверхности клеток-мишеней, что приводит к связыванию эффекторных клеток и Fc-фрагмента антитела. Это активирует чувствительный элемент NFAT и высвобождает сигналы люминесценции для количественной оценки реакции ADCC.

Перед проведением эксперимента экспрессия целевого антигена в клетках-мишенях должна быть подтверждена либо с помощью проточной цитометрии, либо с помощью вестерн-блоттинга. Клетки-мишени культивируют и пропускают в 96-луночные планшеты за 24 ч до начала эксперимента. Различные концентрации терапевтического антитела добавляются вместе с различным количеством эффекторных клеток для достижения рассчитанного соотношения эффекторов и клеток-мишеней.

Ключевые этапы этого метода включают (1) получение клеток-мишеней и эффекторных клеток, (2) соотношение эффекторных клеток-мишеней, (3) получение различных концентраций антитела и (4) различную продолжительность инкубации. После инкубации с помощью люминометра измеряются сигналы люминесценции, обеспечивающие количественное считывание активности ADCC. По сравнению с другими методами измерения ADCC, этот метод относительно прост в эксплуатации, а результаты точны.

Репортерный биоанализ ADCC указывает на связывание целевого антигена, терапевтического антитела и иммунных клеток в активации пути ADCC. Это связывание активирует транскрипцию генов через путь NFAT в эффекторных клетках Jurkat со стабильно экспрессирующим рецептором FcγRIIIa, вариантом V158 (высокоаффинный). Элемент ответа NFAT опосредует экспрессию люциферазы в эффекторных клетках^10,11. Биологическая активность антитела в механизме действия (MOA) ADCC количественно оценивается с помощью сигнала люциферазы, производимого путем NFAT. Сигнал люциферазы в эффекторных клетках — клетках Jurket, экспрессирующих рецептор FcγRIIIa, — количественно определяется с помощью люминесцентного считывателя (рис. 1). Отношение сигнал/шум анализа высокое.

протокол

1. Определение экспрессии EGFR и VEGFR в клетках-мишенях

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте вестерн-блоттинг для обнаружения экспрессии целевого антигена в клетках-мишенях.

1. Подготовка образцов
   1. Культивировали клетки (клеточные линии рака щитовидной железы человека BHT-101 и SW-1736) в колбах T75 с использованием среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% L-глутамина и 1% антибиотиков (пенициллин-стрептомицин).
   2. Собирайте клетки, когда они сливаются на 80%, удаляя питательную среду и промывая клетки PBS. Добавьте 5 мл PBS и удалите клетки с помощью скребка для клеток, чтобы извлечь клетки из колбы для культур. Переложите клетки в коническую трубку объемом 15 мл.
   3. Подсчитайте ячейки с помощью счетчика ячеек.
   4. Аликвота 5 × 10⁶ клеток BHT-101 и SW-1736 в конические пробирки объемом 15 мл.
   5. Раскрутите ячейки при 135 × г в течение 5 минут при комнатной температуре. Удалите надосадочную жидкость PBS.
   6. Лизировать клеточную гранулу путем добавления 100 мкл буфера для лизиса RIPA, содержащего ингибиторы протеазофосфатазы, в течение 5 минут на лед. Перенесите лизат в пробирку объемом 2 мл, центрифугируйте при 15 000 × г в течение 15 мин и переложите надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 2 мл.
   7. Измерьте концентрацию белка в клеточном лизате с помощью набора для анализа бицинхониновой кислоты (BCA).
   8. Добавьте 70 г белка из клеточного лизата из каждого образца, добавьте 2x буфер для образцов Laemmli с добавлением 10% 2-меркаптоэтанола и кипятите образцы при 100 °C в течение 5 минут для денатурации образцов.
2. Гель-электрофорез и мембранный перенос
   1. Приготовьте 8% полиакриламидный гель додецилсульфата натрия (SDS) с использованием дистиллированной воды (4,7 мл), 30% акриламида (2,7 мл), 1,5 М трис-буфера, pH 8,8 (2,5 мл), 10% додецилсульфата натрия (0,1 мл), 10% персульфата аммония (100 мкл) и TEMED (10 мкл).
   2. Пропустите 70 мкг денатурированных образцов в 8% гель SDS-полиакриламида при 80 В в течение 20 мин и при 120 В в течение 100 мин.
   3. Перенесите белок на геле на мембрану из поливинилиденфторида (PVDF) при напряжении 100 В в течение 90 минут.
   4. После переноса заблокируйте мембрану 7% обезжиренным молоком, разведенным в буфере TBS-T (20 мМ Tris pH 7,6, 140 мМ NaCl, 0,2% Tween-20) на 1 ч.
3. Инкубация антител
   1. Инкубируйте заблокированную мембрану с мышиным антиэпидермальным рецептором фактора роста (EGFR) и моноклональными антителами кролика против рецептора эндотелиального фактора роста (VEGFR) (разведенными в соотношении 1:1000 в 7% обезжиренном молоке) в течение ночи при 4 °C.
   2. После инкубации тщательно промойте мембрану трис-буферным физиологическим раствором (TBS-T) буфером (20 мМ Tris pH 7,6, 140 мМ NaCl, 0,2% Tween-20) в течение 7 минут и повторите 4 раза.
   3. Инкубируйте мембрану с HRP-конъюгированным вторичным антителом (разведенным в соотношении 1:4000 в 7% обезжиренном молоке (TBS-T)) в течение 1 ч.
   4. После инкубации тщательно промойте мембрану буфером TBS-T в течение 7 мин и повторите 4 раза.
4. Обнаружение белка
   1. Инкубируйте мембрану в хемилюминесцентном субстрате HRP, приготовленном путем смешивания 1 мл раствора перекиси субстрата HRP с 1 мл реагента Luminol для субстрата HRP (оба реагента входят в комплект хемилюминесцентного субстрата) в течение 2 мин.
   2. Визуализируйте мембрану с помощью системы визуализации.

2. Подготовка клеток-мишеней

1. Культивируйте целевые Т-клетки, клетки BHT-101 и SW-1736 экспоненциально до 80% конфлюентности в средах RPMI с добавлением 10% FBS, 1% L-глутамина и 1% антибиотиков (пенициллин-стрептомицин) в колбах с Т-75.
2. После удаления носителя промойте клетки один раз с помощью PBS. Инкубируйте клетки с 1 мл неферментативного буфера для диссоциации клеток в течение 5 минут, чтобы вытеснить адгезивные клетки. Добавьте PBS, чтобы остановить реакцию неферментативного буфера для диссоциации клеток. Уменьшите количество клеток при 135 × г в течение 5 минут и добавьте 5 мл PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы используем неферментативный буфер для диссоциации клеток для сохранения целостности поверхностного белка мембраны.
3. Подсчитайте клетки и засейте их в 15 000 ячеек/лунок в 96-луночные микропланшеты из белого полистирола с прозрачным плоским дном.

3. Получение различных концентраций терапевтического антитела

1. Чтобы следовать этому протоколу, используйте цетуксимаб (химерное антитело против EGFR) для связывания с EGFR и используйте бевацизумаб (гуманизированное антитело против VEGF-A) в качестве отрицательного контроля.
2. Приготовьте буфер для биоанализа ADCC, добавив 1,4 мл сыворотки с низким содержанием IgG в 33,6 мл RPMI-1640 (входит в комплект).
3. Используйте буфер ADCC Bioassay для разведения антител. Приготовьте по 400 мкл каждого антитела в трех различных концентрациях: 30 мкг/мл, 3 мкг/мл и 0,3 мкг/мл (3-кратная концентрация), чтобы получить конечную концентрацию 10 г/мл, 1 мкг/мл и 0,1 мкг/мл для широкого спектра охвата и определения оптимальной дозы.
   Примечание: Конечные концентрации антител основаны на 25 мкл культивируемых клеток-мишеней, 25 мкл эффекторных клеток и 25 мкл антител в каждой лунке 96-луночного планшета.

4. Подготовка эффекторных клеток

1. Перед использованием эффекторные клетки храните при температуре -80 °C.
2. Перед использованием нагрейте буфер для биотестирования ADCC на водяной бане при температуре 37 °C не менее чем на 30 минут.
3. Разморозьте клетки ADCC Bioassay Effector при температуре -80 °C, поместив их на водяную баню при температуре 37 °C (примерно 2-3 минуты). Аккуратно покачивайте и визуально осматривайте флакон, но не переворачивайте его в процессе размораживания.
4. Перенесите 630 мкл эффекторных клеток в пробирку объемом 15 мл, содержащую 3,6 мл буфера для анализа ADCC. Хорошо перемешайте, аккуратно перевернув трубку в 2 раза.

5. Инкубация эффекторных клеток с антителами и клетками-мишенями

1. После ночной инкубации удалите среду из клеток-мишеней (15 000 раковых клеток на лунку) и добавьте 25 мкл буфера ADCC Bioassay и 25 мкл цетуксимаба (антагониста EGFR) и бевацизумаба (антагониста VEGF), чтобы получить конечную концентрацию 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл или 10 мкг/мл клеток-мишеней в каждой лунке в соответствии с рисунком 2.
2. Добавьте 75 000 эффекторных клеток в 25 мкл буфера для биоанализа ADCC на лунку в 96-луночный микропланшет, содержащий клетки-мишени. Лунки, помеченные как No mAb, действуют как контроль антител (Рисунок 2).
3. Добавьте буфер ADCC Bioassay в лунки с маркировкой AB (буфер ADCC Bioassay) для контроля заготовок.
4. Выдерживаем тарелку в течение 6 ч.

6. Количественное считывание активности ADCC

1. Приготовьте реагент для анализа люциферазы за 4 ч до измерения, добавив буфер для анализа люциферазы в субстрат для анализа люциферазы (лиофилизированный).
2. После 6 ч инкубации клеток-мишеней, антител и эффекторных клеток добавьте 75 мкл реагента для анализа люциферазы в каждую лунку и инкубируйте в течение 30 мин.
3. После инкубационного периода измерьте сигнал люминесценции в каждой лунке с помощью люминометра, обеспечивающего количественное считывание активности ADCC.
4. Для анализа данных рассчитайте индукцию сгибания следующим образом:
   Индукция складчатости = RLU (индуцированное антитело - фон) / RLU (контроль антител отсутствует - фон).
   где RLU — единицы относительной люминесценции; Антитела индуцируются лунками от B3 до B8 и от C3 до C8; Контроль антител отсутствует = В2 и С2; Фон = Среднее значение RLU от скважины A2 до A5 (Рисунок 2).

Результаты

Экспрессия EGFR и VEGFR в клетках-мишенях BHT-101 и SW-1736 была обнаружена с помощью вестерн-блоттинга. Экспрессия EGFR была обнаружена в клетках BHT-101 и SW-1736, но не экспрессия VEGFR (рис. 3).

Используя набор для биотестирования ADCC, мы обнаружили реакцию ADCC ...

Обсуждение

Здесь мы представили метод биотестирования ADCC для оценки реакции ADCC терапевтического антитела. Метод прост и использует простой формат «добавление-микширование-чтение» для измерения.

Перед проведением эксперимента экспрессия целевого антигена в кл?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054	Dilute 10x in PBS to make 0.05% Trypsin
1x Tris Buffer Saline (TBS)	1st BASE	BUF-3030-1X1L	For membrane washing in western blotting
1.5 M Tris Buffer, pH 8.8	1st BASE	BUF-1419-1L-pH8.8	For SDS gel preparation
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M7522-100ML	For sample preparation of western blotting
30% Acrylamide/Bis solution	Bio-Rad	#1610158	For SDS gel preparation
4x Laemmli Buffer	Bio-Rad	#1610747	For sample preparation of western blotting
96-well white polystyrene microplate with clear flat bottom	Corning Incorporated	3610	For ADCC assay
ADCC Bioassay Effector cells (0.65 mL)	Promega	G7011	Includes in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 1 vial
ADCC reporter bioassay core kit	Promega	G7010	Mentioned as ADCC bioassay kit for ADCC assay in this experiment
Ammonium Persulfate	Sigma Aldrich	A3678-25G	For SDS gel preparation
Bevacizumab (Humanized Anti VEGF-antibody)	MVASI	-	Use as negative control antibody in ADCC asssay
BHT-101	Leibniz Institute DSMZ	ACC279	Human anaplastic papillary thyroid cancer cell line
Bio-Glo Luciferase Assay Buffer	Promega	G7941	Includes in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 10 mL
Bio-Glo Luciferase Assay Substrate (Lyophilized)	Promega	G7941	Includes in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 1 vial
Cell scraper	GenFollower	GD00235	To remove cell from culture flask
Cetuximab (Chimeric anti-EGFR antibody)	ERBITUX	-	Use as therapeutic antibody in ADCC assay
Chemiluminescent HRP substrate	Merck Millipore	WBKLS0500	For protein detection in western blotting
Distilled water	Gibco	15230-162	For SDS gel preparation
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106	Culture media supplement
iBright CL1500 imaging system	Thermo Scientific	2462621100038	For protein detection in western blotting
L-glutamine, 200 mM	Gibco	25030-081	Culture media supplement
Low IgG Serum	Promega	G7110	Includes in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 4 mL
Megafuge 8R	Thermo Scientific	42876589	Centrifuge
Mouse anti-EGFR monoclonal antibodies	BD Biosciences	610016	Primary antibody in western blotting
Mouse anti-VEGFR monoclonal antibodies	BD Biosciences	571194	Primary antibody in western blotting
non-enzymatic cell dissociation buffer	Sigma Aldrich	C5789-100ML	For cell harvesting from T75 flask
Penicillin-Streptomycin	PAN Biotech	P06-07100	Antibacterial for culture media
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.2, Sterile filtered	1st BASE	CUS-2048-1x1L	Use as washing solution for cells
Pierce BCA assay kit	Thermo Scientific	23225	To measure protein concentration
Protease and phosphatase inhibitor	Thermo Scientific	A32959	For protein digestion in sample preparation for western blotting
PVDF membrane (Immobilin-P)	Merck Millipore	IPVH00010	For protein transfer in western blotting
Rabbit anti-mouse IgG, Fcγ HRP-conjugated secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	315-035-046	Secondary antibody in western blotting
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium	Capricorn Scientific	RPMI-XA	Cell culture media
RPMI-1640	Promega	G7080	Includes in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 36 mL
Skim milk powder	Merck Millipore	70166-500G	For membrane blocking in western blotting
Sodium Dodecyl Sulfate	1st BASE	BIO-2050-500g	For SDS gel preparation
SW-1736	Cytion	300453	Human thyroid squamous cell cancer cell line
T75 culture flasks	SPL Lifesciences	70075	Cell culture flask
Tecan Multimode Reader model Spark 10M	Tecan	1607000294	for luminicence quantification
TEMED	Bio-Rad	#1610801	For SDS gel preparation
Tween-20	Promega	H5151	For membrane washing in western blotting
Vi-cell XR cell viability analyzer	Beckman Coulter	AL15072	Cell counter