急性自体肺栓塞的猪模型

摘要

本研究提出了一种猪肺栓塞 （PE） 模型，该模型使用复制急性中危 PE 的大自体栓子。该模型非常适合评估病理生理学和治疗反应。

摘要

急性肺栓塞 （PE） 是一种可能危及生命的疾病，会导致肺动脉突然阻塞，从而导致急性右心衰竭。新的诊断方法和导管导向疗法正在迅速发展，显然需要一种可用于病理生理学评估和临床前测试的逼真的 PE 动物模型。

该方案引入了一种采用大自体肺栓塞的猪模型。使用微创技术进行器械检查，创建一个封闭胸部模型，能够以高重现性研究各种治疗方案。在体外抽血产生自体栓子后 3 小时 ， PE 的诱导导致平均肺动脉压 （17 ± 3 mmHg 至 33 ± 6 mmHg，p < 0.0001）和心率 （50 ± 9 次·^min-1 至 63 ± 6 次·^min-1，p < 0.0003）立即升高，伴有心输出量减少 （5.0 ± 0.8 L/min 至 4.5 ± 0.9 L/min， p < 0.037）。CT 肺血管造影显示多发栓子，肺梗阻百分比与基线相比增加 （0% [0-0] 至 57.1% [38.8-63.3]，p < 0.0001）。在急性期，表型与中等风险 PE 相当。

该模型代表了中度风险 PE 的现实且特征明确的表型，并为测试新的诊断方法、介入和药物治疗以及为医护人员提供介入手术实践培训创造了机会。

引言

急性肺栓塞 （PE） 是心血管死亡的第三大常见原因，也是静脉血栓栓塞 （VTE） 的一种表现¹。VTE 的发病率在每年每 100,000 人 75 至 269 人之间，并且随着² 岁而增加。初始幸存者面临 30 天的死亡风险，低风险患者的死亡风险为 0.5%，高危患者的死亡风险高达 22%³。死因是右心室 （RV） 衰竭，主要发生在数小时内 ^4,5。即使患者存活下来，仍然存在严重并发症和慢性疾病的风险。

疾病急性期的治疗选择包括外科取栓术、基于导管或全身溶栓、低分子肝素和口服抗凝剂¹。治疗选择的数量和种类正在扩大，用于诊断和严重程度评估的新技术和方法也在不断开发。在进行临床研究之前，必须在可重复和一致的设置中确定可行性和安全性，就像在动物模型中一样。此外，研究 PE 的急性病理生理学需要具有接近人类心血管和肺生理学的动物模型。已经开发了啮齿动物和大型动物（即猪）的模型⁶。大型动物模型的优势在于可以使用临床技术并评估临床实践中使用的设备和手术干预。然而，这些模型中的大多数使用人造材料，例如塑料球或闭塞气球，或者需要大型侵入性肺动脉束带手术来模拟急性右心衰竭 ^7,8,9。一项研究使用下腔静脉滤器在原位产生血栓形成 ¹⁰。然而，这很耗时，而且凝块负荷很难控制。其他研究在体外产生了自体栓子，但 PE 的大小较小^11,12。因此，这些模型可能不适合测试介入手术。

需要一种可以复制 PE 人类病理学的动物模型。根据我们小组 13,14,15,16 之前进行的研究，我们旨在提出急性 PE 的猪模型。

研究方案

这项研究是经丹麦动物检查局（许可证号 2021-15-0201-00944）批准进行的，并符合丹麦和大学关于实验动物福利和道德的指导方针。

注意：本研究遵循 ARRIVE 指南 2.0¹⁷。通过反复评估每只动物作为自己的控制，尊重 3R（替换、减少和精炼）的原则，从而减少所需的动物数量并最大限度地收集信息。该动物模型中使用的猪是 60 公斤的丹麦母猪 （约克郡、杜洛克和丹麦长白的杂交品种）。所有猪都遵循丹麦无特定病原体 （SPF） 计划。研究前一周，猪在研究农场进行了环境适应，以训练人类接触。这些猪被关在有实心混凝土地板和稻草垫料的围栏里。每个笔的尺寸为 2.35 m x 2.9 m，相邻的笔允许鼻子接触。猪可以自由饮水，每天喂食两次常规猪粮，添加甜菜丝以减少体重增加。马厩有一个 12：12 h 的明暗循环（从早上 6 点到下午 6 点开灯）。

1. 麻醉、插管和通气

1. 用肌内注射 （0.1 mL/kg） 对猪进行预麻醉，该注射由 2.5 mL 平他明 （25 mg/mL）、2.5 mL 唑拉西泮 （25 mg/mL）、2.5 mL 布罗啡醇 （10 mg/mL）、1.25 mL 氯氨基酚 （100 mg/mL） 和 6.25 mL 甲苯噻嗪 （20 mg/mL） 组成，以减少动物在从动物饲养设施运输之前的潜在疼痛、压力和焦虑。
2. 将动物放在经批准的带有麦秸垫料的运输箱中运输。
3. 到达时建立静脉通路。
   1. 在耳朵的近端放置止血带并轻轻收紧以获得静脉血瘀。用乙醇棉签对静脉皮肤进行两次消毒。
   2. 使用 20 G 静脉导管穿刺静脉。松开止血带。小心地正确固定通道以避免移位。
   3. 用等渗盐水冲洗通路，检查位置是否正确。
      注意：如果导管不再在静脉中，则会出现皮下隆起。在对侧耳建立第二个静脉通路可被视为一种意外情况。
4. 将动物移至手术台并仰卧放置。
5. 使用带有 7.5 号气管插管的直接喉镜对猪插管，并给气管套囊充气。将管子固定在动物的鼻子/头部。这将防止意外拔管。通过观察呼吸机屏幕上的呼气二氧化碳值来检查导管位置是否正确。
6. 将管子连接到预先测试的呼吸机并开始机械通气。
   1. 选择压力控制、容量门控通气设置，并将潮气量 （TV） 设置为 8 mL/kg，低流量通气。将呼气末正压 （PEEP） 设置为 5 cmH₂O。
   2. 根据实验方案，将吸入氧的分数 （FiO₂） 设置为常氧 （0.21） 或更高。目标呼气末二氧化碳 （EtCO₂） 值约为 5.0-5.5 kPa。调整呼吸频率 （RR） 以达到此目的。
7. 使用 4.0 mg/kg/h 的异丙酚和 12.5 μg/kg/h 的芬太尼通过耳内静脉通路启动和维持全身麻醉。检查角膜反射是否缺失和对疼痛刺激的反应，以确保给予足够的麻醉。如果存在反射或反应，请增加输注速度，并定期检查反射。
   注意：在实验方案期间的任何时候都不要让动物无人看管。避免使用神经肌肉阻滞剂，因为它们可能会掩盖麻醉不足的迹象。
8. 连接 3 导联心电图 （ECG） 导线和脉搏血氧饱和度传感器，以监测心率、心律和血氧饱和度。
9. 使用直肠温度计监测核心温度。目标猪的正常温度为 38-39 °C。 如有必要，使用强制空气加热毯加热动物。
10. 插入膀胱导管，并将外端连接到尿液样本袋。
11. 涂抹兽医眼膏以防止干燥。

2. 超声引导下的血管内通路

注意：血管内通路如前所述建立¹⁸.

1. 至少在右侧颈外静脉、右侧股静脉和左侧股动脉建立血管内通路。
   注意：根据实验方案，可以获得进一步的访问。
   1. 用洗必泰剃须和消毒皮肤。
   2. 在无菌手术下，使用超声设备将 17 G 静脉导管引导至血管内位置。
   3. 从静脉导管中取出针头，并使用 Seldinger 技术插入导丝。取出静脉导管，将导丝留在原位。
   4. 在接入点，在皮肤上切一个小切口，然后将护套插入导丝上。
   5. 为确保护套的正确放置，请使用 10 mL 或 20 mL 注射器从每个护套中抽血。正确放置的护套在抽吸血液或用生理盐水冲洗通路时不会产生阻力。
2. 将鞘缝合到皮肤上（尺寸 4.0）。
3. 将股动脉中的鞘连接到压力传感器。校准大气压并观察筛查以获得正确的动脉压曲线。
4. 将带有等渗盐水的输液泵连接到静脉鞘。这可以防止腔内血液凝固。
5. 为了抵消实验前空腹引起的低血容量并抽血产生栓子，请在 30-60 分钟内开始在连接到右颈外静脉的泵上推注 800 mL。
6. 为了纠正每小时因出汗和排尿而流失的液体，开始以 4 mL/kg/h 的速度输注连接到股静脉的泵。

3. 凝块形成

1. 打开心肺氧合系统的包装，找到外径和内径分别为 1/2 英寸和 3/32 英寸的非肝素涂层聚氯乙烯 （PVC） 管。切成 ~30 厘米长的块。总共制作七根管子。
   注意：如果首选较薄的栓子，可以使用任何较小直径的 PVC 管。
2. 用大止血钳关闭管子的一端。
3. 在其中一个静脉鞘上暂停等渗盐水输注，并抽取总共 180 mL 的血液。
4. 将血液分成 6 个 PVC 管 （30 mL x 6），然后用另一个止血钳关闭 PVC 管的顶部。在室温 （RT） 下垂直悬挂管子至少 3 小时（图 1A）。
5. 冲洗护套中的盐水，然后重新开始盐水输注。

4. 透视引导下插入 26 F 护套

注意：使用透视时，应佩戴防护装备，例如铅围裙和甲状腺项圈，以防止电离辐射。

1. 暂停连接到右颈外静脉鞘的输液泵。
2. 将一根超硬的长导丝穿过护套。使用透视观察离开护套的导线。在透视引导下，将导丝推进，尾部穿过上中央静脉、上腔静脉 （SVC）、右心房 （RA），进入下腔静脉 （IVC）。
   注意：当导线穿过 RA 时，可能会发生过早的收缩事件。推进电线时，任何时候都不应感觉到阻力。
3. 慢慢提取护套，同时通过透视观察导丝留在 IVC 中。缩回护套时，用无菌餐巾纸压缩入口点。
4. 使用 Seldinger 技术将护套更换为 16 F 扩张器。如果阻力太大，请延长皮肤切口。在透视引导下将鞘推进静脉循环。用盐水预浸泡以尽量减少阻力（图 2B）。
   注意：使用扩张器遵循导丝的路线并确保扩张器不偏离导丝，从而不偏离血管腔，这一点非常重要。
5. 使用 Seldinger 技术将 16 F 扩张器换成 26 F 护套。将皮肤切口延长至少 10 毫米。在透视的引导下，缓慢推进 26 F 护套，穿过大静脉，直到护套尖端，由不透射线标记（不是扩张器）指示，到达 SVC（图 2D）。穿过肌肉层时，预计会有一些阻力。
   注意：如果阻力太大，可以缩回鞘，并做一个更大更深的切口，包括靠近入口点的肌肉组织。
6. 在透视的引导下，小心地将扩张器和导丝从猪中缩出，同时确保护套保持在原位。
7. 抽血以确保护套仍在原位。用 90 mL 生理盐水冲洗，以确保冲洗整个护套。
8. 在护套的外端（和无菌窗帘下）放置一叠无菌餐巾纸，以将其抬高到心脏水平以上，并避免将血液重新填充到护套中（图 2C）。
9. 重新连接输液泵并恢复盐水输注。

5. 右心导管插入术

1. 用盐水冲洗 Swan-Ganz （SG） 导管的两个端口。检查球囊是否正确充气。
2. 将每个 SG 导管端口连接到 3 通或 4 通旋塞阀。将旋塞阀未使用的端口连接到压力传感器。每个旋塞阀的剩余端口稍后可用于中心静脉和肺动脉血气采样。
3. 通过将 SG 导管的远端端口保持在猪的腋中水平，将传感器重置至大气压。
4. 将 SG 导管插入 26 F 护套（图 2C）。
5. 使用透视观察 SG 导管的远端何时离开护套。观察球囊是否正确充气。通货膨胀应该是无阻力的。
   注意： 如果在护套内充气，球囊可能会损坏。所有手术均采用前后位片。切勿在球囊充气时缩回导管。这可能会导致球囊移位或损坏瓣膜和弦索。
6. 球囊充气后，缓慢地将球囊推进穿过中央静脉、RA、右心室 （RV），并进入主肺动脉 （MPA）（图 2E）。
7. 观察压力信号和压力曲线形状随着远端端口进入 RV 并再次进入 MPA 而变化。
   1. 确保压力信号从中心静脉循环中的 2-8 mmHg 变为收缩压和舒张压 RV 分别为 20-30 mmHg 和 0-5 mmHg。进入 MPA 时，确保收缩压为 25-35 mmHg，舒张压为 10-15 mmHg。
8. 给气球放气。通过使用透视并过度提供压力信号和曲线，确保 SG 导管仍在原位。
   注意：此时可以暂停实验。

6. 组装栓子输送装置（图 3）

注意：栓子装置由两部分组成，从这里称为 A 部分和 B 部分（图 3）。

1. 在无菌条件下，用集成的心脏停搏管和主动脉灌注插管打开心肺氧合系统的其余部分。
2. 从自体输血装置中，找到连接到心脏切开容器底部的 10 厘米长的硅胶管（3/8 英寸外径和 3/32 英寸内径）和连接到硅胶管的 3/8 至 1/4 英寸连接器件（图 3A）。
3. 将硅胶管切成两根大小相等的管子。暂时把没有连接器的那一半放在一边。
4. 找到 quick prime 行。从鲁尔锁端约 20 厘米处剪下线，并将快速素数线的开口端连接到连接器件的 1/4 英寸端（图 3A）。
5. 找到一个 3/8 英寸到 1/2 英寸的连接器。将其连接到硅胶管的开口端。A 部分现已完成（图 3A、C）。
6. 将硅胶管的剩余一半连接到主动脉灌注插管的远端。找到任何 3/8 英寸到 1/2 英寸的连接器并将其连接到硅胶管的开口端。B 部分现已完成（图 3B，C）。

7. 基线评估

注意：在仪器化后和基线评估之前实现血流动力学稳定很重要。建议采取以下措施。基线测量的范围可以根据具体方案进行调整。

1. 记录体循环动脉和肺动脉压以及中心静脉压的值。
   注意：可接受的肺动脉压是收缩压< 40 mmHg，平均肺动脉压 （mPAP） ≤ 20 mmHg。
2. 记录中央体温、外周血氧饱和度和心率。
3. 在呼吸器上，记录 FiO₂、EtCO₂、TV、分钟体积 （MV）、RR 和峰值压力 （Ppeak） 的值。
4. 从 SG 导管（混合静脉）的动脉鞘和远端（黄色）端口抽取 1 mL 血样用于血气分析。
   1. 如果存在，纠正任何电解质失衡和/或低血糖，以达到正常范围内的值。
5. 根据实验方案，在适合进一步分析的容器中抽取静脉血样本。
6. 通过 SG 导管进行热稀释来获得心输出量 （CO）。确保在 10% 的边距内获得 3 次测量值的平均值。
7. 通过 SG 导管获得肺毛细血管楔压 （PAWP）。

8. 凝块评估

注意：至少 3 小时后，栓子已准备好被诱导。PVC 管将包含形成的栓子和液体上清液。如果血液没有凝固，请再等待 30 分钟，然后再取出另一个栓子。

1. 取回一根含有完全形成的栓子的 PVC 管，轻轻地将栓子放在手术餐巾上，丢弃上清液。确保栓子在注射时感觉坚硬且稳定（图 1B）。

9. 诱发急性肺栓塞（图 4）

1. 将一袋 1000 mL 等渗盐水放入加压输液袋中。插入输液器并将压力袋充气至至少 200 mmHg（但不能超过推荐压力）。
2. 取栓子输送装置的一部分 A 并将其连接到 3 向旋塞阀的侧端口（图 4A）。
3. 将最后一根 PVC 管连接到 A 部分的开口端。
4. 将一个栓子放入管中，并用生理盐水填充系统（图 4B）。
5. 将 B 部分连接到 PVC 管的另一端（图 4C）。
   注意：确保整个系统都装满了盐水。
6. 将栓子装置插入 26 F 护套中，并通过打开加压盐水流约 5 秒来注入栓子（图 4D）。
   注意：仔细观察栓子注射前后的重要参数。如果未观察到反应，栓塞可能仍在传输中，并额外冲洗生理盐水 3 秒。

10. 急性 PE 模型（图 5 和 图 6）

1. 诱导栓子，直到 mPAP 从基线翻倍或直到所有 6 个栓子都被诱导。监测血流动力学反应并等待稳定后再诱导另一个栓子。
   注意：猪在栓子诱导过程中可能会变得血流动力学不稳定。如果平均体循环动脉压降至 50 mmHg，则可能需要推注 0.02 mg 去甲肾上腺素。如果需要，重复推注。
2. 注射合适数量的栓子后，猪可稳定 30 分钟。
   注意：PE 的表现是一种高动力病症。因此，mPAP 在进行第 11 节之前应处于平台期。

11. 血流动力学

1. 稳定 30 分钟后，根据第 7 节中进行的基线评估进行急性 PE 评估。
2. 根据协议，现在可以开始干预。

12. 计算机断层扫描肺血管造影 （CTPA）（图7）

注意：根据科学范围，可以排除协议的这一部分。

1. 在插管和麻醉的同时，将猪连接到可移动的机械呼吸机，并将猪运送到 CTPA 设施。
2. 作为基线评估的一部分，在 PE 诱导前在吸气屏气期间进行 CTPA。
   1. 使用 120 KV 的自动曝光控制，准直设置为 0.5 x 80 mm。
   2. 通过自动注射泵通过耳静脉，以 0.5 mL/s 的流速注入 75 mL Iomeron 造影剂溶液 （350 mg/mL），然后以 3.0 mL/s 的速度注射 30 mL 生理盐水。
3. 将清管器运回作室并继续执行协议。
4. PE 诱导后，重复步骤 12.1-12.2 进行 PE 评估。

13. 其他方法

1. 根据科学工作的范围，对猪进行相应的评估。
   注意：许多评估方法（本协议中未详细描述）可以应用于模型中：磁共振成像、经食管超声心动图、双心室压力容积回路记录、生化、 离体生理学和组织学分析已在以前的工作中使用^{13、14、15、16、18、19、20}。

14. 安乐死和尸检

1. 在方案结束时，用致死剂量的戊巴比妥（1.5 mL/kg、400 mg/mL）对猪实施安乐死。
   注意：根据方案，可以进行尸检，并获得组织学取样（图 8）。

结果

在先前研究中包含的猪的汇总分析中，我们提出了表征本协议中描述的急性 PE 模型的结果^15,16。2 头猪死于 PE 后的急性右心衰竭。我们总共纳入了 24 头猪。

血 流 动力学
每个栓子后的反应在 图 5 中很明显。PE 的诱导 （5 ± 1） 导致 mPAP （17 ± 3 mmHg 至 33±6 mmHg，p < 0.0001?...

讨论

本文描述了一种使用自体栓子的急性、中等风险 PE 猪模型，该模型具有微创且可重复的特点。

该协议中有一些关键步骤。首先，右颈外静脉通路的扩张对模型至关重要，因为它是栓子的入口。推进大护套时，必须在连续透视下坚持硬丝的引导，以防止主要血管或右心腔破裂或夹层。如果遇到阻力，请不要施加过大的压力，而是更换电线并确保通道的...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12L-RS	GE Healthcare Japan	5141337	Ultrasound probe
50 mL BD Luer-Lock	BD Plastipak	300865
Adhesive Aperature Drape (OneMed)	evercare	1515-01	75 cm x 90 cm (hole: 6 cm x 8 cm)
Alaris GP Guardrails plus	CareFusion	9002TIG01-G	Infusion pump
Alaris Infusion set	BD Plastipak	60593
Alcohol swap	MEDIQ Danmark	3340012	82% ethanol, 0.5% chlorhexidin, skin disinfection
Amplatz Support Wire Guide Extra-Stiff	Cook Medical	THSF-25-260-AES	diameter: 0.025 inches, length: 260 cm
Aortic Perfusion Cannula	Edwards Lifesciences	AA024TFTA	Size: 24F. Length: 30 cm.
BD Connecta	BD	394601	Luer-Lock
BD Emerald	BD	307736	10 mL syringe
BD Platipak	BD	300613	20 mL syringe
BD Venflon Pro	Becton Dickinson Infusion Therapy	393204	20 G
BD Venflon Pro	Becton Dickinson Infusion Therapy	393208	17 G
Butomidor Vet	Richter Pharma AG	531943	10 mg/mL
Chlorhexidine 0.5%	Meda AB	N/A
Cios Connect S/N 20015	Siemens Healthineers	N/A	C-arm
CP Oxygenation System Adult With Fusion and Cardioplegia 1/B	Medtronic	M450311W	Custom cardiopulmonary oxygenation system including a cardioplegia line.
D-LCC12A-01	GE Healthcare Finland	N/A	Pressure measurement monitor
Durapore	3M	N/A	Adhesive tape
E-PRESTIN-00	GE Healthcare Finland	6152932	Respirator tubes
Euthanimal	Alfasan	136278	Pentobarbitalnatrium 400 mg/mL (0.5 mL/kg for euthanasia)
Favorita II	Aesculap	GT104
Fentanyl	B. Braun	71036	50 µg/mL
Glucose isotonic	SAD	419358	55 mg/mL Isotonic glucose (500 mL bag)
Gore DrySeal Flex Introducer Sheath	GORE	DSF2633	Size: 26 French. Working length: 33 cm.
Ketaminol Vet	MSD/Intervet International B.V.	511519	100 mg/mL
Lawton 85-0010 ZK1	Lawton	N/A	Laryngoscope
Lectospiral	VYGON	1159.90	400 cm (Luer-LOCK)
MBH qufora	MBH-International A/S	13853401	Urine bag
Natriumchlorid	Fresenius Kabi	7340022100528	9 mg/mL Isotonic saline
Noradrenalin	Macure Pharma	425318	1 mg/mL
PICO50 Aterial Blood Sampler	Radiometer	956-552	2 mL
Portex Tracheal Tube	Smiths Medical	100/150/075	Cuffed Clear Oral/Nasal Murphy Eye
Pressure Extension set	CODAN	7,14,020	Tube for anesthetics, 150 cm long, inner diameter 0.9 mm
Propolipid	Fresenius Kabi	21636	Propofol, 10 mg/mL
Radiofocus Introducer II	Radiofocus/Terumo	RS+B80N10MQ	7 + 8F sheaths
Rompun Vet	Beyer	86450917	Xylazin, 20 mg/mL
Rüsch Brilliant AquaFlate Glycerine	Teleflex	178000	Bladder catheter, size 14
S/5 Avance	Datex-Ohmeda	N/A	Mechanical ventilator
Safersonic Conti Plus & Safergel	SECMA medical innovation	SAF.612.18120.WG.SEC	18 cm x 120 cm (Safersonic Sterile Transducer Cover with Adhesive Area and Safergel)
Standard Dilator	Cook Medical	G01212	Size: 16 French. Length: 20 cm.
Swan-Ganz CCOmbo	Edwards Lifesciences	744F75	110 cm
TruWave Pressure Monitoring Set	Edwards Lifesciences	T434303A	210 cm
Vigilance VGS Patient Monitor	Edwards Lifesciences	N/A
Vivid iq	GE Medical Systems China	Vivid iq
Zoletil 50 Vet (tiletamin 125 mg and zolazepam 125 mg)	Virbac	83046805	Zoletil Mix for pigs: 1 vial of Zoletil 50 Vet (dry matter); add 6.25 mL Xylozin (20 mg/mL), 1.25 mL ketamin (100 mg/mL) and 2.5 mL Butorphanol (10 mg/mL). Dose for pre-anesthesia: 0.1 mL/kg as intramuscular injection