可视化沿海湿地中的甲烷循环微生物动力学

摘要

该协议检测南德克萨斯州沿海湿地中的关键甲烷循环基因，并可视化它们的空间分布，以增强对甲烷调节及其在这些动态生态系统中的环境影响的理解。

摘要

沿海湿地是甲烷最大的生物来源，产甲烷菌将有机物转化为甲烷，而嗜甲烷菌氧化甲烷，从而在调节甲烷循环中起关键作用。由于气候变化，德克萨斯州南部的湿地经常受到天气事件、盐度水平波动和人为活动的影响，这些都会影响甲烷循环。尽管这些过程具有生态重要性，但南德克萨斯州沿海湿地的甲烷循环仍未得到充分探索。为了解决这一差距，我们开发并优化了一种检测与产甲烷菌和嗜甲烷菌相关的基因的方法，包括作为产甲烷菌生物标志物的 mcrA 和作为产甲烷菌生物标志物的 pmoA1、 pmoA2 和 mmoX 。此外，本研究旨在利用地理信息系统 （GIS） 软件 ArcGIS Pro 可视化产甲烷原和甲烷营养素丰度的时空分布模式。将这些分子技术与先进的地理空间可视化相结合，为了解南德克萨斯州湿地中产甲烷菌和嗜甲烷菌群落的时空分布提供了重要见解。因此，本研究中建立的方法为绘制湿地中的微生物动态图提供了一个强大的框架，增强了我们对不同环境条件下甲烷循环的理解，并支持更广泛的生态和环境变化研究。

引言

沿海湿地是重要的生态系统，通过碳封存、蒸发蒸腾和甲烷 （CH₄） 排放等过程为气候调节、生物多样性保护和水资源管理做出贡献¹。这些生态系统，包括淡水湿地和咸水湿地²，生产力很高，是吸收二氧化碳 （CO₂） 和捕获陆地和海洋环境中有机物的关键区域 ^3,4。这些湿地内的动态相互作用刺激了微生物 CH₄ 的产生和消费⁵，使它们成为 CH₄⁶ 的最大天然来源之一。作为第二重要的温室气体，CH₄ 的全球变暖潜能值约为 CO₂^{4、7、8、9} 的 27-30 倍，因此在气候变化时代，研究沿海湿地的 CH₄ 排放量至关重要。CH₄ 的排放受各种环境因素的影响，尤其是盐度，在微生物过程中起着至关重要的作用¹⁰。淡水湿地的硫酸盐含量较低，因此对大气甲烷的贡献很大，这促进了微生物 CH₄ 的产生，而咸水湿地由于硫酸盐浓度较高，通常倾向于排放较少的 CH₄ 11,12,13。

沿海湿地的 CH₄ 排放通常由两组微生物控制，称为产甲烷菌和甲烷菌¹⁴。产甲烷菌通过称为甲烷生成¹⁵ 的过程分解甲酸盐、乙酸盐、氢或甲基化化合物等底物，在缺氧沉积物中产生 CH₄。该途径中的重要酶是甲基辅酶 M 还原酶 （MCR），因为它催化甲烷生成的最后和限速步骤 15,16,17。编码 MCR 的 α 亚基的 mcrA 基因是一种功能标记物，可以在所有产甲烷古细菌中找到¹⁸。此外，在沿海湿地中，硫酸盐-甲烷过渡区 （SMTZ） 在产甲烷区上方形成，甲烷向上扩散，硫酸盐向下移动汇聚并耗尽¹⁹。在该区域内，厌氧甲烷营养古细菌 （ANME） 使用 MCR 酶将甲烷氧化成二氧化碳，而硫酸盐还原细菌 （SRB） 将硫酸盐还原为硫化物。SRB 在氢和乙酸盐方面优于产甲烷菌，限制了甲烷的产生，直到硫酸盐耗尽^16,17。

相比之下，需氧嗜甲烷菌在好氧环境中利用不同形式的甲烷单加氧酶 （MMO）²⁰ 氧化 CH₄。这些包括颗粒甲烷单加氧酶 （pMMO），一种嵌入胞浆内膜的含铜酶，以及可溶性甲烷单加氧酶 （sMMO），一种在细胞质中发现的含铁酶。然而，对于 pMMO，有三个基因纵子 pmoCAB²¹;其中，pmoA 基因是所有嗜甲烷菌中最保守的。pmoA 有两种不同的生物标志物基因：pmoA1 和 pmoA2²²。此外，为了全面了解嗜甲烷菌，mmoX 基因被用作分子生物学中的工具，以识别含有 sMMO 的嗜甲烷菌²³。产甲烷菌和好氧甲烷菌的代谢途径和环境要求的这种差异突出了沿海湿地生态系统中调节甲烷循环的复杂微生物相互作用。

博卡奇卡 （BC） 湿地是德克萨斯州南部一个多产的咸水环境，受到墨西哥湾 （GOM） 的潮汐影响，导致地表盐度水平变化，特别是由于靠近高盐度的马德雷湖²⁴ 号。这种潮汐作用在涨潮和退潮之间交替，导致氧气水平波动²⁵ ，这可能会改变沉积物中的产甲烷菌和产甲烷菌活性²⁶。相比之下，沿海淡水湿地被认为是 CH₄ 通量的重要热点²⁷。德克萨斯州南部的沿海淡水湿地，包括 Resaca Del Rancho Viejo （RV） 和 Lozano Banco （LB），远离 GOM 的潮汐效应，具有独特的水文管理。RV 在低水位时经历由河水补充的脉冲流，而 LB 在没有这种补充的情况下作为离线流系统运行。此外，RV 和 LB 保持较低的盐度水平，这是由于人工抽取的淡水流量大，并且分别是一个牛轭湖。不同的环境因素会显着影响南德克萨斯州沿海湿地的甲烷循环。然而，南德克萨斯州沿海湿地的甲烷循环仍然是一个尚未彻底调查的领域。

聚合酶链反应 （PCR） 和实时 PCR（也称为定量 PCR [qPCR]）是检测和定量环境样本中特定基因相对丰度的基本且广泛使用的技术。这些技术特异性扩增 DNA 的目标区域，以指示 CH₄ 循环相关基因的存在和相对数量，从而提供潜在甲烷循环的指标。然而，PCR 引物组的可用性和有效性可能受到提取的环境 DNA 中各种抑制因子的限制，并受到环境类型的影响^28,29。因此，本研究主要建立了一种最佳的 PCR 方法，用于检测南德克萨斯州沿海湿地中 CH₄ 循环相关基因的存在（图 1），然后可视化它们在这些生态系统中的定量相对丰度。这项研究的结果可以应用于其他沿海地区，以增强对不同沿海生态系统中 CH₄ 循环和微生物动力学的理解。

研究方案

1. 样本采集

1. 使用沉积物取样器或铲子收集沉积物样品。
   注：样品是在 2023 年和 2024 年的凉爽季节（10 月至 2 月，平均气温为 20 °C）和温暖季节（4 月至 6 月，平均气温为 27 °C）从三个不同沿海湿地的两个站点收集的。从沿海淡水湿地收集样本时，使用沉积物抓取采样器（图 2），而受潮汐影响的沿海咸水湿地则使用铲子。
2. 首先将采样器降低到浅水体中，让它在自重的作用下沉到沉积物表面（顶部 50 厘米以内），最大限度地减少对沉积物结构的干扰，如图 2 所示。
3. 将其从深度通常为 60 厘米至 215 厘米³⁰ 的水柱中拉出，将沉积物样本转移到拉链袋中，并立即存放在冰柜中。
   注：在进行下一个工作站之前，用去离子 （DI） 水清洁和清洗取样器。
4. 将所有样品立即储存在实验室中-20 °C。
5. 在每个采样点，使用多参数水质计原 位 测量地表水质量参数，例如盐度和温度。
   注意：在每个工作站使用后，用去离子水（去离子水）冲洗探头。

2. 基因组 DNA 提取

1. 在开始基因组 DNA 提取程序之前，在室温下解冻样品。
2. 将大约 500 mg 沉淀物样品转移到 15 mL 试管中，并以 4,250 × g 离心 3 分钟以去除所有水分。
3. 按照制造商的方案³¹ ，使用土壤DNA提取试剂盒提取基因组DNA，并立即储存在-20°C。
   注意：进行更改是为了减少冗余和提高工作流程效率。
   1. 将最多 500 毫克的土壤样品添加到含有玻璃珠/陶瓷球的试管中。
   2. 将 978 μL 磷酸钠缓冲液添加到含磁珠/球体的试管中的样品中。
   3. 在含磁珠/球体的试管中向样品中加入 122 μL 缓冲液裂解液，以溶解外部污染物。
   4. 使用珠磨机均质器以 5 倍的速度水平匀浆 20 秒，然后重复 2 倍。
      注意：本研究中使用了珠磨机均质器，这就是调整速度的原因。
   5. 将混合物以 14,000 × g 离心 10 分钟 。
   6. 将上清液转移至干净的 2.0 mL 微量离心管中。
   7. 加入 250 μL 蛋白质沉淀溶液 （PPS），将溶解的核酸与细胞碎片和裂解基质分离。将试管倒置 10 次混合。
   8. 以 14,000 × g 离心 5 分钟以沉淀沉淀沉淀，去除细胞碎片和裂解基质。
   9. 将上清液转移至干净的 15 mL 微量离心管中。
   10. 将 1.0 mL 结合基质悬浮液添加到 15 mL 试管中的上清液中。
       注：添加前摇动 Binding Matrix 悬浮液以重悬。
   11. 将试管放在旋转器上 2 分钟，让 DNA 与结合基质结合。
   12. 将所有试管放在架子上并孵育 3 分钟，以使结合基质沉淀。
   13. 3 分钟后，弃去 750 μL，并使用移液管将剩余的上清液与沉淀轻轻混合。
   14. 将 750 μL 混合物转移到 SPIN 过滤器中，并以 14,000 × g 离心 1 分钟。清空收集管并重复使用。对剩余的混合物重复此作。
   15. 加入 500 μL 制备好的洗涤液（加入适量的乙醇）以进一步溶解杂质。利用移液管吸头的液体力量轻轻重悬沉淀。
   16. 以 14,000 × g 离心 1 分钟以去除杂质。清空收集管并重复使用。
   17. 再次以 14,000 × g 离心 2 分钟，不添加任何东西。
   18. 用新的、干净的收集管更换收集管，并在室温下将 SPIN 过滤器风干 5 分钟。
   19. 加入 50 μL 游离 DNA 酶水 （DES），并以 14,000 × g 离心 1 分钟。
       注：在该方案中，使用 50 μL DES 进行 DNA 洗脱，以确保提取的环境 DNA （eDNA） 的最佳回收率和稳定性。

3. DNA 定量

1. 在 0.5 mL 试管中加入 1 μL 提取的 DNA 和 200 μL 荧光染料，并通过移液充分混合。
2. 立即用铝箔包裹试管，使光线无法穿透并在室温下孵育 5 分钟。
3. 按照制造商的方案，在 ONE DNA 浓度模式下使用荧光计测量 DNA 浓度。

4. 常规 PCR 检测 16S rRNA、pmoA1、pmoA2、mmoX 和 mcrA

1. 在运行常规 PCR （cPCR） 之前，请在冰桶中解冻所有样品和试剂。
2. 将所有提取的 eDNA 样品稀释至 10 ng/μL。
   注意： 表 1 中给出了引物列表。
3. 为每个样品制备 25 μL cPCR 反应混合物，包括 12.5 μL 2x PCR 预混液、0.5 μL 正向和反向引物 （10 μM）（引物列表见 表 1 ）、1 μL 10 ng/μL eDNA 和 10.5 μL 无核酸酶水。
   注：制备体积足以容纳一个额外样品的预混液，以最大限度减少移液错误。
4. 按照方案进行 cPCR 反应，该方案包括在 95 °C 下初始变性 2 分钟，然后在 95 °C 下变性 45 秒，在 72 °C 下延伸 30 秒，最后在 72 °C 下延伸 5 m，不同引物的退火温度不同（参见表 1 用于不同基因的不同引物的退火温度）。
   注：对于 mcrA 基因，ML 引物在前五个循环的退火和延伸步骤之间使用 0.1 °C/s 的缓慢升温速率显示所需的条带³²。
5. 在用溴化乙锭 （EtBr） 预染的琼脂糖凝胶中观察 cPCR 产物。
   注：对于 50 bp 分子量标准，使用 2.5% 琼脂糖凝胶，对于 1 kb 分子量标准，使用 0.9% 凝胶。对于 2.5% 琼脂糖凝胶使用 1x TAE 缓冲液，对于 0.9% 琼脂糖凝胶使用 0.5x TAE 缓冲液。

5. 通过定量实时 PCR 检测 pmoA1 、 pmoA2 、 mmoX 和 mcrA

注：使用实时 PCR 系统通过 qPCR 观察到产甲烷菌和甲烷营养素靶向基因，如 pmoA1、 pmoA2、 mmoX 和 mcrA 丰度。

1. 分别制备每个基因的标准品，以获得每个基因的标准曲线。
   1. 使用 cPCR 扩增目标基因，使用在每个基因的凝胶电泳过程中产生最亮条带的样品。遵循第 4 节中描述的方法和引物。
   2. 使用凝胶提取试剂盒纯化扩增的产物，并按照第 3 节中描述的方法测量 DNA 浓度，并储存在 -20 °C。
      注：将纯化的标准品分装到单独的试管中以备进一步使用。
   3. 使用 qPCR 的拷贝数计算网站从测得的 DNA 浓度中计算基因拷贝数。
   4. 在运行 qPCR 之前，用不含核酸酶的水稀释计算出的标准品拷贝数，以制备 10⁸ 至 10² 拷贝/μL 的每个标准品。
   5. 使用每个拷贝数的三个重复样本制备标准曲线，包括阴性对照（NTC，无模板 DNA）。
      注：每条标准曲线的 R² 值大于 0.99。
2. 为所有样品、标准品和 NTC 制备 20 μL qPCR 反应混合物。对所有样品一式三份进行 qPCR 分析。
   1. 在开始之前，将所有反应组分（包括 qPCR 预混液、引物、无核酸酶水、标准品和样品）放在冰架上。
   2. 为每个样品、标准品和 NTC 制备 20 μL qPCR 反应混合物，分别含有 10 μL SYBR Green 预混液、0.5 μL 每种 10 μM 正向和反向引物、8 μL 无核酸酶水和 1 μL 10 ng/μL 模板 DNA、标准品或 DI 水。
      注：使用所示的引物对在常规 PCR 中产生 pmoA1 和 mcrA 基因的最佳结果进行 qPCR（参见 表 1）。为了提高准确性，请一式三份运行每个样品。以下步骤提供了一种制备一式三份样品的有效方法，每个样品的总体积为 60 μL。
      1. 制备反应混合物，将预混液、特定基因的正向和反向引物以及无核酸酶的水混合在 2 mL 试管中，模板 DNA 除外。
         注意：考虑到移液误差，准备反应混合物体积。例如，如果有 24 个样品和 8 个标准品，则计算 33 个反应的总体积，而不是 32 个反应，以最大程度地减少移液误差。在这种情况下，三次重复反应所需的总体积如下：990 μL 预混液（33 份样品 x 3 次重复 x 10 μL）、49.5 μL 正向引物（33 份样品 x 3 次重复 x 0.5 μL）、49.5 μL 反向引物（33 份样品 x 3 次重复 x 0.5 μL）和 792 μL 无核酸酶水（33 份样品 x 3 次重复 x 8 μL）。
      2. 根据样品数量和标准品准备 PCR 管。
      3. 将 57 μL 制备的反应混合物分配到每个 PCR 管中。
         注：要对每个样品一式三份进行 qPCR，请为每个样品制备 57 μL 的总反应混合物体积（不包括模板 DNA、标准品或水）。对于一个样品，该体积将被平均分成三个孔，每个孔分配 19 μL。
      4. 向每个试管中加入 3 μL 模板 DNA、标准品或无核酸酶的水，轻轻敲击试管底部混合。
         注：现在每个试管中为一个样品制备的反应混合物的总体积为 60 μL。
   3. 将每管中 20 μL 制备的反应混合物分装到 96 孔 qPCR 板的指定孔中。使用涂抹器用粘性 PCR 密封膜密封 PCR 板。
   4. 将密封板以 1,000 × g 离心 1 分钟，以确保正确混合以消除孔内的任何气泡。
3. 将 PCR 板放入热循环仪中。打开 qPCR 机器，然后打开相关软件设置协议。
   1. 根据 qPCR 预混液指南设置方案。使用以下方案：95 °C 10 分钟，然后 95 °C 15 秒，并在 72 °C 下延伸 30 秒。在 表 1 中为相关引物指定的退火温度下执行退火步骤 45 秒。进行 35 个循环的所有 qPCR 运行。
   2. 使用标准品和 NTC 设置与含样品板相同的配置中的 96 孔 qPCR 板。
4. 使用绝对定量标准曲线法定量每个样品中的扩增产物和基因拷贝数³³。

6. 在南德克萨斯州沿海湿地地图中可视化甲烷循环基因

1. 打开地理信息系统 （GIS） 软件 ArcGIS Pro ，然后将名为 Study Area 的工程文件保存在计算机上的指定文件夹中。
2. 点击左上角的地图 |Basemap 并选择 Terrain with Labels 作为底图。
3. 单击 Locate |搜索 ，当搜索栏打开时，通过输入区域名称来定位研究区域;该区域将显示。
4. 使用地理配准绘制特定区域。
   1. 单击 View |目录窗格 。
   2. 双击目录中的 Folder |文件名。
   3. 右键单击 地理数据库 （.gdb） 文件 ，然后单击 新建 |将显示 Feature Class 和 Create Feature Class 。
   4. 键入 名称 和 别名 框，然后单击 完成 在底部。
   5. 单击 View |目录。 别名 将显示在 内容窗格中。
   6. 单击顶部图层的 Edit |创建。Create Features 窗格将打开。双击 Alias in Create Features（创建要素中的 Alias）窗格，将出现 Configure Tool Feedback Options（配置工具反馈选项）。
   7. 选择 线，然后在地图上绘制线以创建研究区域的外部边界。完成后双击地图。
5. 最小化 GIS 软件，然后打开电子表格。在第一列中键入 样本名称 ，在第二列中输入 纬度 ，在第三列中输入 经度 。将接下来的四列用于 pmoA1、 pmoA2、 mmoX 和 mcrA 的 qPCR 数据。
6. 将文件以 CSV 格式 保存在计算机的任何特定文件夹中。
7. 再次打开 GIS 软件，然后单击 添加数据 |XY 点数据。
8. 从计算机上的文件夹中的 Input Table 框中选择 CSV 文件。重命名 Output Feature Class 中的文件名，然后单击 Run 以在地图上显示采样点。
9. 单击顶部的 vsearch 栏并搜索 Kriging。
10. 选择采样站文件，然后选择 pmoA1。
11. 单击 “环境”| 在“图层”|“蒙 版”| ”单击 Run。
12. 按照步骤 6.9、6.10 和 6.11 中提到的协议，为所有研究区域的 pmoA2、mmoX 和 mcrA 创建克里金法。
13. 创建地图的布局。
    1. 单击顶层的 Insert |新建布局，然后选择 ANSI - 横向。
    2. 单击 地图框，选择 带有克里金法的地图，然后通过绘制矩形将所有地图放置在布局中。这将使地图在布局中可见。
    3. 选择 North Arrow 并将其放置在布局中以指示 North 方向。
    4. 选择 “比例尺 ”以在地图上显示该区域的比例。
    5. 单击 Legend 以显示图例，然后将其放置在布局中。
    6. 单击 格网 ，然后选择任意黑色经纬网选项。这将创建具有纬度和经度的格网，并将其显示在 内容窗格中 ，并带有标注 Black Horizontal Label Graticule。
    7. 双击 Black Horizontal Label Graticule，然后选择 Components 。单击 Ticks 1 和 Grid，然后单击它们右侧的叉号删除这些组件。
14. 单击顶层的 Share ，然后单击 Export Layout。选择文件类型为 PDF，使用 名称框将文件保存在计算机上，将垂直分辨率设置为 500 DPI，然后单击 导出 以创建地图的 PDF 文件。

结果

为了解南德克萨斯州沿海湿地 CH₄ 循环相关基因 （mcrA 、 pmoA1 、 pmoA2 和 mmoX） 的分布和丰度，通过 cPCR 和 qPCR 分析每个样本中提取的 eDNA。从以前的研究中选择每个生物标志物的通用引物来运行 cPCR（表 1）22,34,35,36,37，并根据样品特性和环境条件进行修改以优化退火温度和浓度。...

讨论

作者没有需要声明的利益冲突。沿海湿地被认为是大气中甲烷的重要贡献者，甲烷是一种重要的温室气体⁴⁰。尽管已经对湿地中的甲烷通量和产甲烷菌进行了研究 41,42,43，^但对嗜甲烷菌如何在不同环境或各种管理实践下运作知之甚少，尤其是在水位波动的湿地^{中 44}。...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tubes	ThermoFisher Scientific	AB0620	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AB0620?SID=srch-srp-AB0620
0.5 mL PCR Tubes	Promega	E4941	https://www.promega.com/products/biochemicals-and-labware/tips-and-accessories/0_5ml-pcr-tubes/?catNum=E4941
10 μL tips	ThermoFisher Scientific	05-408-187	Fisherbrand SureGrip Pipet Tip Racked or Reload System Tips Natural; 10μL; | Fisher Scientific
15 mL centrifuge tube	ThermoFisher Scientific	14-959-53A	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-15ml-conical-centrifuge-tubes-5/p-193301
200 μL tips	ThermoFisher Scientific	05-408-190	Fisherbrand SureGrip Pipet Tip Racked or Reload System Tips Natural; 200μL; | Fisher Scientific
1000 μL tips	ThermoFisher Scientific	02-707-402	https://www.fishersci.com/shop/products/sureone-micropoint-pipette-tips-specific-standard-fit/02707402?gclid=Cj0KCQiAp NW6BhD5ARIsACmEb kUsQ9Lu0YIq5i4vWege 17qPdtxIYZyvmJH1cDo ARuwereO1V4GLz9UaA lDREALw_wcB&ef_id=C j0KCQiApNW6BhD5ARI sACmEbkUsQ9Lu0YIq5i 4vWege17qPdtxIYZyvmJ H1cDoARuwereO1V4GLz 9UaAlDREALw_wcB:G:s &ppc_id=PLA_goog_2175 7693617_171052169911_02 707402__715434303113_1555 377385658230343&ev_chn=sh op&s_kwcid=AL!4428!3!71543430 3113!!!g!2366517300713!&gad_source=1
Applied Biosystem Power SYBR Green Master Mix	ThermoFisher Scientific	4368577	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4368577
ArcGIS Pro	esri		https://www.esri.com/en-us/arcgis/products/arcgis-pro/overview?srsltid=AfmBOopatJ4 JvHJfscHRcAaDx0Jz5_Jrl8l5 vYkkBvfOqE-uNSsMghN1
CFX Duet Real-Time PCR system	Bio-Rad	12016265	https://www.bio-rad.com/en-us/product/cfx-duet-real-time-pcr-system?ID=97722926-9ed9-16a4-1d83-c92f587e427a
Corning Lambda plus single channel pipettor volume 0.5-10 μL	Sigma-Aldrich	CLS4071-1EA	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cls4071
Corning Lambda plus single channel pipettor volume 100-1000 μL	Sigma-Aldrich	CLS4075-1EA	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cls4075
Corning Lambda plus single channel pipettor volume 20-200 μL	Sigma-Aldrich	CLS4074-1EA	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cls4074
FastDNA spin kit for soil	MP Biomedical	116560200-CF	https://www.mpbio.com/us/116560000-fastdna-spin-kit-for-soil-samp-cf?srsltid=AfmBOoqOxxGilzY3IHNIZR ajegGTr9MoX1oMZUh 3dcbJqe0UvvukY128
Gene copy  calculator	Science Primer		https://scienceprimer.com/copy-number-calculator-for-realtime-pcr .
High speed benchtop centrifuge	ThermoFisher Scientific	75004241	https://newlifescientific.com/products/thermo-scientific-sorvall-st16-high-speed-benchtop-centrifuge-75004241?gad_source=1&gclid=Cj0KCQiApN W6BhD5ARIsACmEbkVC_-cCIN9j 20TvYq8iDsBlUR5cPK_1_wN OBEcjMdv-CYVoGCfeOLYaAv enEALw_wcB
High speed microcentrifuge	VWR	75838-336	https://us.vwr.com/store/product/20546590/null
Lysing Matrix E tube			glass bead/ceramic sphere-containing tube
Microcentrifuge tube	ThermoFisher Scientific	02-681-320	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/02681320?gclid=Cj0KCQiAp NW6BhD5ARIsACm EbkWbG4_o3oUiGk HJPU-_31-CuexDwQ fmWPnfyhBOf2BHXsy K3fFW1toaAgJbEALw_ wcB&ef_id=Cj0KCQiAp NW6BhD5ARIsACmEb kWbG4_o3oUiGkHJPU- _31-CuexDwQfmWPnfy hBOf2BHXsyK3fFW1toa AgJbEALw_wcB:G:s&ppc _id=PLA_goog_21757693 617_171052169911_0268 1320__715434303113_10 349826094968484711&ev _chn=shop&s_kwcid=AL!4 428!3!715434303113!!!g!23 66517300713!&gad_source=1
PCR Master mix	Promega	M7502	https://www.promega.com/products/pcr/taq-polymerase/master-mix-pcr/?catNum=M7502
Quantiflour ONE dsDNA system	Promega	E4871	https://www.promega.com/products/rna-analysis/dna-and-rna-quantitation/quantifluor-one-dsdna-system/?gad_source=1&gbraid=0AAAAAD _rg189yJTY3cxeVqMdu8RPx10 Ma&gclid=CjwKCAjwxNW2BhAk EiwA24Cm9FUgViPNyWq7UfZL VeeoroLAZ5JIP6w07RGK_4D0w oZgAqf-G1XTmxoCxm8QAvD_B wE&catNum=E4871
Quantus Fluorometer	Promega	E6150	https://www.promega.com/products/microplate-readers-fluorometers-luminometers/fluorometers/quantus-fluorometer/?catNum=E6150
YSI Pro 2030	YSI a xylem brand	603174	https://www.ysi.com/product/id-p2030/pro2030-kits