5/6 大鼠使用中线剖腹手术进行 Sharp Bipolectomy 的肾切除术

摘要

本手稿介绍了在大鼠模型中通过中线剖腹手术进行锐利双波切除术进行 5/6 肾切除术的标准化方案，旨在通过肾实质缩小诱导肾功能不全状态，具有高度的方法精度和较低的技术错误风险。

摘要

慢性肾病 （CKD） 影响着全球超过 10% 的人口，全球人数超过 8 亿人。CKD 治疗的进步对患者的预后产生了重大影响。虽然在过去，CKD 通常被认为是死刑判决，许多患者死于终末期肾病的并发症，但现在随着透析和肾移植的出现，以及 SGLT2 抑制剂或非甾体盐皮质激素受体拮抗剂等新药物的发展，它越来越多地作为一种慢性病进行管理。

然而，对进一步探索病理生理过程和潜在治疗干预的需求仍然不断增长。可靠的生物模型在促进这项研究方面发挥着至关重要的作用。鉴于肾脏疾病的多面性，不仅包括细胞生物学，还包括血管显微解剖学和内分泌信号传导，合适的模型必须具有只有动物模型才能提供的生物学复杂性水平，这使得啮齿动物成为显而易见的选择。

因此，本手稿提供了一种复杂、系统的方案，用于通过中线剖腹手术和大鼠全肾切除术和部分肾切除术手术切除肾实质，用于生存和非生存应用。它强调了精确手术技术在确保一致和可靠结果方面的关键作用。该模型潜在应用的主要示例包括生物分子和药物研究以及创新术中成像模式的开发，例如高光谱成像，以客观地可视化和区分肾灌注不良。

引言

慢性肾病 （CKD） 是一种进行性疾病，影响着全球很大一部分人口。其特点是内分泌和滤过肾功能随着时间的推移逐渐丧失，导致体内废物和液体的积累和内分泌系统的失衡。最近的数据表明，全球 9.1% 至 13.4% 的人口（7 亿至 10 亿人）患有 CKD¹。CKD 的患病率随着年龄的增长而增加，在美国，约 34% 的 65 岁或以上人群受到影响，而 45-64 岁的人群为 12%，18-44 岁的人群为 6%²。

因此，CKD 是全球疾病负担和死亡率的重要贡献者。CKD 的早期发现和管理对于减缓其进展和降低并发症的风险至关重要，例如心血管疾病、贫血，以及最终导致终末期肾病，这需要透析或肾移植才能生存³。

在过去的几十年里，终末期 CKD 的治疗干预经历了显着的发展。从历史上看，终末期 CKD 的管理仅限于支持性护理，透析在 1960 年代成为一种维持生命的方式。从那时起，透析技术取得了重大进步，包括开发更具生物相容性的膜、改善血管通路以及腹膜透析的出现⁴。此外，肾移植已成为终末期 CKD 的最佳治疗方法，与透析相比，肾移植可提高生存率和生活质量⁵。然而，供体器官的短缺仍然是一个重大挑战，推动了对异种移植和再生医学方法等新策略的研究。此外，通过引入 etelcalcetide 等刺激钙剂，加强了终末期 CKD 相关并发症（如继发性甲状旁腺功能亢进症）的管理，这些药物可有效调节甲状旁腺激素水平⁶。

尽管取得了这些进步，但在对终末期 CKD 进展和相关合并症的分子机制的持续研究的推动下，对更有效和靶向治疗的追求仍在继续。因此，CKD 仍然是患者护理中的一个重要问题，促使对生物医学过程和治疗方法进行广泛研究的持续需求。稳健的生物模型对于促进此类研究至关重要。鉴于 CKD 的多面性，包括从细胞生物学到器官间内分泌信号传导、血管功能解剖学和流变学的各个方面，理想的模型必须具有只有全面的模式生物才能提供的生物学复杂性水平。因此，啮齿动物成为首选模型，因为它们能够有效地包含这些不同的生物维度。

5/6 肾切除术残余肾模型因其稳定诱导肾功能不全而成为大鼠和小鼠实验的 CKD 研究中的常见工具 7,8,9,10,11,12,13,14。这种模式需要切除一个完整的肾脏和另一个肾脏的 2/3。残肾的创建可以通过手术切除肾极来实现，称为极切除术模型，或通过结扎肾上段和下段肾动脉，导致极梗塞 7,15,16,17,18,19,20。

虽然这种 5/6 肾切除术模型与肺切除术是一种成熟的技术，但它仅作为具有背外侧腹膜后通路的透明且易于理解的方案引入²¹。这种通路对于仅在一侧缩小肾实质的单侧手术或时间距离为几天的两阶段手术可能是有利的，以提高动物的术后存活率²²。然而，与传统的外侧背侧腹膜后通路相比，使用中线剖腹手术具有明显的优势。

通过采用单个腹部中线切口，外科医生可以畅通无阻地进入整个腹腔，从而促进对腹腔内器官的全面探查和作。这个扩大的手术领域不仅简化了肾切除术手术，而且还能够同时执行特定实验方案可能需要的额外干预措施，例如输尿管手术，如结扎、切除或重建，这对于研究梗阻性尿路病的病理生理学可能是必不可少的。此外，这种方法允许同时切除或作其他腹部器官，例如肝脏、脾脏或胃肠道，从而将实验研究的范围扩大到多器官相互作用或全身性疾病模型。

此外，中线剖腹手术方法有助于构建回肠导管或新膀胱，这是一种涉及使用回肠一段创建尿流改道的外科手术，这在调查膀胱功能障碍或重建泌尿外科技术的研究中特别相关。这种将肾切除术与同一手术区域内的其他手术干预相结合的多功能性不仅简化了实验方案，而且最大限度地减少了对动物受试者的累积手术创伤和相关风险。因此，在单期双侧肾脏手术或同时进行其他腹腔内手术的情况下，通过中线剖腹手术进行腹侧入路应该是首选选择。

目前，没有描述这种手术策略的出版物或方案。因此，通过这项工作，我们的目标是提出通过大鼠中线剖腹手术进行肾切除和手术诱导 CKD 的详细程序指南，适用于生存和非生存研究。该实验模型创造了一个受监管的环境，有利于研究 CKD 的复杂动力学，模拟具有临床意义的情景。该协议是专门为说明手术技术而设计的。因此，干预是在非存活环境中对 10 只雄性大鼠的同质组进行的。由于没有有意义的理由与基线或替代干预措施进行比较，因此没有必要纳入对照组。5/6 肾切除术明确是指手术实质切除的范围。这当然转化为肾小球滤过率降低的功能降低。然而，确切的功能程度无法预测，但必须为每只动物单独测量，例如，如果需要，使用菊粉或 p-氨基马尿酸清除率^23,24。

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研究方案

本文件中概述的所有动物程序均在经认可的设施内进行，并已获得德国卡尔斯鲁厄巴登-符腾堡州委员会机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准 （35-9185.81/G-62/23）。实验动物的处理符合机构规程和德国动物福利立法，并遵守欧洲共同体理事会 （2010/63/EU） 制定的指导方针和 ARRIVE 指导方针。初始体重为 400 g 的雄性 Sprague Dawley 大鼠在 1 周的适应期后被利用。

1. 麻醉和镇痛

1. 用选择的药物麻醉大鼠模型。为了遵循此方案，用异氟醚进行挥发性镇静诱导，然后腹膜内注射 100 mg/kg 体重氯胺酮用于解离麻醉和 4 mg/kg 体重甲苯噻嗪。通过皮下注射 5 mg/kg 体重的卡洛芬来实现镇痛。
   注：详细的实验方案可在引用的文献²⁵ 中找到。
2. 通过在用手术钳进行脚趾捏试验期间寻找疼痛反射来确保足够的镇痛深度，并在手术过程中定期重新评估麻醉深度。
3. 在眼睛上涂抹眼用润滑剂以防止角膜干燥。

2. 程序准备

1. 准备手术部位所需的所有材料和仪器，包括聚丝结扎线、硅胶血管环、钝头套管夹、精制剪刀和镊子，以及切成 0.8 x 0.6 厘米小块的止血贴剂（图 1A-G）。准备啮齿动物手术暴露装置、加热垫和引用文献²⁵ 中规定的手术准备钩。
2. 剃掉所需通路的长度，用 70% 乙醇和碘基或氯己定基擦洗拭子以圆周运动交替进行三次擦洗对手术部位进行消毒，并通过吸入 100% 氧气实现适当的氧合使用新生儿面罩（图 1H-J）。用窗帘覆盖手术坐位外的身体其他部分，以避免污染。
   注意：用于获取图形图像的代表性动物没有被覆盖，以实现更好的解剖标志可视化。
3. 通过在所需的腹部长度 ~3 cm 的初始正中皮肤切口，然后沿白线稍小的筋膜切口进行正中小剖腹手术（图 1K-M）。
4. 使用手术敷料和手术准备钩实现肾脏的手术暴露（图 1N-O）。只能使用无创伤的准备工具（例如湿棉签或使用镊子或钝器覆盖夹的湿敷布）触摸肾实质。

图 1：实验仪器、材料和设置。 （A） 所需的手术器械;（B） 多丝结扎;（C） 硅胶血管环;（D） 精制剪刀。（E-G）止血贴切成 0.8 x 0.6 厘米的小块。（H-J）大鼠模型剃光并用面罩充氧。用于获取图形图像的代表性动物没有被覆盖，以便更好地进行解剖标志可视化。（K，L）所需腹部长度为 ~3 cm 的正中皮肤切口。（M） 正中小剖腹手术;（N） 使用手术敷布、手术准备钩和金属支架暴露左肾;（O） 右肾的类似暴露和 Gerota 筋膜的切除。 请单击此处查看此图的较大版本。

3. 肾部分切除术

1. 暴露相应的肾脏，抓住附着在薄 Gerota 筋膜上的肾周脂肪，并施加一些张力以局部将筋膜从肾实质上提起（图 2A、B.2）。
2. 用一把剪刀边缘的尖锐末端切开并破坏筋膜，并继续纵向解剖 Gerota's 筋膜（图 2B）。
3. 通过逐渐破坏薄壁组织周围的筋膜并将筋膜囊内侧折叠（可选地部分切除），使用闭合剪刀对 Gerota 筋膜进行钝性脱手套（图 2C）。
4. 使用硅胶血管环吊索肾门以改善血管控制（图 2D）。
5. 将镊子的尖端放入腹膜后间隙以稳定肾脏，以避免在切割过程中肾脏背侧逸出，并使用剪刀以一次精确的瞄准行程进行颅骨锐利的 1/3 肾脊髓切除术（图 2E）。
   注意：应通过临床评估选择夹层线，使其在器官高度的 1/3 处将颅部和尾部分开。
6. 通过贴上止血贴、手动按压、使用钝器进行压迫或通过硅胶血管环通过肺门张力实现止血，有效减少肺门血流量（图 2F-J）。
   注意：通过同时拉动血管环和应用止血贴剂 2.5-3 分钟来定期实现止血。
7. 随后以类似的方式进行尾部锐尖 1/3 肾砝切除术（图 2K-N）。对于两种剪刀式击打，瞄准一个略微成角的解剖平面，这将在肺门侧留下更多的肾实质，在外侧留下更少的组织，以避免意外的肺门损伤并减少骨盆腔胆系统的漏尿（图 2O）。如果需要更标准化的精确 5/6 实质切除，请称量下面进一步描述的对侧全肾切除术的切除物，称量 2/3 部分肾切除术的切除物，并以“萨拉米香肠切片”技术重复解剖，直到获得正好 2/3 的重量。

图 2：肾部分切除术。 （A） 一个肾脏的手术暴露。（B） 使用锋利的剪刀纵向切开 Gerota's 筋膜。（C） 使用封闭剪刀钝性脱手套 Gerota's 筋膜。（D） 使用硅胶血管环吊索肾门。（E） 使用剪刀和镊子作为引导的颅尖 1/3 波化切除术。（F） 通过贴止血贴实现止血;（G） 通过手动加压实现止血;（H-J） 通过使用钝器械进行压缩和通过硅胶血管环的肺门张力来实现止血。（K-N）尾尖 1/3 根毛切除术类比。 （O） 为避免意外肺门损伤（黑线）的推荐解剖平面的示意图。 请单击此处查看此图的较大版本。

4. 全肾切除术

1. 与上述步骤类似，动员肾脏，并使用钝头覆盖夹将肾门隧道化（图 3A，B）。
2. 使用聚丝结扎线吊索肾门，并在肾门上打一个安全的滑动结，而不是更靠近腹腔血管，以阻塞肾血流和输尿管（图 3C、D）。
3. 用剪刀尖锐地解剖肺门并去除肾脏（图 3E，F）。
4. 控制止血并切断结扎末端（图 3G-J）。

图 3：全肾切除术。 （A） 对侧肾的手术暴露;（B） 使用钝头覆盖夹类似地去除 Gerota 筋膜和隧道化肾门;（C） 使用聚丝结扎线吊索肺门。（D） 在肾门上放置滑动结扎线;（E，F） 用剪刀锐利地解剖肺门并切除肾脏;（G-I） 控制止血和切断结扎末端。（J） 推荐结扎高度（虚线）和解剖平面（黑线）的示意图。 请单击此处查看此图的较大版本。

5. 腹壁闭合

1. 使用聚丝缝合线将角缝合线放在腹部筋膜上（图 4A-D）。
2. 继续用连续缝合线缝合腹部筋膜，每次咬合抓住 ~2 毫米的组织，咬合之间约 4 毫米（图 4E-I）。
3. 使用单针缝合皮肤层，每次咬合 ~3 毫米的组织，咬合之间咬合 ~6 毫米（图 4J-Q）。

图 4：腹壁闭合。 （A-D） 使用聚丝缝合线在腹部筋膜上放置角缝合线。（E-I）腹筋膜的运行缝合;（JQ） 使用单针缝合皮肤层。 请单击此处查看此图的较大版本。

6. 进一步的步骤

1. 根据所需的情况、研究目的和所需的肾功能不全程度，考虑与该方案的偏差，包括切除的肾实质数量的变化，例如，单侧全肾切除术（3/6 肾切除术）、双侧全肾切除术（6/6 肾切除术）、单侧单体切除术（1/6 肾切除术）、双侧单体切除术（2/6 肾切除术）、单侧双极切除术（2/6 肾切除术）和双侧双极切除术（4/6 肾切除术）。
2. 一般来说，对于非存活应用，要么通过锐利心脏切除术对动物实施安乐死，而无需事先闭合腹壁，要么在计划进行后续生存实验的情况下如上所述进行逐步腹部闭合。
3. 在生存应用的情况下，在手术过程中始终保持无菌条件。手术前，使用磨砂膏（碘基或洗必泰基）和酒精在手术部位无菌准备皮肤。为每只动物使用一包新的高压灭菌器械。
4. 手术后，监测动物，直到它有足够的意识来维持胸骨斜躺并隔离它直到完全恢复。
5. 作为动物的术后治疗，包括通过医务人员进行日常访问以及使用皮下注射 5 mg/kg 体重卡洛芬的术后疼痛治疗，每天 2 次，持续 2 天。
6. 使用具有明确定义终止标准的评分表，直到术后完全恢复。使用引用文献中的大鼠鬼脸量表²⁶ 或身体状况评分²⁷ 。如果在使用卡洛芬后 Grimace 评分 ≥ 6 或身体状况评分 = 1，则终止实验。此外，如果出现手术并发症，例如术后伤口感染或腹壁闭合不全，则终止使用。

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结果

该方案在非存活环境中对 10 只雄性大鼠 （平均体重 398 ± 35 g） 进行，手术由一名三年级外科住院医师进行。以腹壁闭合后 20 min 以上的存活率定义为 100%。从皮肤切口到皮肤闭合的制备平均持续时间为 18 分 34 秒± 7 分 31 秒。

不幸的是，由于这份手稿的非生存性质，没有关于术后肾功能的数据。未来具有生存环境的动物研究应将实质丧失的程度与肾?...

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讨论

CKD 定义为肾损伤或肾功能下降至少 3 个月，无论原因如何^28,29。肾损伤包括自体或移植肾的病理异常，通过影像学检查、活检确定，或从尿白蛋白增加（白蛋白/肌酐比值> 30 mg/g 或 3.4 mg/mmol）或尿沉渣改变等临床标志物推断。肾功能下降意味着肾小球滤过率降低，这通常根据血清肌酐浓度估计。

根据美国疾...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
atraumatic preparation forceps	Aesculap	FB395R	DE BAKEY ATRAUMATA atraumatic forceps, straight
blunt overholt clamp	Aesculap	BJ012R	BABY-MIXTER preparation and ligature clamp, bent, 180 mm
cannula	BD (Beckton, Dickinson)	301300	BD Microlance 3 cannula 20 G
fixation rods	legefirm	‎500343896	tuning forks used as y-shaped metal fixation rods
heating pad	Royal Gardineer	IP67	Royal Gardineer Heating Pad Size S, 20 Watt
plastic perfusor tube	M. Schilling GmbH	S702NC150	connecting tube COEX 150 cm
polyfilament suture	Covidien	CL-769	Covidien Polysorb Braided Absorbable Suture 2-0 75 cm
preparation scissors	Aesculap	BC177R	JAMESON preparation scissors, bent, fine model, blunt/blunt, 150 mm (6")
sealing hemostat patch	Baxter	1506257	Hemopatch Sealing Hemopatch Baxter 45 x 90 mm
silicone vessel loop tie	SERAG WIESSNER	SL26	silicone vessel loop tie 2.5 mm red
Spraque Dawley rat	Janvier Labs	RN-SD-M	Spraque Dawley rat
steel plate	Maschinenbau Feld GmbH	C010206	Galvanized sheet plate, 40 x 50 cm, thickness 4.0 mm
Yasargil clip	Aesculap	FE795K	YASARGIL Aneurysm Clip System Phynox Temporary (Standard) Clip
Yasargil clip applicator	Aesculap	FE558K	YASARGIL Aneurysm Clip Applicator Phynox (Standard)