5/6 쥐에서 정중선 개복술을 통한 날카로운 양족 절제술을 사용한 신장 절제술

요약

본 원고는 랫트 모델에서 정중선 개복술을 통한 날카로운 양극절제술에 의한 5/6 신절제술을 위한 표준화된 프로토콜을 소개하며, 체계적인 정밀도가 높고 기술적 오류 위험이 낮은 신실질 절제술을 통해 신부전 상태를 유도하는 것을 목표로 합니다.

초록

만성 신장 질환(CKD)은 전 세계 인구의 10% 이상에 영향을 미치며, 전 세계적으로 8억 명 이상에 달합니다. 만성콩팥병 치료의 발전은 환자의 예후에 상당한 영향을 미쳤습니다. 과거에는 많은 환자들이 말기 신장 질환의 합병증으로 사망하면서 만성 질환으로 간주되는 경우가 많았지만, 이제는 투석 및 신장 이식의 가용성과 SGLT2 억제제 또는 비스테로이드 미네랄 코르티코이드 수용체 길항제와 같은 새로운 의약품 개발로 인해 만성 질환으로 관리되는 경우가 점점 더 많아지고 있습니다.

그러나 병태생리학적 과정과 잠재적인 치료 개입에 대한 추가 탐구에 대한 요구가 계속 증가하고 있습니다. 신뢰할 수 있는 생물학적 모델은 이 연구를 촉진하는 데 중요한 역할을 합니다. 세포 생물학뿐만 아니라 혈관 미세해부학 및 내분비 신호 전달을 포함하는 신장 질환의 다면적인 특성을 감안할 때, 적절한 모델은 동물 모델만이 제공할 수 있는 수준의 생물학적 복잡성을 가져야 하므로 설치류를 선택할 수 있어야 합니다.

따라서 이 원고는 생존 및 비생존 응용을 위해 쥐의 정중선 개복술과 전체 및 부분 신절제술을 통해 신장 실질을 외과적으로 줄이기 위한 복잡하고 체계적인 프로토콜을 제공합니다. 일관되고 신뢰할 수 있는 결과를 보장하는 데 있어 정밀한 수술 기술의 중요한 역할을 강조합니다. 이 모델의 잠재적인 응용 사례로는 생체 분자 및 제약 연구뿐만 아니라 신장 관류 주입을 객관적으로 시각화하고 구별하기 위한 초분광 이미징과 같은 혁신적인 수술 중 이미징 양식의 개발이 있습니다.

서문

만성 신장 질환(CKD)은 전 세계 인구의 상당 부분에 영향을 미치는 진행성 질환입니다. 시간이 지남에 따라 내분비 및 여과 신장 기능이 점진적으로 상실되어 신체에 노폐물과 체액이 축적되고 내분비계의 불균형이 발생하는 것이 특징입니다. 최근 데이터에 따르면 전 세계 인구(7억 명에서 10억 명 사이)의 9.1%에서 13.4%가 CKD¹을 앓고 있습니다. 만성콩팥병의 유병률은 나이가 들면서 증가하여 미국에서 65세 이상 인구의 약 34%가 45-64세의 경우 12%, 18-44세의 경우 6%에 비해 증가한다².

따라서 CKD는 전 세계 질병 부담 및 사망률에 크게 기여합니다. 만성콩팥병의 조기 발견 및 관리는 심혈관 질환, 빈혈, 그리고 생존을 위해 투석이나 신장 이식이 필요한 말기 신장 질환과 같은 합병증의 위험을 줄이고 진행을 늦추는 데 매우 중요하다³.

말기 만성콩팥병에 대한 치료적 개입은 지난 수십 년 동안 놀라운 발전을 거듭해 왔습니다. 역사적으로 말기 만성콩팥병의 관리는 지지적 치료에 국한되었으며, 1960년대에 투석이 생명 유지 방식으로 부상했습니다. 그 이후로 투석 기법이 크게 발전하여 생체적합성 멤브레인이 개발되고, 혈관 접근성이 개선되었으며, 복막 투석이 4. 또한, 신장 이식은 말기 만성콩팥병에 대한 최적의 치료법으로 부상하고 있으며, 투석에 비해 생존율과 삶의 질이 향상되었다⁵. 그러나 기증자 장기의 부족 현상은 여전히 중요한 과제로 남아 있으며, 이종 이식 및 재생 의학 접근법과 같은 새로운 전략에 대한 연구를 주도하고 있습니다. 또한, 부갑상선 호르몬 수치를 효과적으로 조절하는 에텔칼세타이드(etelcalcetide)와 같은 석회화제(calcimimetic agent)의 도입으로 말기 CKD 관련 합병증의 관리가 강화되었습니다⁶.

이러한 발전에도 불구하고, 말기 CKD 진행 및 관련 동반질환의 기저에 있는 분자 메커니즘에 대한 지속적인 연구에 힘입어 보다 효과적이고 표적화된 치료법에 대한 탐구는 계속되고 있습니다. 따라서 만성콩팥병은 환자 치료에서 중요한 관심사로 남아 있으며, 생물의학적 과정과 치료적 접근에 대한 광범위한 연구가 지속적으로 필요하게 되었습니다. 이러한 연구를 용이하게 하기 위해서는 강력한 생물학적 모델이 필수적입니다. 세포 생물학에서 기관 간 내분비 신호전달, 혈관 기능 해부학 및 유변학에 이르기까지 다양한 측면을 포괄하는 CKD의 다면적인 특성을 감안할 때, 이상적인 모델은 포괄적인 모델 유기체만이 제공할 수 있는 수준의 생물학적 복잡성을 가져야 합니다. 따라서 설치류는 이러한 다양한 생물학적 차원을 효과적으로 포괄할 수 있는 능력으로 인해 선호되는 모델로 부상합니다.

5/6 신절제술 잔여 신장 모델은 신부전증을 안정적으로 유도하기 때문에 쥐 및 쥐 실험을 위한 CKD 연구에서 일반적인 도구 역할을 합니다 7,8,9,10,11,12,13,14. 이 모델은 한쪽 신장 전체와 다른 쪽 신장의 2/3를 제거하는 것을 수반합니다. 잔여 신장의 생성은 극절제술 모델이라고 하는 신극의 외과적 절제술을 통해 달성되거나 상부 및 하부 분절 신장 동맥을 결찰하여 극 경색 7,15,16,17,18,19,20을 유발함으로써 달성될 수 있습니다.

족골 절제술을 이용한 이 5/6 신절제술 모델은 확립된 기술이지만, 배외측 후복막 접근을 통한 투명하고 이해하기 쉬운 프로토콜로만 소개되었습니다²¹. 이러한 접근은 한쪽에만 신장 실질이 감소하는 편측성 시술 또는 동물의 수술 후 생존을 증가시키기 위해 며칠의 시간적 거리를 두는 2단계 시술에 유리할 수 있다²². 그러나 정중선 개복술 접근법의 활용은 기존의 후방복막 접근 경로에 비해 뚜렷한 이점을 제공합니다.

단일 정중선 복부 절개를 사용함으로써 외과의는 전체 복강에 방해받지 않고 접근할 수 있으므로 복강 내 장기에 대한 포괄적인 탐색 및 조작을 용이하게 합니다. 이 확장된 수술 분야는 신장 절제술 절차를 간소화할 뿐만 아니라 폐쇄성 요로병증의 병태생리학을 연구하는 데 필수적일 수 있는 결찰술, 절제 또는 재건술과 같은 요관 시술과 같은 특정 실험 프로토콜에 필요할 수 있는 추가 중재를 동시에 실행할 수 있습니다. 또한 이 접근 방식은 간, 비장 또는 위장관과 같은 다른 복부 장기의 동시 절제 또는 조작을 허용하여 다중 장기 상호 작용 또는 전신 질환 모델로 실험 조사 범위를 확장합니다.

또한, 정중선 개복술 접근법은 회장 절편을 사용하여 요로 전환을 생성하는 수술 절차인 회장 도관 또는 신방광의 구축을 용이하게 하며, 이는 방광 기능 장애 또는 재건 비뇨기과 기술을 조사하는 연구와 특히 관련이 있습니다. 동일한 수술 분야 내에서 신장 절제술과 다른 외과적 중재를 결합하는 이러한 다양성은 실험 프로토콜을 간소화할 뿐만 아니라 동물 피험자에 대한 누적 수술 외상 및 관련 위험을 최소화합니다. 따라서 1단계 양측 신장 수술 또는 동시 추가 복강 내 시술의 경우 정중선 개복술을 통한 복부 접근이 선호되는 옵션이어야 합니다.

현재로서는 이 수술 전략을 설명하는 출판물이나 프로토콜이 없습니다. 따라서 이 연구를 통해 우리의 목표는 생존 및 비생존 연구 모두에 적용할 수 있는 쥐의 정중선 개복술을 통한 CKD의 신장 절제 및 수술 유도를 수행하기 위한 자세한 절차 가이드를 제시하는 것입니다. 이 실험 모델은 임상적으로 중요한 시나리오를 모방하여 CKD의 복잡한 역학을 조사하는 데 도움이 되는 규제된 환경을 조성합니다. 이 프로토콜은 수술 기법을 설명하기 위해 특별히 고안되었습니다. 따라서 중재는 10마리의 수컷 쥐로 구성된 동질적인 그룹에 대해 비생존 환경에서 수행되었습니다. 기준선 또는 대체 중재와 비교할 의미 있는 이유가 없었기 때문에 대조군을 포함할 필요가 없었습니다. 5/6 신절제술은 명시적으로 외과적 실질 절제술의 정도를 나타냅니다. 이것은 확실히 사구체 여과율의 감소라는 의미에서 기능적 감소로 해석됩니다. 그러나 정확한 기능 정도는 예측할 수 없으며 예를 들어 필요한 경우 이눌린 또는 p-아미노히푸르산 제거율^23,24를 사용하여 각 동물에 대해 개별적으로 측정해야 합니다.

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프로토콜

이 문서에 설명된 모든 동물 절차는 인가된 시설 내에서 수행되었으며 독일 칼스루에에 있는 바덴뷔르템베르크 지역 위원회의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다(35-9185.81/G-62/23). 실험 동물은 제도적 프로토콜과 동물 복지를 관리하는 독일 법률에 따라 처리되었으며 유럽 공동체 이사회(2010/63/EU) 및 ARRIVE 지침에서 정한 지침을 준수했습니다. 초기 체중이 400g인 수컷 Sprague Dawley 쥐는 1주일의 순응 기간 후에 활용되었습니다.

1. 마취와 진통제

1. 쥐 모델을 선택한 의약품으로 마취시킵니다. 이 프로토콜을 따르기 위해 이소플루란으로 휘발성 진정 유도를 수행한 후 해리성 마취를 위해 체중 케타민 100mg/kg을 복강내 주사하고 체중 자일라진 4mg/kg을 주사합니다. 체중 5mg/kg 카프로펜의 피하 주사로 진통을 달성합니다.
   참고: 자세한 프로토콜은 인용된 문헌²⁵에서 찾을 수 있습니다.
2. 수술용 겸자로 발가락 꼬집음 테스트 중 통증 반사를 찾아 적절한 진통 깊이를 보장하고 시술 중 마취 깊이를 정기적으로 재평가합니다.
3. 각막 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 윤활제를 바르십시오.

2. 수속 준비

1. 폴리필라멘트 합자, 실리콘 용기 루프, 무딘 오버홀트 클램프, 미세 준비 가위 및 집게, 0.8 x 0.6cm 조각으로 자른 지혈 패치를 포함하여 필요한 모든 재료와 도구로 작업 현장을 준비합니다(그림 1A-G). 설치류 수술용 노출 장치, 발열 패드 및 수술 준비 고리를 인용된 문헌²⁵에 명시된 대로 준비합니다.
2. 원하는 접근 길이를 면도하고, 70% 에탄올과 요오드 기반 또는 클로르헥시딘 기반 면봉을 원을 그리며 교대로 3회 교대로 스크럽하여 수술 부위를 소독하고, 신생아 안면 마스크를 사용하여 100% 산소를 흡입하여 적절한 산소 공급을 달성합니다(그림 1H-J). 오염을 방지하기 위해 수술 시트 바깥쪽의 나머지 신체를 커튼으로 덮으십시오.
   참고: 인물 이미지를 얻는 데 사용된 대표 동물은 더 나은 해부학적 랜드마크 시각화를 위해 드레이프되지 않았습니다.
3. 원하는 복부 길이 ~3cm에 대한 초기 정중 피부 절개를 통해 정중 미니 개복술을 수행하고 이후 알바 선을 따라 근막을 약간 더 작게 절개합니다(그림 1K-M).
4. 수술용 압박 붕대와 수술 준비 고리를 사용하여 신장을 외과적으로 노출시킵니다(그림 1N-O). 축축한 면봉이나 집게 또는 뭉툭한 오버홀트 클램프를 사용하여 축축한 압박감과 같은 외상성 준비 도구로만 신장 실질을 만지십시오.

그림 1: 실험 기구, 재료 및 설정. (A) 필요한 수술 기구; (B) 폴리필라멘트 합자; (C) 실리콘 용기 루프; (D) 미세 준비 가위. (예) 지혈 패치는 0.8 x 0.6cm 조각으로 자릅니다. (H-J) 쥐 모델은 면도하고 안면 마스크로 산소를 공급합니다. 인물 이미지를 얻는 데 사용된 대표 동물은 더 나은 해부학적 랜드마크 시각화를 위해 드레이프되지 않았습니다. (케이,엘) 원하는 복부 길이 ~3cm에 대한 중간 피부 절개. (M) 중앙 미니 개복술; (N) 수술용 압박붕대, 수술용 제제 고리 및 금속 스탠드를 사용하여 왼쪽 신장을 노출시키는 행위; (O) 우측 신장의 유사 노출 및 Gerota의 근막 절제술. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 부분 신장 절제술

1. 각각의 신장을 노출시키고, 얇은 Gerota의 근막에 부착된 신장 주위 지방을 잡고, 약간의 장력을 가하여 신장 실질에서 근막을 국소적으로 들어 올립니다(그림 2A, B.2).
2. 한쪽 가위의 가장자리의 날카로운 끝으로 근막을 절개하고 훼손하고 Gerota의 근막을 세로로 해부합니다(그림 2B).
3. 닫힌 가위를 사용하여 실질 주변의 근막을 점차적으로 약화시키고 근막 캡슐을 내측으로-선택적으로 부분적으로 절제하여 Gerota의 근막을 뭉툭하게 디글러빙합니다(그림 2C).
4. 혈관 조절을 개선하기 위해 실리콘 혈관 고리를 사용하여 신장문을 슬링합니다(그림 2D).
5. 집게의 끝을 후복막 공간에 삽입하여 신장을 안정시키고 절단 과정에서 신장이 등쪽으로 빠져나가는 것을 방지하고 가위를 사용하여 한 번의 정확한 조준 스트로크로 두개골 날카로운 1/3 신장 절제술을 수행합니다(그림 2E).
   참고: 박리선은 장기 높이의 1/3에서 두개골과 꼬리로 장기를 분리하도록 임상 평가를 통해 선택해야 합니다.
6. 지혈 패치를 적용하거나, 수동 압박을 하거나, 무딘 기구를 사용하여 압박하거나, 실리콘 혈관 루프를 통한 고구 장력을 통해 지혈을 달성하여 문턱 혈류를 효과적으로 감소시킵니다(그림 2F-J).
   참고: 지혈은 혈관 고리를 동시에 당기고 2.5-3분 동안 지혈 패치를 적용함으로써 정기적으로 달성되었습니다.
7. 이어서 유사한 방식으로 꼬리 날카로운 1/3 신장 절제술을 시행합니다(그림 2K-N). 두 가위뇌졸중 모두, 의도하지 않은 문턱 손상을 방지하고 골반계의 소변 누출을 줄이기 위해 문턱쪽에 더 많은 신실질을 남기고 측면쪽에 조직을 덜 남기는 약간 각진 해부면을 목표로 합니다(그림 2O). 정확한 5/6 실질 절제술의 더 높은 표준화가 필요한 경우, 아래에 자세히 설명된 반대쪽 신장 절제술의 전체 절제술의 무게를 측정하고, 부분 2/3 절제술의 절제물의 무게를 측정하고, 정확히 무게의 2/3를 얻을 때까지 "살라미 슬라이스" 기술로 해부를 반복합니다.

그림 2: 부분 신장 절제술. (A) 한쪽 신장의 외과적 노출. (B) 날카로운 가위를 사용하여 Gerota의 근막을 세로로 절개합니다. (C) 닫힌 가위를 사용하여 Gerota의 근막을 둔기로 장갑을 낀다. (D) 실리콘 혈관 고리를 사용하여 신장문을 슬링합니다. (E) 가위와 집게를 지침으로 사용하는 두개골 날카로운 1/3 극골 절제술. (F) 지혈 패치를 적용하여 지혈을 달성하는 것; (G) 수동 압박에 의한 지혈 달성; (H-J) 무딘 기구를 사용하여 압축하여 지혈을 달성하고 실리콘 용기 루프를 통해 힐라 장력을 얻습니다. (K-N) 비유하자면 꼬리 날카로운 1/3 극골 절제술. (O) 의도하지 않은 고문 손상(검은색 선)을 방지하기 위해 권장되는 해부 평면의 개략적 묘사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 전체 신장 절제술

1. 위에서 설명한 단계와 유사하게 신장을 동원하고 뭉툭한 오버홀트 클램프를 사용하여 신장 상문을 터널링합니다(그림 3A, B).
2. 폴리필라멘트 결찰자를 사용하여 신장막을 감고 신장혈관에 약간 더 가깝게 신장문에 안전한 슬라이딩 매듭을 놓아 신장 혈류와 요관을 막습니다(그림 3C, D).
3. 가위를 사용하여 신장을 날카롭게 절개하고 신장을 제거합니다(그림 3E, F).
4. 지혈을 조절하고 결찰 말단을 절단합니다(그림 3G-J).

그림 3: 신장 전절제술. (A) 반대쪽 신장의 외과적 노출; (B) 게로타(Gerota)의 근막(gerota's fascia)을 유사하게 제거하고 뭉툭한 오버홀트 클램프를 사용하여 신장 힐럼(renal hilum)을 터널링하는 것; (C) 폴리필라멘트 합자를 사용하여 힐럼을 슬링하는 단계. (D) 신장 고추에 슬라이딩 매듭 결찰자의 배치; (E,F) 가위를 사용하여 문골을 날카롭게 절개하고 신장을 제거하는 행위; (G-I) 지혈 및 합자 말단의 절단에 대한 제어. (J) 권장 합자 높이(점선) 및 해부 평면(검은색 선)의 개략적 묘사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 복벽 폐쇄

1. 폴리필라멘트 봉합사를 사용하여 복부 근막에 모서리 봉합사를 놓습니다(그림 4A-D).
2. 교합할 때마다 ~2mm의 조직을 잡고 교합 사이에 약 4mm를 꽉 쥐어 복근막을 계속 봉합합니다(그림 4E-I).
3. 씹을 때마다 ~3mm의 조직을 잡고 물린 부위 사이에 ~6mm를 꿰매어 단일 스티치를 사용하여 피부층을 봉합합니다(그림 4J-Q).

그림 4: 복벽 폐쇄. (A-D) 폴리필라멘트 봉합사를 사용하여 복부 근막에 모서리 봉합사 배치. (E-I) 복부 근막의 실행 봉합사; (J-Q) 단일 스티치를 사용하여 피부층을 봉합합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 추가 단계

1. 원하는 시나리오, 연구 목적 및 원하는 신부전 정도에 따라, 절제된 신실질의 양의 변화를 포함하여 이 프로토콜과의 편차를 고려하십시오(예: 편측 전체 신장 절제술(3/6 신장 절제술), 양측 전체 신장 절제술(6/6 신장 절제술), 편측 단극 절제술(1/6 신장 절제술), 양측 단장 절제술(2/6 신장 절제술), 편측 양측 절제술(2/6 신장 절제술) 및 양측 양측 절제술(4/6 신장 절제술).
2. 일반적으로 비생존 신청을 위해 사전 복벽 폐쇄 없이 날카로운 심장 절제술로 동물을 안락사시키거나 후속 조치와 함께 계획된 생존 실험의 경우 위에서 설명한 대로 단계적 복부 폐쇄를 수행합니다.
3. 생존 응용 프로그램의 경우 수술 중 항상 멸균 상태를 유지하십시오. 수술 전에 스크럽(요오드 기반 또는 클로르헥시딘 기반)과 알코올을 모두 사용하여 수술 부위의 피부를 무균 상태로 준비합니다. 각 동물에 대해 새 오토클레이브 기구 팩을 사용하십시오.
4. 수술 후에는 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 의식이 있을 때까지 동물을 모니터링하고 완전히 회복될 때까지 격리합니다.
5. 동물의 수술 후 치료로는 의료진을 통한 일일 방문과 체중 5mg/kg의 카프로펜을 2일 동안 하루 2회 피하 주사를 통한 수술 후 통증 치료가 포함됩니다.
6. 수술 후 완전히 회복될 때까지의 기간 동안 명확하게 정의된 종료 기준이 있는 점수표를 사용합니다. Rat Grimace Scale²⁶ 또는 인용된 문헌에서 발췌한 신체 상태 점수²⁷ 을 사용합니다. 카프로펜 적용 후 찡그린 얼굴 점수≥ 6 또는 신체 상태 점수 = 1인 경우 실험을 종료합니다. 또한 수술 후 상처 감염 또는 복벽 폐쇄 기능 부전과 같은 수술 합병증이 있는 경우 종료합니다.

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결과

이 프로토콜은 비생존 환경에서 10마리의 수컷 쥐(평균 체중 398 ± 35g)를 대상으로 수행되었으며 절차는 3년차 외과 레지던트에 의해 수행되었습니다. 복벽 폐쇄 후 20분 이상 생존율로 정의한 성공률은 100%였습니다. 피부 절개부터 피부 봉합까지 준비의 평균 시간은 18분 34초 ± 7분 31초였습니다.

불행히도, 이 원고의 생존율이 낮기 때문에 수술 후 신장...

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토론

만성콩팥병(CKD)은 원인에 관계없이 최소 3개월 동안 신장 손상 또는 신장 기능 저하로 정의된다^28,29. 신장 손상은 영상 촬영, 생검을 통해 확인되거나 알부민뇨 증가(알부민 대 크레아티닌 비율 30mg/g 또는 3.4mg/mmol) 또는 요로 침전물 변화와 같은 임상 지표에서 추론> 수 있는 네이티브 또는 이식된 신장의 병리학적 이상을 포함합...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
atraumatic preparation forceps	Aesculap	FB395R	DE BAKEY ATRAUMATA atraumatic forceps, straight
blunt overholt clamp	Aesculap	BJ012R	BABY-MIXTER preparation and ligature clamp, bent, 180 mm
cannula	BD (Beckton, Dickinson)	301300	BD Microlance 3 cannula 20 G
fixation rods	legefirm	‎500343896	tuning forks used as y-shaped metal fixation rods
heating pad	Royal Gardineer	IP67	Royal Gardineer Heating Pad Size S, 20 Watt
plastic perfusor tube	M. Schilling GmbH	S702NC150	connecting tube COEX 150 cm
polyfilament suture	Covidien	CL-769	Covidien Polysorb Braided Absorbable Suture 2-0 75 cm
preparation scissors	Aesculap	BC177R	JAMESON preparation scissors, bent, fine model, blunt/blunt, 150 mm (6")
sealing hemostat patch	Baxter	1506257	Hemopatch Sealing Hemopatch Baxter 45 x 90 mm
silicone vessel loop tie	SERAG WIESSNER	SL26	silicone vessel loop tie 2.5 mm red
Spraque Dawley rat	Janvier Labs	RN-SD-M	Spraque Dawley rat
steel plate	Maschinenbau Feld GmbH	C010206	Galvanized sheet plate, 40 x 50 cm, thickness 4.0 mm
Yasargil clip	Aesculap	FE795K	YASARGIL Aneurysm Clip System Phynox Temporary (Standard) Clip
Yasargil clip applicator	Aesculap	FE558K	YASARGIL Aneurysm Clip Applicator Phynox (Standard)