Nefrectomia 5/6 usando bipolectomia afiada via laparotomia de linha média em ratos

Resumo

Este manuscrito apresenta um protocolo padronizado para uma nefrectomia 5/6 por bipolectomia aguda via laparotomia mediana em modelo de rato, com o objetivo de induzir um estado de insuficiência renal via redução do parênquima renal com grande grau de precisão metódica e baixo risco de erro técnico.

Resumo

A doença renal crônica (DRC) afeta mais de 10% da população global, totalizando mais de 800 milhões de indivíduos em todo o mundo. Os avanços no tratamento da DRC tiveram um impacto significativo nos resultados dos pacientes. Enquanto no passado a DRC era frequentemente considerada uma sentença de morte, com muitos pacientes sucumbindo às complicações da doença renal em estágio terminal, agora ela está sendo cada vez mais tratada como uma condição crônica com a disponibilidade de diálise e transplante renal, bem como novos desenvolvimentos farmacêuticos, como inibidores de SGLT2 ou antagonistas dos receptores de mineralocorticóides não esteróides.

No entanto, continua a haver uma demanda crescente por uma maior exploração dos processos fisiopatológicos e possíveis intervenções terapêuticas. Modelos biológicos confiáveis desempenham um papel crucial na facilitação dessa pesquisa. Dada a natureza multifacetada da doença renal, que engloba não apenas a biologia celular, mas também a microanatomia vascular e a sinalização endócrina, um modelo apropriado deve possuir um nível de complexidade biológica que apenas um modelo animal pode oferecer, tornando os roedores uma escolha óbvia.

Este manuscrito, portanto, fornece um protocolo intrincado e sistemático para reduzir cirurgicamente o parênquima renal por meio de laparotomia na linha média e nefrectomia total e parcial combinada em ratos para aplicações de sobrevivência e não sobrevivência. Ele enfatiza o papel crítico de técnicas cirúrgicas precisas para garantir resultados consistentes e confiáveis. Os principais exemplos de aplicações potenciais para este modelo incluem estudos biomoleculares e farmacêuticos, bem como o desenvolvimento de modalidades inovadoras de imagem intraoperatória, como imagens hiperespectrais, para visualizar e diferenciar objetivamente a má perfusão renal.

Introdução

A doença renal crônica (DRC) é uma condição progressiva que afeta uma parcela significativa da população global. É caracterizada pela perda gradual da função renal endócrina e filtrativa ao longo do tempo, levando ao acúmulo de resíduos e líquidos no corpo e a um desequilíbrio no sistema endócrino. Dados recentes sugerem que 9,1% a 13,4% da população mundial (entre 700 milhões e um bilhão de pessoas) tem DRC¹. A prevalência de DRC aumenta com a idade, afetando cerca de 34% das pessoas com 65 anos ou mais nos Estados Unidos, em comparação com 12% naquelas com idade entre 45 e 64 anos e 6% naquelas com idade entre 18 e 44 anos².

Portanto, a DRC é um contribuinte significativo para a carga global de doenças e taxas de mortalidade. A detecção precoce e o manejo da DRC são cruciais para retardar sua progressão e reduzir o risco de complicações, como doença cardiovascular, anemia e, finalmente, doença renal terminal, que requer diálise ou transplante renal para sobrevida³.

As intervenções terapêuticas para DRC em estágio terminal passaram por uma evolução notável nas últimas décadas. Historicamente, o manejo da DRC em estágio terminal era limitado a cuidados de suporte, com a diálise emergindo como uma modalidade de suporte à vida na década de 1960. Desde então, avanços significativos foram feitos nas técnicas de diálise, incluindo o desenvolvimento de membranas mais biocompatíveis, melhor acesso vascular e o advento da diálise peritoneal⁴. Além disso, o transplante renal surgiu como o tratamento ideal para a DRC em estágio terminal, oferecendo melhor sobrevida e qualidade de vida em comparação com a diálise⁵. No entanto, a escassez de órgãos de doadores continua sendo um desafio significativo, impulsionando a pesquisa de novas estratégias, como xenotransplante e abordagens de medicina regenerativa. Além disso, o manejo de complicações associadas à DRC em estágio terminal, como o hiperparatireoidismo secundário, foi aprimorado pela introdução de agentes calcimiméticos como o etelcalcetida, que modulam efetivamente os níveis de paratormônio⁶.

Apesar desses avanços, a busca por terapias mais eficazes e direcionadas continua, alimentada por pesquisas contínuas sobre os mecanismos moleculares subjacentes à progressão da DRC em estágio terminal e comorbidades associadas. Portanto, a DRC persiste como uma preocupação significativa no atendimento ao paciente, levando a uma necessidade contínua de extensa pesquisa em processos biomédicos e abordagens terapêuticas. Modelos biológicos robustos são essenciais para facilitar tais investigações. Dada a natureza multifacetada da DRC, que abrange aspectos que vão desde a biologia celular até a sinalização endócrina interorganos, anatomia funcional vascular e reologia, um modelo ideal deve possuir um nível de complexidade biológica que apenas um organismo modelo abrangente pode fornecer. Assim, os roedores surgem como o modelo preferido devido à sua capacidade de abranger essas várias dimensões biológicas de forma eficaz.

O modelo de rim remanescente de nefrectomia 5/6 serve como uma ferramenta comum na pesquisa de DRC para experimentos com ratos e murinos devido à sua indução estável de insuficiência renal 7,8,9,10,11,12,13,14. Este modelo envolve a remoção de um rim inteiro e 2/3 do outro. A criação do rim remanescente pode ser realizada por meio da ressecção cirúrgica dos polos renais, denominada modelo de polectomia, ou pela ligadura das artérias renais segmentares superior e inferior, resultando em infarto do polo 7,15,16,17,18,19,20.

Embora esse modelo de nefrectomia 5/6 com polectomia seja uma técnica estabelecida, ele só foi introduzido como um protocolo transparente e compreensível com acesso retroperitoneal dorsolateral²¹. Esse acesso pode ser vantajoso para um procedimento unilateral com redução do parênquima renal em apenas um lado ou para um procedimento em dois tempos com distância temporal de alguns dias, a fim de aumentar a sobrevida pós-operatória do animal²². No entanto, a utilização de uma abordagem de laparotomia de linha média oferece vantagens distintas sobre a via de acesso retroperitoneal laterodorsal convencional.

Ao empregar uma única incisão abdominal na linha média, o cirurgião obtém acesso desimpedido a toda a cavidade abdominal, facilitando assim uma exploração e manipulação abrangentes dos órgãos intra-abdominais. Esse campo cirúrgico expandido não apenas agiliza o procedimento de nefrectomia, mas também permite a execução concomitante de intervenções adicionais que podem ser necessárias para protocolos experimentais específicos, por exemplo, procedimentos nos ureteres, como ligadura, ressecção ou reconstrução, que podem ser essenciais para o estudo da fisiopatologia da uropatia obstrutiva. Além disso, essa abordagem permite a ressecção ou manipulação simultânea de outros órgãos abdominais, como fígado, baço ou trato gastrointestinal, expandindo assim o escopo de investigações experimentais em interações de múltiplos órgãos ou modelos de doenças sistêmicas.

Além disso, a abordagem da laparotomia da linha média facilita a construção de um conduto de íleo ou neobexiga, um procedimento cirúrgico que envolve a criação de um desvio urinário usando um segmento do íleo, o que é particularmente relevante em estudos que investigam disfunção vesical ou técnicas de urologia reconstrutiva. Essa versatilidade na combinação da nefrectomia com outras intervenções cirúrgicas dentro do mesmo campo operatório não apenas agiliza os protocolos experimentais, mas também minimiza o trauma cirúrgico cumulativo e os riscos associados aos animais. Portanto, no caso de cirurgia renal bilateral em estágio único ou procedimentos intra-abdominais adicionais simultâneos, o acesso ventral via laparotomia mediana deve ser a opção preferida.

Atualmente, não há publicação ou protocolo disponível descrevendo essa estratégia cirúrgica. Portanto, com este trabalho, nosso objetivo é apresentar um guia detalhado de procedimentos para a realização de ressecção renal e indução cirúrgica de DRC via laparotomia mediana em ratos, aplicável a estudos de sobrevida e não sobrevida. Este modelo experimental cria um ambiente regulado propício para investigar a dinâmica complexa da DRC, mimetizando cenários clinicamente significativos. Este protocolo foi projetado especificamente para ilustrar a técnica cirúrgica. A intervenção foi, portanto, realizada em um ambiente de não sobrevivência em um grupo homogêneo de 10 ratos machos. Como não havia razão significativa para a comparação com uma intervenção inicial ou alternativa, a inclusão de um grupo controle não foi necessária. A nefrectomia 5/6 refere-se explicitamente à extensão da ressecção cirúrgica do parênquima. Isso certamente se traduz em uma redução funcional no sentido de uma redução da taxa de filtração glomerular. No entanto, o grau funcional exato não pode ser previsto, mas terá de ser medido individualmente para cada animal, por exemplo, utilizando a depuração da inulina ou do ácido p-aminohipúrico^23,24, se necessário.

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Protocolo

Todos os procedimentos com animais descritos neste documento foram realizados em instalações credenciadas e receberam aprovação do comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) do Conselho Regional de Baden-Württemberg em Karlsruhe, Alemanha (35-9185.81 / G-62 / 23). Os animais experimentais foram manejados de acordo com os protocolos institucionais e em conformidade com a legislação alemã que rege o bem-estar animal, bem como aderindo às diretrizes estabelecidas pelo Conselho da Comunidade Europeia (2010/63/UE) e às diretrizes ARRIVE. Ratos machos da raça Sprague Dawley com peso inicial de 400 g foram utilizados após um período de aclimatização de 1 semana.

1. Anestesia e analgesia

1. Narcotize o modelo de rato com os produtos farmacêuticos de sua escolha. Para seguir este protocolo, realizar indução volátil de sedação com isoflurano seguida de uma injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de peso corporal de cetamina para anestesia dissociativa e 4 mg/kg de peso corporal de xilazina. Obtenha analgesia com injeções subcutâneas de 5 mg / kg de carprofeno em peso corporal.
   NOTA: Um protocolo detalhado pode ser encontrado na literatura citada²⁵.
2. Garanta a profundidade analgésica adequada procurando reflexos de dor durante o teste de pinça do dedo do pé com pinça cirúrgica e reavalie regularmente a profundidade da anestesia durante o procedimento.
3. Aplique lubrificante oftálmico nos olhos para evitar a dessecação da córnea.

2. Preparação do procedimento

1. Prepare o local de operação com todos os materiais e instrumentos necessários, incluindo ligaduras de polifilamento, alças de vaso de silicone, grampos de overholt rombos, tesouras e pinças de preparação fina, bem como remendos hemostáticos cortados em pedaços de 0,8 x 0,6 cm (Figura 1A-G). Prepare o aparelho de exposição cirúrgica de roedores, uma almofada de aquecimento e os ganchos de preparação cirúrgica conforme especificado na literatura^{citada 25}.
2. Raspar o comprimento do acesso desejado, desinfetar o local da cirurgia com três esfregaços alternados com etanol a 70% e esfregaços à base de iodo ou clorexidina em movimentos circulares e obter oxigenação adequada por meio da inalação de oxigênio a 100% usando uma máscara facial neonatal (Figura 1H-J). Cubra o resto do corpo fora da situação cirúrgica com cortinas para evitar contaminação.
   NOTA: O animal representativo que foi usado para obter imagens de figuras não foi coberto para permitir uma melhor visualização do marco anatômico.
3. Realize uma minilaparotomia mediana por meio de uma incisão cutânea mediana inicial sobre o comprimento abdominal desejado de ~ 3 cm e uma incisão subsequente ligeiramente menor da fáscia ao longo da linha alba (Figura 1K-M).
4. Obter exposição cirúrgica do rim usando compressas cirúrgicas e ganchos de preparação cirúrgica (Figura 1N-O). Toque no parênquima renal apenas com instrumentos de preparação atraumáticos, como um cotonete umedecido ou uma compressa umedecida, usando uma pinça ou pinças de overholt rombas.

Figura 1: Instrumentos, materiais e configuração experimentais. (A) Instrumentos cirúrgicos necessários; (B) ligadura de polifilamento; (C) alça de vaso de silicone; (D) tesouras de preparação fina. (E-G) Remendo hemostático cortado em pedaços de 0,8 x 0,6 cm. (H-J) Modelo de rato raspado e oxigenado com máscara facial. O animal representativo que foi usado para obter imagens de figuras não foi coberto para permitir uma melhor visualização do marco anatômico. (K, L) Incisão cutânea mediana sobre o comprimento abdominal desejado de ~3 cm. (M) Minilaparotomia mediana; (N) exposição do rim esquerdo com compressa cirúrgica, ganchos de preparação cirúrgica e suporte de metal; (O) exposição análoga do rim direito e ressecção da fáscia de Gerota. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Nefrectomia parcial

1. Exponha o respectivo rim, pegue a gordura perirrenal que está presa à fáscia fina de Gerota e aplique um pouco de tensão para levantar localmente a fáscia do parênquima renal (Figura 2A, B.2).
2. Incise e mine a fáscia com a ponta afiada da ponta de uma tesoura e continue com uma dissecção longitudinal da fáscia de Gerota (Figura 2B).
3. Execute um desenluvamento rombudo da fáscia de Gerota usando uma tesoura fechada, descolando gradualmente a fáscia ao redor do parênquima e dobrando a cápsula fascial medialmente, opcionalmente, ressecando-a parcialmente (Figura 2C).
4. Estilingue o hilo renal usando uma alça de vaso de silicone para melhorar o controle vascular (Figura 2D).
5. Coloque a ponta da pinça no espaço retroperitoneal para estabilizar o rim para evitar um escape dorsal do rim durante o processo de corte e execute a polectomia renal 1/3 aguda craniana em um golpe preciso usando uma tesoura (Figura 2E).
   NOTA: A linha de dissecção deve ser escolhida por avaliação clínica de forma que separe o órgão em 1/3 da altura do órgão cranial e caudalmente.
6. Obter hemostasia aplicando um adesivo hemostático, por compressão manual, por compressão usando instrumentos rombos ou por tensão hilar através da alça do vaso de silicone, reduzindo efetivamente o fluxo sanguíneo hilar (Figura 2F-J).
   NOTA: A hemostasia foi regularmente alcançada pela tração simultânea da alça vascular e pela aplicação do adesivo hemostático por 2,5-3 min.
7. Siga com uma polectomia renal aguda caudal de 1/3 de forma análoga (Figura 2K-N). Para ambos os golpes de tesoura, procure um plano de dissecção ligeiramente angulado que deixe mais parênquima renal no lado hilar e menos tecido no lado lateral para evitar lesão hilar não intencional e reduzir o vazamento urinário do sistema pelvicocaliceal (Figura 2O). Se for desejada uma padronização mais alta da ressecção precisa do parênquima 5/6, pesar a ressecção da nefrectomia total no lado contralateral descrito mais adiante, pesar as ressecções da nefrectomia parcial 2/3 e repetir a dissecção em uma técnica de "fatiamento salame" até obter exatamente 2/3 do peso.

Figura 2: Nefrectomia parcial. (A) Exposição cirúrgica de um rim. (B) Incisão longitudinal da fáscia de Gerota com tesoura afiada. (C) Desenluvamento rombudo da fáscia de Gerota usando tesoura fechada. (D) Lançar o hilo renal usando uma alça de vaso de silicone. (E) Polectomia craniana afiada de 1/3 usando tesoura e fórceps como orientação. (F) Alcançar hemostasia aplicando um adesivo hemostático; (G) alcançar hemostasia por compressão manual; (H-J) obtenção de hemostasia por compressão usando instrumentos rombos e tensão hilar através da alça do vaso de silicone. (K-N) Polectomia caudal aguda 1/3 em analogia. (O) Representação esquemática dos planos de dissecção recomendados para evitar lesões hilares não intencionais (linhas pretas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Nefrectomia total

1. Mobilize o rim em analogia com as etapas descritas acima e faça um túnel do hilo renal usando pinças overholt rombas (Figura 3A, B).
2. Estique o hilo renal usando uma ligadura de polifilamento e coloque um nó deslizante seguro no hilo renal um pouco mais perto dos vasos abdominais para ocluir o fluxo sanguíneo renal e o ureter (Figura 3C, D).
3. Disseque bruscamente o hilo usando uma tesoura e remova o rim (Figura 3E, F).
4. Controle a hemostasia e corte das extremidades da ligadura (Figura 3G-J).

Figura 3: Nefrectomia total. (A) Exposição cirúrgica do rim contralateral; (B) remoção análoga da fáscia de Gerota e tunelização do hilo renal usando pinças de overholt rombas; (C) lançar o hilo usando uma ligadura de polifilamento. (D) Colocação de uma ligadura de nó deslizante no hilo renal; (E,F) dissecção aguda do hilo com tesoura e retirada do rim; (G-I) controle para hemostasia e corte das extremidades da ligadura. (J) Representação esquemática da altura recomendada da ligadura (linha tracejada) e do plano de dissecção (linha preta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Fechamento da parede abdominal

1. Coloque uma sutura de canto na fáscia abdominal usando uma sutura de polifilamento (Figura 4A-D).
2. Continue suturando a fáscia abdominal com uma sutura contínua com ~ 2 mm de tecido agarrado a cada mordida e cerca de 4 mm entre as mordidas (Figura 4E-I).
3. Suturar a camada cutânea usando pontos únicos com ~ 3 mm de tecido agarrado a cada mordida e ~ 6 mm entre as mordidas ( Figura 4J-Q ).

Figura 4: Fechamento da parede abdominal. (A-D) Colocação de uma sutura de canto na fáscia abdominal usando uma sutura de polifilamento. (E-I) Sutura contínua da fáscia abdominal; (J-Q) sutura da camada cutânea com pontos únicos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Passos adicionais

1. Dependendo do cenário desejado, do objetivo da pesquisa e do grau de insuficiência renal desejado, considere desvios desse protocolo, incluindo uma variação na quantidade de parênquima renal ressecado, por exemplo, nefrectomia total unilateral (nefrectomia 3/6), nefrectomia total bilateral (nefrectomia 6/6), monopolectomia unilateral (nefrectomia 1/6), monopolectomia bilateral (nefrectomia 2/6), bipolectomia unilateral (nefrectomia 2/6) e bipolectomia bilateral (nefrectomia 4/6).
2. Em geral, eutanasiar os animais por cardiectomia aguda sem fechamento prévio da parede abdominal para aplicações de não sobrevivência ou realizar o fechamento abdominal gradual conforme descrito acima no caso de experimentos de sobrevivência planejados com acompanhamentos.
3. No caso de aplicações de sobrevivência, mantenha as condições estéreis em todos os momentos durante a cirurgia. Antes da cirurgia, prepare assepticamente a pele no local da cirurgia usando um esfoliante (à base de iodo ou clorexidina) e álcool. Use um novo pacote de instrumentos autoclavados para cada animal.
4. Após a cirurgia, monitore o animal até que esteja consciente o suficiente para manter a decúbito esternal e isole-o até que esteja totalmente recuperado.
5. Como tratamento pós-cirúrgico do animal, inclua visitas diárias através da equipe médica, bem como tratamento pós-cirúrgico da dor com injeções subcutâneas de 5 mg/kg de peso corporal de carprofeno 2x ao dia durante 2 dias.
6. Use folhas de pontuação com critérios de término claramente definidos para a duração até a recuperação pós-operatória completa. Use a Escala de Carreta de Rato²⁶ ou o Escore de Condição Corporal²⁷ da literatura citada. Encerre o experimento se a pontuação de careta ≥ 6 ou uma pontuação de condição corporal = 1 após a aplicação de carprofeno. Além disso, termine em caso de complicação cirúrgica, como infecção de ferida pós-operatória ou insuficiência de fechamento da parede abdominal.

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Resultados

Este protocolo foi realizado em 10 ratos machos (peso médio de 398 ± 35 g) em um ambiente de não sobrevivência e o procedimento foi realizado por um residente cirúrgico do terceiro ano. A taxa de sucesso definida pela sobrevida acima de 20 min após o fechamento da parede abdominal foi de 100%. A duração média do preparo desde a incisão na pele até o fechamento da pele foi de 18 min 34 s ± 7 min 31 s.

Infelizmente, devido à natureza de não sobrevi...

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Discussão

A DRC é definida por lesão renal ou redução da função renal por pelo menos 3 meses, independentemente da causa ^28,29. O dano renal engloba anomalias patológicas no rim nativo ou transplantado, identificadas por meio de exames de imagem, biópsia ou deduzidas de marcadores clínicos como aumento da albuminúria (relação albumina/creatinina > 30 mg/g ou 3.4 mg/mmol) ou alterações no sedimento urinário. A função renal ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
atraumatic preparation forceps	Aesculap	FB395R	DE BAKEY ATRAUMATA atraumatic forceps, straight
blunt overholt clamp	Aesculap	BJ012R	BABY-MIXTER preparation and ligature clamp, bent, 180 mm
cannula	BD (Beckton, Dickinson)	301300	BD Microlance 3 cannula 20 G
fixation rods	legefirm	‎500343896	tuning forks used as y-shaped metal fixation rods
heating pad	Royal Gardineer	IP67	Royal Gardineer Heating Pad Size S, 20 Watt
plastic perfusor tube	M. Schilling GmbH	S702NC150	connecting tube COEX 150 cm
polyfilament suture	Covidien	CL-769	Covidien Polysorb Braided Absorbable Suture 2-0 75 cm
preparation scissors	Aesculap	BC177R	JAMESON preparation scissors, bent, fine model, blunt/blunt, 150 mm (6")
sealing hemostat patch	Baxter	1506257	Hemopatch Sealing Hemopatch Baxter 45 x 90 mm
silicone vessel loop tie	SERAG WIESSNER	SL26	silicone vessel loop tie 2.5 mm red
Spraque Dawley rat	Janvier Labs	RN-SD-M	Spraque Dawley rat
steel plate	Maschinenbau Feld GmbH	C010206	Galvanized sheet plate, 40 x 50 cm, thickness 4.0 mm
Yasargil clip	Aesculap	FE795K	YASARGIL Aneurysm Clip System Phynox Temporary (Standard) Clip
Yasargil clip applicator	Aesculap	FE558K	YASARGIL Aneurysm Clip Applicator Phynox (Standard)