JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Протокол обнаруживает ключевые гены круговорота метана в прибрежных водно-болотных угодьях Южного Техаса и визуализирует их пространственное распределение, чтобы улучшить понимание регуляции метана и его воздействия на окружающую среду в этих динамичных экосистемах.

Аннотация

Прибрежные водно-болотные угодья являются крупнейшим биотическим источником метана, где метаногены превращают органическое вещество в метан, а метанотрофы окисляют метан, играя тем самым решающую роль в регулировании метанового цикла. Водно-болотные угодья в Южном Техасе, которые подвержены частым погодным явлениям, колебаниям уровня солености и антропогенной деятельности из-за изменения климата, влияют на круговорот метана. Несмотря на экологическую важность этих процессов, круговорот метана в прибрежных водно-болотных угодьях Южного Техаса остается недостаточно изученным. Чтобы восполнить этот пробел, мы разработали и оптимизировали метод обнаружения генов, связанных с метаногенами и метанотрофами, включая mcrA в качестве биомаркера метаногенов и pmoA1, pmoA2 и mmoX в качестве биомаркеров метанотрофов. Кроме того, это исследование было направлено на визуализацию пространственных и временных закономерностей распределения метаногена и распространенности метанотрофа с использованием программного обеспечения географической информационной системы (ГИС) ArcGIS Pro. Интеграция этих молекулярных методов с передовой геопространственной визуализацией позволила получить критически важное представление о пространственном и временном распределении метаногена и метанотрофных сообществ по водно-болотным угодьям Южного Техаса. Таким образом, методология, разработанная в этом исследовании, предлагает надежную основу для картирования микробной динамики в водно-болотных угодьях, улучшая наше понимание круговорота метана в различных условиях окружающей среды и поддерживая более широкие исследования экологических и экологических изменений.

Введение

Прибрежные водно-болотные угодья являются жизненно важными экосистемами, которые способствуют регулированию климата, сохранению биоразнообразия и управлению водными ресурсами посредством таких процессов, как связывание углерода, эвапотранспирация и выбросы метана (CH4)1. Эти экосистемы, включая как пресноводные, так и соленые водно-болотные угодья2, являются высокопродуктивными и выступают в качестве критических зон для поглощения углекислого газа (CO2) и улавливания органических веществ из наземной и морской среды 3,4. Динамические взаимодействия в этих водно-болотных угодьях стимулируют производство и потребление микробногоCH4 5, что делает их одним из крупнейших природных источников CH46. Являясь вторым по значимости парниковым газом, CH4 обладает потенциалом глобального потепления примерно в 27-30 раз выше, чем у CO2 4,7,8,9, что делает изучение выбросов CH4 из прибрежных водно-болотных угодий крайне важным в эпоху изменения климата. На выбросCH4 влияют различные факторы окружающей среды, в частности соленость, играющая решающую роль в микробных процессах10. Пресноводные водно-болотные угодья вносят значительный вклад в атмосферный метан из-за более низких уровней сульфатов, что способствует большему производству микробногоCH4, в то время как соленые водно-болотные угодья обычно имеют тенденцию выбрасывать меньшеCH4 из-за более высоких концентраций сульфатов 11,12,13.

ВыбросыCH4 из прибрежных водно-болотных угодий, как правило, контролируются двумя группами микроорганизмов, известными как метаногены и метанотрофы14. Метаногены производятCH4 в бескислородных отложениях, разрушая субстраты, такие как формиат, ацетат, водород или метилированные соединения, с помощью процесса, известного как метаногенез15. Важным ферментом в этом пути является метил-коэнзим М-редуктаза (MCR), поскольку он катализирует заключительную и ограничивающую скорость стадию метаногенеза 15,16,17. Ген mcrA, который кодирует альфа-субъединицу MCR, является функциональным маркером, который можно найти у всех метаногенных архей18. Кроме того, в прибрежных водно-болотных угодьях сульфат-метановая переходная зона (СМТЗ) формируется над метаногенной зоной, где диффундирующий вверх метан и нисходящий сульфат сходятся и истощаются19. В этой зоне анаэробные метанотрофные археи (ANME) окисляют метан до углекислого газа с помощью фермента MCR, в то время как сульфатредуцирующие бактерии (SRB) восстанавливают сульфат до сульфида. SRB вытесняет метаногены по водороду и ацетату, ограничивая выработку метана до тех пор, пока сульфат не будет истощен16,17.

Напротив, аэробные метанотрофные бактерии окисляютCH4 в аэробных средах20, используя различные формы метанмонооксигеназы (ММО). К ним относятся монооксигеназа метана (pMMO) — медьсодержащий фермент, встроенный в интрацитоплазматическую мембрану, и растворимая монооксигеназа метана (sMMO) — железосодержащий фермент, обнаруженный в цитоплазме. Тем не менее, для pMMO существует три гена оперонов pmoCAB21; Среди них ген pmoA является наиболее консервативным для всех метанотрофов. Существует два различных биомаркера pmoA: pmoA1 и pmoA222. Более того, для всестороннего понимания метанотрофов ген mmoX используется в качестве инструмента в молекулярной биологии для идентификации sMMO-содержащих метанотрофов23. Это различие между метаболическими путями и экологическими потребностями метаногенов и аэробных метанотрофов подчеркивает сложные микробные взаимодействия, регулирующие круговорот метана в прибрежных экосистемах водно-болотных угодий.

Водно-болотные угодья Бока-Чика (Британская Колумбия), продуктивная соленая среда в Южном Техасе, испытывают приливное влияние Мексиканского залива (GOM), что приводит к переменным уровням солености поверхности, особенно из-за его близости к гиперсоленой Лагуна Мадре24. Это приливное действие, чередующееся между приливами и отливами, вызывает колебания уровня кислорода25 , что может изменить метаноген и активность метанотрофа в отложениях26. Напротив, прибрежные пресноводные водно-болотные угодья считаются значительной горячей точкой для потоковCH4 27. Прибрежные пресноводные водно-болотные угодья в Южном Техасе, включая Ресака-дель-Ранчо-Вьехо (RV) и Лосано-Банко (LB), удаленные от приливных эффектов GOM, имеют особое гидрологическое управление. Во время низкого уровня воды в автофургоне наблюдаются импульсные потоки, дополненные речной водой, в то время как LB работает как автономная система потока без такой добавки. Кроме того, RV и LB поддерживают более низкий уровень солености из-за высокого расхода искусственно откачиваемой пресной воды и являются старичным озером соответственно. Различные факторы окружающей среды могут значительно влиять на круговорот метана по прибрежным водно-болотным угодьям Южного Техаса. Тем не менее, круговорот метана в прибрежных водно-болотных угодьях Южного Техаса остается областью, которую еще предстоит тщательно исследовать.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ПЦР в реальном времени (также называемая количественной ПЦР [кПЦР]) представляют собой фундаментальные и широко используемые методы обнаружения и количественной оценки относительного содержания специфических генов в образцах окружающей среды. Эти методы целенаправленно амплифицируют целевые участки ДНК, чтобы указать на наличие и относительное количество генов, связанных с циклированием CH4, обеспечивая индикаторы потенциального круговорота метана. Тем не менее, доступность и эффективность наборов праймеров для ПЦР могут быть ограничены различными ингибирующими факторами в экстрагированной ДНК окружающей среды, на которые влияют типы окружающей среды28,29. Таким образом, в этом исследовании в основном был установлен оптимальный метод ПЦР для обнаружения присутствия генов, связанных с циклом CH4, в прибрежных водно-болотных угодьях Южного Техаса (рисунок 1), а затем визуализирована их количественная относительная численность в этих экосистемах. Результаты этого исследования могут быть применены к другим прибрежным регионам для улучшения понимания круговоротаCH4 и микробной динамики в различных прибрежных экосистемах.

протокол

1. Забор образцов

  1. Соберите образцы отложений с помощью пробоотборника или лопаты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пробы были собраны на двух станциях трех различных прибрежных водно-болотных угодий в прохладный (октябрь-февраль, средняя температура 20 °C) и теплый (апрель-июнь, средняя температура 27 °C) сезоны 2023 и 2024 годов. При сборе проб из прибрежных пресноводных водно-болотных угодий использовался грейфер для отбора проб осадочных пород (Рисунок 2), а для прибрежных соленых водно-болотных угодий, подверженных воздействию приливов, использовался экскаватор.
  2. Сначала опустите пробоотборник на мелководье и дайте ему опуститься на поверхность осадка (в пределах верхних 50 см) под действием собственного веса, сводя к минимуму нарушение структуры осадка, как показано на рисунке 2.
  3. Вытащите его из толщи воды, глубина которой обычно составляла от 60 см до 215 см30 см, переложите образцы осадка в пакеты с застежкой-молнией и немедленно храните их в холодильнике.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите и промойте пробоотборник грейфера деионизированной (DI) водой, прежде чем переходить к следующим станциям.
  4. Храните все образцы при температуре -20 °C немедленно в лаборатории.
  5. На каждом участке отбора проб измерьте параметры качества поверхностных вод, такие как соленость и температура in situ, с помощью многопараметрического измерителя качества воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Зонды промывали деионизированной водой (деионизированной водой) после использования на каждой станции.

2. Экстракция геномной ДНК

  1. Разморозьте образцы при комнатной температуре перед началом процедуры экстракции геномной ДНК.
  2. Перенесите примерно 500 мг образцов осадка в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при давлении 4 250 × г в течение 3 минут, чтобы удалить всю воду.
  3. Извлеките геномную ДНК с помощью набора для экстракции ДНК из почвы в соответствии с протоколом производителя31 с небольшими изменениями и немедленно храните при температуре -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изменения были внесены для сокращения избыточности и повышения эффективности рабочего процесса.
    1. Добавьте до 500 мг образца почвы в стеклянную пробирку, содержащую шарики/керамические сферы.
    2. Добавьте 978 мкл буфера фосфата натрия в образец в пробирке, содержащей шарики/сферы.
    3. Добавьте 122 мкл раствора для лизиса буфера в образец в пробирке, содержащей шарики/сферы, для растворения внешних загрязнений.
    4. Гомогенизируйте с помощью гомогенизатора бисерной мельницы на скорости, в 5 раз превышающей скорость, в течение 20 с и повторите 2 раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовался гомогенизатор бисерной мельницы, поэтому скорость была отрегулирована.
    5. Центрифугируйте смесь в течение 10 мин при 14 000 × г.
    6. Перенесите надосадочную жидкость в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 2,0 мл.
    7. Добавьте 250 мкл раствора белкового осаждения (PPS) для отделения солюбилизированных нуклеиновых кислот от клеточного мусора и лизирующей матрицы. Перемешайте, перевернув трубку в 10 раз.
    8. Центрифугируйте при 14 000 × г в течение 5 мин для осаждения гранул, удаления клеточного мусора и лизирующей матрицы.
    9. Переложите надосадочную жидкость в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 15 мл.
    10. Добавьте 1,0 мл суспензии Binding Matrix в надосадочную жидкость в пробирке объемом 15 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед добавлением суспензии Binding Matrix встряхните ее для повторного суспензирования.
    11. Дайте ДНК соединиться со связывающей матрицей, поместив пробирки на вращатель на 2 минуты.
    12. Поместите все пробирки на решетку и инкубируйте в течение 3 минут, чтобы дать возможность оседать связующей матрице.
    13. Через 3 минуты сбросить 750 мкл и аккуратно смешать оставшуюся надосадочную жидкость с гранулой с помощью пипетки.
    14. Перелейте 750 μл смеси в фильтр SPIN и центрифугируйте при 14 000 × г в течение 1 минуты. Опорожните улавливающую трубку и используйте ее повторно. Повторите то же самое с оставшейся смесью.
    15. Добавьте 500 мкл приготовленного моющего раствора (с добавлением соответствующего количества этанола) для дальнейшего растворения загрязнений. Аккуратно суспендируйте гранулу, используя силу жидкости с наконечника пипетки.
    16. Центрифугируйте при 14 000 × г в течение 1 минуты для удаления загрязнений. Опорожните улавливающую трубку и используйте ее повторно.
    17. Снова центрифугируйте при 14 000 × г в течение 2 минут, ничего не добавляя.
    18. Замените улавливающую трубку на новую, чистую улавливающую трубку и высушите фильтр SPIN на воздухе в течение 5 минут при комнатной температуре.
    19. Добавьте 50 μл свободной воды ДНКазы (DES) и центрифугируйте при 14 000 × г в течение 1 минуты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе 50 μL DES использовали для элюирования ДНК для обеспечения оптимального восстановления и стабильности экстрагированной ДНК из окружающей среды (eDNA).

3. Количественная оценка ДНК

  1. Добавьте 1 мкл экстрагированной ДНК с 200 мкл флуоресцентного красителя в пробирку объемом 0,5 мл и тщательно перемешайте с помощью пипетирования.
  2. Немедленно оберните тубу алюминиевой фольгой, чтобы свет не мог проникнуть, и выдерживайте при комнатной температуре в течение 5 минут.
  3. Измерьте концентрацию ДНК с помощью флуориметра в режиме ОДНОЙ концентрации ДНК в соответствии с протоколом производителя.

4. Обнаружение 16S рРНК, pmoA1 , pmoA2 , mmoX и mcrA методом обычной ПЦР

  1. Перед проведением обычной ПЦР (ПЦР) разморозьте все образцы и реагенты в ведре со льдом.
  2. Разбавьте все экстрагированные образцы эДНК до 10 нг/мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Список грунтовок приведен в таблице 1.
  3. Приготовьте реакционную смесь кПЦР объемом 25 мкл для каждого образца, включающую 12,5 мкл 2x мастер-смеси для ПЦР, 0,5 мкл прямых и обратных праймеров (10 мкМ) (список праймеров см. в Таблице 1 ), 1 мкл 10 нг/мкл эДНК и 10,5 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте мастер-смесь с достаточным объемом для одной дополнительной пробы, чтобы свести к минимуму ошибки пипетирования.
  4. Реакцию ПЦР проводят в соответствии с протоколом, состоящим из начальной денатурации при 95 °С в течение 2 мин, затем 40 циклов денатурации при 95 °С в течение 45 с, удлинения при 72 °С в течение 30 с и окончательного удлинения при 72 °С в течение 5 м, с различной температурой отжига для различных праймеров (см. Таблицу 1 для температур отжига различных праймеров, используемых для разных генов).
    Примечание: Для гена mcrA праймеры ML показали желаемую полосу, используя медленную скорость нарастания 0,1 °C/s между стадиями отжига и удлинения в течение первых пяти циклов32.
  5. Визуализируйте продукты ПЦР в агарозном геле, предварительно окрашенном бромидом этидия (EtBr).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 2,5% агарозный гель для лестницы 50 bp и 0,9% гель для лестницы 1 kb. Используйте 1x буфер TAE для 2,5% агарозного геля и 0,5x буфер TAE для 0,9% агарозного геля.

5. Определение pmoA1 , pmoA2 , mmoX и mcrA методом количественной ПЦР в реальном времени

Примечание: Гены, нацеленные на метаноген и метанотроф, такие как pmoA1, pmoA2, mmoX и mcrA , наблюдались с помощью количественной ПЦР с использованием системы ПЦР в реальном времени.

  1. Подготовьте стандарты для каждого гена отдельно, чтобы получить стандартную кривую для каждого гена.
    1. Амплифицируйте целевой ген с помощью ПЦР, используя образцы, которые дали самую яркую полосу во время гель-электрофореза каждого гена. Следуйте методу и праймерам, описанным в разделе 4.
    2. Очистите амплифицированные продукты с помощью набора для экстракции гелем и измерьте концентрацию ДНК в соответствии с методом, описанным в разделе 3, и храните при температуре -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разложите очищенные стандарты по отдельным пробиркам для дальнейшего использования.
    3. Рассчитайте копии генов по измеренной концентрации ДНК с помощью веб-сайта для расчета числа копий для количественной ПЦР.
    4. Разбавьте рассчитанное число экземпляров стандарта водой, не содержащей нуклеаз, для приготовления каждого стандарта в диапазоне от 108 до 102 копий/мкл, перед проведением количественной ПЦР.
    5. Подготовьте стандартную кривую с использованием трех повторений каждого номера копии, включая отрицательный контроль (NTC, без матричной ДНК).
      Примечание: Значение R2 каждой стандартной кривой было больше 0,99.
  2. Приготовьте реакционную смесь для количественной ПЦР объемом 20 мкл для всех образцов, стандартов и NTC. Выполните анализ количественной ПЦР в трех экземплярах для всех образцов.
    1. Перед началом поместите все компоненты реакции, включая мастер-смесь для количественной ПЦР, праймеры, безнуклеазную воду, стандарты и образцы.
    2. Приготовьте реакционную смесь количественной ПЦР объемом 20 мкл для каждого образца, стандарта и NTC, содержащую 10 мкл мастер-смеси SYBR Green, по 0,5 мкл каждого прямого и обратного праймеров объемом 10 мкМ, 8 мкл воды, не содержащей нуклеаз, и 1 мкл либо 10 нг/мкл матричной ДНК, либо стандартной, либо деионизированной воды соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте показанные наборы праймеров для получения оптимальных результатов для генов pmoA1 и mcrA в обычной ПЦР для количественной ПЦР (см. Таблицу 1). Для повышения точности прогоните каждый образец в трех экземплярах. Следующие шаги обеспечивают эффективный метод подготовки тройных образцов с общим объемом 60 мкл на образец.
      1. Приготовьте реакционную смесь, чтобы объединить мастер-смесь, прямые и обратные праймеры для конкретного гена и безнуклеазную воду в пробирке объемом 2 мл, за исключением матричной ДНК.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте объем реакционной смеси с учетом погрешности пипетирования. Например, если имеется 24 образца и 8 стандартов, рассчитайте общий объем для 33 реакций вместо 32 реакций, чтобы свести к минимуму ошибки пипетирования. В этом случае общий объем, необходимый для тройных реакций, будет следующим: 990 мкл мастер-смеси (33 образца х 3 репликата х 10 мкл), 49,5 мкл прямых праймеров (33 образца х 3 репликата х 0,5 мкл), 49,5 мкл обратных праймеров (33 образца х 3 репликата х 0,5 мкл) и 792 мкл воды, не содержащей нуклеаз (33 образца х 3 репликата х 8 мкл).
      2. Подготовьте ПЦР-пробирки в соответствии с количеством образцов и стандартами.
      3. Распределите по 57 мкл приготовленной реакционной смеси в каждую ПЦР-пробирку.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для проведения количественной ПЦР для каждого образца в трех экземплярах приготовьте общий объем реакционной смеси 57 мкл на образец (без учета матричной ДНК, стандартной или воды). Этот объем будет разделен поровну на три лунки для одного образца, на каждую из которых будет выделено 19 μL.
      4. Добавьте в каждую пробирку 3 мкл матричной ДНК, стандартной или безнуклеазной воды и перемешайте, осторожно постукивая по дну пробирки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем реакционной смеси, приготовленной для одного образца, теперь составляет 60 мкл в каждой пробирке.
    3. Аликвотировать 20 мкл приготовленной реакционной смеси из каждой пробирки в предназначенные для этого лунки 96-луночного планшета для количественной ПЦР. Запечатайте ПЦР-планшет клейкой герметизирующей пленкой ПЦР с помощью аппликатора.
    4. Центрифугируйте герметичную пластину при давлении 1 000 × г в течение 1 минуты, чтобы обеспечить правильное перемешивание и удалить любые пузырьки в лунках.
  3. Поместите ПЦР-планшет в термоамплификатор. Включите аппарат для количественной ПЦР, а затем откройте соответствующее программное обеспечение, чтобы настроить протокол.
    1. Настройте протокол в соответствии с рекомендациями по производству мастер-микса для количественной ПЦР. Используйте следующий протокол: 95 °C в течение 10 минут, затем 95 °C в течение 15 с и шаг удлинения при 72 °C в течение 30 с. Этап отжига выполнять при температуре отжига, указанной для соответствующих грунтовок в таблице 1 , в течение 45 с. Проведите все прогоны количественной ПЦР в течение 35 циклов.
    2. Установите 96-луночный планшет для количественной ПЦР со стандартами и NTC в той же конфигурации, что и планшет с образцом.
  4. Используйте метод стандартной кривой абсолютной количественной оценки для количественной оценки амплифицированного продукта и числа копий гена в каждом образце33.

6. Визуализация генов, циклирующих метан, на карте прибрежных водно-болотных угодий Южного Техаса

  1. Откройте программу геоинформационной системы (ГИС) ArcGIS Pro и сохраните файл проекта с именем Study Area в указанной папке на компьютере.
  2. Нажмите на карту в левом верхнем углу | Базовая карта и выберите Terrain with Labels в качестве базовой карты.
  3. Нажмите « Найти» | Выполните поиск и, когда откроется строка поиска, найдите изучаемую область, введя название области; Область отобразится.
  4. Нарисуйте конкретную область с помощью пространственной привязки.
    1. Нажмите на Просмотр | Панель каталога из верхнего слоя.
    2. Дважды кликните по Папке из каталога | Имя файла.
    3. Щелкните правой кнопкой мыши по файлу базы геоданных (.gdb), а затем нажмите на Создать | Отобразятся Класс пространственных объектов и Создать класс пространственных объектов .
    4. Введите поле «Имя и псевдоним» и нажмите «Готово» внизу.
    5. Нажмите на Просмотр | Содержание. Имя псевдонима будет отображаться на панели содержания.
    6. Нажмите на Редактировать из верхнего слоя | Создайте. Откроется панель Создать функции . Дважды щелкните на Псевдониме на панели Создать функции , и появится Настройка опций обратной связи с инструментом .
    7. Выберите Линии, затем нарисуйте линии на карте, чтобы создать внешнюю границу изучаемой области. По завершении дважды щелкните по карте.
  5. Сверните программное обеспечение ГИС, а затем откройте таблицу. Введите имя образца в первом столбце, введите широту во втором столбце и долготу в третьем столбце. Используйте следующие четыре столбца для данных количественной ПЦР pmoA1, pmoA2, mmoX и mcrA.
  6. Сохраните файл в формате CSV в любой конкретной папке компьютера.
  7. Снова откройте программное обеспечение ГИС и нажмите Добавить данные | Данные о точках XY.
  8. Выберите файл CSV в папке на компьютере в поле Таблица ввода . Переименуйте имя файла в Выходном классе объектов, затем щелкните Выполнить , чтобы отобразить точки выборки на карте.
  9. Нажмите на строку поиска вверху и выполните поиск Kriging.
  10. Выберите файл станции отбора проб, а затем выберите pmoA1.
  11. Нажмите кнопку Окружающая среда | выберите станцию отбора проб в слое и маске | нажмите кнопку Выполнить.
  12. Следуйте протоколам, упомянутым в шагах 6.9, 6.10 и 6.11, чтобы создать Kriging для pmoA2, mmoX и mcrA для всей изучаемой области.
  13. Создайте компоновку карты.
    1. Нажмите на кнопку Вставить из верхнего слоя | Новый макет и выберите ANSI - Landscape.
    2. Нажмите на Рамку карты, выберите карту с помощью кригинга и разместите все карты на схеме, нарисовав прямоугольник. Это сделает карту видимой на компоновке.
    3. Выберите стрелку севера и разместите ее на макете, чтобы указать направление на север.
    4. Выберите Масштабная линейка , чтобы отобразить масштаб области на карте.
    5. Нажмите на Легенда , чтобы отобразить легенды, затем разместите их в компоновке.
    6. Нажмите кнопку Сетка и выберите любой из вариантов черной сетки. Это создаст сетку с широтой и долготой и отобразит ее на панели содержания с надписью Black Horizontal Label Graticule.
    7. Дважды кликните на Черная горизонтальная сетка надписи, затем выберите Компоненты. Нажмите на Галочки 1 и Сетку, и удалите эти компоненты, нажав на крестик справа от них.
  14. Нажмите « Поделиться » на верхнем слое, затем нажмите «Экспортировать макет». Выберите тип файла как PDF, сохраните файл на компьютере с помощью поля имени, установите вертикальное разрешение на 500 точек на дюйм и нажмите кнопку Экспорт , чтобы создать PDF-файл карты.

Результаты

Чтобы понять распределение и обилие генов, связанных с циклом CH4 (mcrA, pmoA1, pmoA2 и mmoX) в прибрежных водно-болотных угодьях Южного Техаса, извлеченная эДНК из каждого образца была проанализирована с помощью ПЦР и кПЦР. Из предыдущих исследований был...

Обсуждение

Прибрежные водно-болотные угодья признаны значительными источниками атмосферного метана, важного парникового газа40. Несмотря на то, что были проведены исследования потока метана и метаногенов в водно-болотных угодьях41,42,43

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Мы благодарны членам C-REAL за помощь в проведении полевых наблюдений и лабораторных анализов.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL PCR tubesThermoFisher ScientificAB0620https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AB0620?SID=srch-srp-AB0620
0.5 mL PCR TubesPromegaE4941https://www.promega.com/products/biochemicals-and-labware/tips-and-accessories/0_5ml-pcr-tubes/?catNum=E4941
10 μL tipsThermoFisher Scientific05-408-187Fisherbrand SureGrip Pipet Tip Racked or Reload System Tips Natural; 10μL; | Fisher Scientific
15 mL centrifuge tubeThermoFisher Scientific14-959-53Ahttps://www.fishersci.com/shop/products/falcon-15ml-conical-centrifuge-tubes-5/p-193301
200 μL tipsThermoFisher Scientific05-408-190Fisherbrand SureGrip Pipet Tip Racked or Reload System Tips Natural; 200μL; | Fisher Scientific
1000 μL tipsThermoFisher Scientific02-707-402https://www.fishersci.com/shop/products/sureone-micropoint-pipette-tips-specific-standard-fit/02707402?gclid=Cj0KCQiAp
NW6BhD5ARIsACmEb
kUsQ9Lu0YIq5i4vWege
17qPdtxIYZyvmJH1cDo
ARuwereO1V4GLz9UaA
lDREALw_wcB&ef_id=C
j0KCQiApNW6BhD5ARI
sACmEbkUsQ9Lu0YIq5i
4vWege17qPdtxIYZyvmJ
H1cDoARuwereO1V4GLz
9UaAlDREALw_wcB:G:s
&ppc_id=PLA_goog_2175
7693617_171052169911_02
707402__715434303113_1555
377385658230343&ev_chn=sh
op&s_kwcid=AL!4428!3!71543430
3113!!!g!2366517300713!&gad_source=1
Applied Biosystem Power SYBR Green Master Mix ThermoFisher Scientific4368577https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4368577
ArcGIS Pro esrihttps://www.esri.com/en-us/arcgis/products/arcgis-pro/overview?srsltid=AfmBOopatJ4
JvHJfscHRcAaDx0Jz5_Jrl8l5
vYkkBvfOqE-uNSsMghN1
CFX Duet Real-Time PCR system Bio-Rad12016265https://www.bio-rad.com/en-us/product/cfx-duet-real-time-pcr-system?ID=97722926-9ed9-16a4-1d83-c92f587e427a
Corning Lambda plus single channel pipettor
volume 0.5-10 μL		Sigma-AldrichCLS4071-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cls4071
Corning Lambda plus single channel pipettor volume 100-1000 μLSigma-AldrichCLS4075-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cls4075
Corning Lambda plus single channel pipettor volume 20-200 μLSigma-AldrichCLS4074-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cls4074
FastDNA spin kit for soilMP Biomedical116560200-CFhttps://www.mpbio.com/us/116560000-fastdna-spin-kit-for-soil-samp-cf?srsltid=AfmBOoqOxxGilzY3IHNIZR
ajegGTr9MoX1oMZUh
3dcbJqe0UvvukY128
Gene copy  calculatorScience Primerhttps://scienceprimer.com/copy-number-calculator-for-realtime-pcr .
High speed benchtop centrifugeThermoFisher Scientific75004241https://newlifescientific.com/products/thermo-scientific-sorvall-st16-high-speed-benchtop-centrifuge-75004241?gad_source=1&gclid=Cj0KCQiApN
W6BhD5ARIsACmEbkVC_-cCIN9j
20TvYq8iDsBlUR5cPK_1_wN
OBEcjMdv-CYVoGCfeOLYaAv
enEALw_wcB
High speed microcentrifugeVWR75838-336https://us.vwr.com/store/product/20546590/null
Lysing Matrix E tube glass bead/ceramic sphere-containing tube
Microcentrifuge tubeThermoFisher Scientific02-681-320https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/02681320?gclid=Cj0KCQiAp
NW6BhD5ARIsACm
EbkWbG4_o3oUiGk
HJPU-_31-CuexDwQ
fmWPnfyhBOf2BHXsy
K3fFW1toaAgJbEALw_
wcB&ef_id=Cj0KCQiAp
NW6BhD5ARIsACmEb
kWbG4_o3oUiGkHJPU-
_31-CuexDwQfmWPnfy
hBOf2BHXsyK3fFW1toa
AgJbEALw_wcB:G:s&ppc
_id=PLA_goog_21757693
617_171052169911_0268
1320__715434303113_10
349826094968484711&ev
_chn=shop&s_kwcid=AL!4
428!3!715434303113!!!g!23
66517300713!&gad_source=1
PCR Master mix PromegaM7502https://www.promega.com/products/pcr/taq-polymerase/master-mix-pcr/?catNum=M7502
Quantiflour ONE dsDNA system PromegaE4871https://www.promega.com/products/rna-analysis/dna-and-rna-quantitation/quantifluor-one-dsdna-system/?gad_source=1&gbraid=0AAAAAD
_rg189yJTY3cxeVqMdu8RPx10
Ma&gclid=CjwKCAjwxNW2BhAk
EiwA24Cm9FUgViPNyWq7UfZL
VeeoroLAZ5JIP6w07RGK_4D0w
oZgAqf-G1XTmxoCxm8QAvD_B
wE&catNum=E4871
Quantus Fluorometer PromegaE6150https://www.promega.com/products/microplate-readers-fluorometers-luminometers/fluorometers/quantus-fluorometer/?catNum=E6150
YSI Pro 2030YSI a xylem brand603174https://www.ysi.com/product/id-p2030/pro2030-kits

Ссылки

  1. Xu, T., et al. Wetlands of international importance: Status, threats, and future protection. Int J Environ Res Public Health. 16 (10), 1818 (2019).
  2. Corn, M. L. . Deepwater Horizon oil spill: coastal wetland and wildlife impacts and response. , (2010).
  3. Hendriks, I. E., Sintes, T., Bouma, T. J., Duarte, C. M. Experimental assessment and modeling evaluation of the effects of the seagrass Posidonia oceanica on flow and particle trapping. Marine Ecology Progress Series. 356, 163-173 (2008).
  4. Krause, S. J. E., Treude, T. Deciphering cryptic methane cycling: Coupling of methylotrophic methanogenesis and anaerobic oxidation of methane in hypersaline coastal wetland sediment. Geochimica et Cosmochimica Acta. 302, 160-174 (2021).
  5. Reddy, K. R., DeLaune, R. D., Inglett, P. W. . Biogeochemistry of Wetlands: Science and Applications. , (2022).
  6. La, W., et al. Sulfate concentrations affect sulfate reduction pathways and methane consumption in coastal wetlands. Water Research. 217, 118441 (2022).
  7. Derwent, R. G. Global warming potential (GWP) for methane: Monte Carlo analysis of the uncertainties in Global Tropospheric Model predictions. Atmosphere. 11 (5), 486 (2020).
  8. Potter, C., et al. Methane emissions from natural wetlands in the United States: Satellite-derived estimation based on ecosystem carbon cycling. Earth Interactions. 10 (22), 1-12 (2006).
  9. . Understanding global warming potentials Available from: https://www.epa.gov/ghgemissions/understanding-global-warming-potentials (2024)
  10. Wallenius, A. J., Dalcin Martins, P., Slomp, C. P., Jetten, M. S. M. Anthropogenic and environmental constraints on the microbial methane cycle in coastal sediments. Front Microbiol. 12, 631621 (2021).
  11. Qu, Y., et al. Salinity causes differences in stratigraphic methane sources and sinks. Environmental Science and Ecotechnology. 19, 100334 (2024).
  12. Vizza, C., West, W. E., Jones, S. E., Hart, J. A., Lamberti, G. A. Regulators of coastal wetland methane production and responses to simulated global change. Biogeosciences. 14 (2), 431-446 (2017).
  13. van Dijk, G., et al. Salinization lowers nutrient availability in formerly brackish freshwater wetlands; unexpected results from a long-term field experiment. Biogeochemistry. 143 (1), 67-83 (2019).
  14. Aronson, E., Allison, S., Helliker, B. R. Environmental impacts on the diversity of methane-cycling microbes and their resultant function. Front Microbiol. 4, 225 (2013).
  15. Reeburgh, W. S. Oceanic methane biogeochemistry. Chem Rev. 107 (2), 486-513 (2007).
  16. Thauer, R. K. Biochemistry of methanogenesis: a tribute to Marjory Stephenson. Marjory Stephenson Prize Lecture. Microbiology (Reading). 144 (Pt 9), 2377-2406 (1998).
  17. Thauer, R. K. Anaerobic oxidation of methane with sulfate: on the reversibility of the reactions that are catalyzed by enzymes also involved in methanogenesis from CO2. Curr Opin Microbiol. 14 (3), 292-299 (2011).
  18. Friedrich, M. W. Methyl-coenzyme M reductase genes: Unique functional markers for methanogenic and anaerobic methane-oxidizing Archaea. Methods in Enzymology. 397, 428-442 (2005).
  19. Reeburgh, W. S. Oceanic methane biogeochemistry. Chem Rev. 107 (2), 486-513 (2007).
  20. Rasigraf, O., Schmitt, J., Jetten, M. S. M., Lüke, C. Metagenomic potential for and diversity of N-cycle driving microorganisms in the Bothnian Sea sediment. Microbiologyopen. 6 (4), e00475 (2017).
  21. McDonald, I. R., Bodrossy, L., Chen, Y., Murrell, J. C. Molecular ecology techniques for the study of aerobic methanotrophs. Appl Environ Microbiol. 74 (5), 1305-1315 (2008).
  22. Tchawa Yimga, M., Dunfield, P. F., Ricke, P., Heyer, J., Liesack, W. Wide distribution of a novel pmoA-like gene copy among type II methanotrophs, and its expression in Methylocystis strain SC2. Appl Environ Microbiol. 69 (9), 5593-5602 (2003).
  23. Knief, C. Diversity and habitat preferences of cultivated and uncultivated aerobic methanotrophic bacteria evaluated based on pmoA as molecular marker. Front Microbiol. 6, 1346 (2015).
  24. Huang, I. -. S., et al. Preliminary assessment of microbial community structure of Wind-Tidal Flats in the Laguna Madre, Texas, USA. Biology. 9 (8), 183 (2020).
  25. Wilding, T. K., Brown, E., Collier, K. J. Identifying dissolved oxygen variability and stress in tidal freshwater streams of northern New Zealand. Environ Monit Assess. 184 (10), 6045-6060 (2012).
  26. Roy Chowdhury, T., Mitsch, W. J., Dick, R. P. Seasonal methanotrophy across a hydrological gradient in a freshwater wetland. Ecological Engineering. 72, 116-124 (2014).
  27. Sun, Q. -. Q., et al. Carbon dioxide and methane fluxes: Seasonal dynamics from inland riparian ecosystems, northeast China. Sci Total Environ. 465, 48-55 (2013).
  28. Lee, S., et al. Comparison and selection of conventional PCR primer sets for studies associated with nitrogen cycle microorganisms in surface soil. Appl Sci. 12 (20), 10314 (2022).
  29. Bae, K. -. S., et al. Development of diagnostic systems for wide range and highly sensitive detection of two waterborne hepatitis viruses from groundwater using the conventional reverse transcription nested PCR assay. J Virol Methods. 299, 114344 (2022).
  30. Lecusay, D. . Assessment and Monitoring of Deltaic Wetlands and Fluvial Systems: Refining and Validating a Multimetric Index of Resaca Ecosystem Health. , (2021).
  31. . FastDNA SPIN Kit for Soil (Cat No. 116560200) Available from: https://www.mpbio.com/media/productattachment/LS082019-EN-FastDNA-SPIN-Kit-for-Soil-116560200-Manual.pdf (2025)
  32. Luton, P. E., Wayne, J. M., Sharp, R. J., Riley, P. W. The mcrA gene as an alternative to 16S rRNA in the phylogenetic analysis of methanogen populations in landfill. Microbiology (Reading, England). 148 (Pt 11), 3521-3530 (2002).
  33. Changsoo, L., Jaai, K., Seung Gu, S., Seokhwan, H. Absolute and relative QPCR quantification of plasmid copy number in Escherichia coli. J Biotechnol. 123 (3), 273-280 (2006).
  34. Harms, G., et al. Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant. Environ Sci Technol. 37 (2), 343-351 (2003).
  35. Holmes, A. J., Costello, A., Lidstrom, M. E., Murrell, J. C. Evidence that particulate methane monooxygenase and ammonia monooxygenase may be evolutionarily related. FEMS Microbiol Lett. 132 (3), 203-208 (1995).
  36. Fuse, H., et al. Oxidation of trichloroethylene and dimethyl sulfide by a marine Methylomicrobium strain containing soluble methane monooxygenase. Biosci Biotechnol Biochem. 62 (10), 1925-1931 (1998).
  37. Springer, E., Sachs, M. S., Woese, C. R., Boone, D. R. Partial gene sequences for the A subunit of methyl-coenzyme M reductase (mcrI) as a phylogenetic tool for the family Methanosarcinaceae. Int J Syst Bacteriol. 45 (3), 554-559 (1995).
  38. Costello, A. M., Lidstrom, M. E. Molecular characterization of functional and phylogenetic genes from natural populations of methanotrophs in lake sediments. Appl Environ Microbiol. 65 (11), 5066-5074 (1999).
  39. Flores, E. A. . Effects of Nutrient Enrichment on Mangrove and Saltmarsh Habitats. , (2022).
  40. Minjie, H., Jordi, S., Xianyu, Y., Josep, P., Chuan, T. Patterns and environmental drivers of greenhouse gas fluxes in the coastal wetlands of China: A systematic review and synthesis. Environ Res. 186, 109576 (2020).
  41. Bridgham, S. D., Cadillo-Quiroz, H., Keller, J. K., Zhuang, Q. Methane emissions from wetlands: biogeochemical, microbial, and modeling perspectives from local to global scales. Glob Chang Biol. 19 (5), 1325-1346 (2013).
  42. Liu, D. Y., Ding, W. X., Jia, Z. J., Cai, Z. C. Relation between methanogenic archaea and methane production potential in selected natural wetland ecosystems across China. Biogeosciences. 8 (2), 329-338 (2011).
  43. Ke, Z., et al. Methane emissions and methanogenic community investigation from constructed wetlands in Chengdu City. Urban Climate. 39, 100956 (2021).
  44. Chowdhury, T. R., Dick, R. P. Ecology of aerobic methanotrophs in controlling methane fluxes from wetlands. Applied Soil Ecology. 65, 8-22 (2013).
  45. Maja, S., et al. Humic substances cause fluorescence inhibition in real-time polymerase chain reaction. Anal Biochem. 487, 30-37 (2015).
  46. Sanches, T. M., Schreier, A. D. Optimizing an eDNA protocol for estuarine environments: Balancing sensitivity, cost and time. PLOS ONE. 15 (5), e0233522 (2020).
  47. Xia, Z., et al. Conventional versus real-time quantitative PCR for rare species detection. Ecol Evol. 8 (23), 11799-11807 (2018).
  48. Bourne, D. G., McDonald, I. R., Murrell, J. C. Comparison of pmoA PCR primer sets as tools for investigating methanotroph diversity in three Danish soils. Appl Environ Microbiol. 67 (9), 3802-3809 (2001).
  49. Juottonen, H., Galand, P. E., Yrjala, K. Detection of methanogenic Archaea in peat: comparison of PCR primers targeting the mcrA gene. Res Microbiol. 157 (10), 914-921 (2006).
  50. Lueders, T., Friedrich, M. W. Evaluation of PCR amplification bias by terminal restriction fragment length polymorphism analysis of small-subunit rRNA and mcrA genes by using defined template mixtures of methanogenic pure cultures and soil DNA extracts. Appl Environ Microbiol. 69 (1), 320-326 (2003).
  51. Vaksmaa, A., Jetten, M. S., Ettwig, K. F., Luke, C. McrA primers for the detection and quantification of the anaerobic archaeal methanotroph 'Candidatus Methanoperedens nitroreducens'. Appl Microbiol Biotechnol. 101 (4), 1631-1641 (2017).
  52. Ren, G., et al. Electron acceptors for anaerobic oxidation of methane drive microbial community structure and diversity in mud volcanoes. Environ Microbiol. 20 (7), 2370-2385 (2018).
  53. Goldberg, C. S., et al. Critical considerations for the application of environmental DNA methods to detect aquatic species. Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1299-1307 (2016).
  54. McKee, A. M., Spear, S. F., Pierson, T. W. The effect of dilution and the use of a post-extraction nucleic acid purification column on the accuracy, precision, and inhibition of environmental DNA samples. Biological Conservation. 183, 70-76 (2015).
  55. Gohl, D. M., et al. Systematic improvement of amplicon marker gene methods for increased accuracy in microbiome studies. Nat Biotechnol. 34 (9), 942-949 (2016).
  56. Ballarini, A., Segata, N., Huttenhower, C., Jousson, O. Simultaneous quantification of multiple bacteria by the BactoChip microarray designed to target species-specific marker genes. PLOS ONE. 8 (2), e55764 (2013).
  57. Le Mer, J., Roger, P. Production, oxidation, emission and consumption of methane by soils: A review. Eur J Soil Biol. 37 (1), 25-50 (2001).
  58. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 67 (1), 6-20 (2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

McrAPmoA1PmoA2MmoXArcGIS Pro

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены