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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das Protokoll erkennt wichtige Gene für den Methankreislauf in den Feuchtgebieten der südtexanischen Küste und visualisiert ihre räumliche Verteilung, um das Verständnis der Methanregulierung und ihrer Umweltauswirkungen in diesen dynamischen Ökosystemen zu verbessern.

Zusammenfassung

Küstenfeuchtgebiete sind die größte biotische Quelle für Methan, wo Methanogene organisches Material in Methan umwandeln und Methanotrophe Methan oxidieren und somit eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Methankreislaufs spielen. Die Feuchtgebiete in Südtexas, die aufgrund des Klimawandels häufigen Wetterereignissen, schwankenden Salzgehalten und anthropogenen Aktivitäten ausgesetzt sind, beeinflussen den Methankreislauf. Trotz der ökologischen Bedeutung dieser Prozesse ist der Methankreislauf in den Feuchtgebieten der südtexanischen Küste nach wie vor unzureichend erforscht. Um diese Lücke zu schließen, haben wir eine Methode zum Nachweis von Genen entwickelt und optimiert, die mit Methanogenen und Methanotrophen in Verbindung stehen, einschließlich mcrA als Biomarker für Methanogene und pmoA1, pmoA2 und mmoX als Biomarker für Methanotrophe. Darüber hinaus zielte diese Studie darauf ab, die räumlichen und zeitlichen Verteilungsmuster der Methanogen- und Methanotrophenhäufigkeit mit Hilfe der GIS-Software (Geographic Information System) ArcGIS Pro zu visualisieren. Die Integration dieser molekularen Techniken mit fortschrittlicher räumlicher Visualisierung lieferte wichtige Einblicke in die räumliche und zeitliche Verteilung von Methanogen- und Methanotrophengemeinschaften in den Feuchtgebieten von Südtexas. Daher bietet die in dieser Studie etablierte Methodik einen robusten Rahmen für die Kartierung der mikrobiellen Dynamik in Feuchtgebieten, verbessert unser Verständnis des Methankreislaufs unter unterschiedlichen Umweltbedingungen und unterstützt breitere Studien zu ökologischen und ökologischen Veränderungen.

Einleitung

Küstenfeuchtgebiete sind lebenswichtige Ökosysteme, die durch Prozesse wie Kohlenstoffbindung, Evapotranspiration und Methanemissionen (CH4) zur Klimaregulierung, zum Erhalt der biologischen Vielfalt und zum Wassermanagement beitragen1. Diese Ökosysteme, zu denen sowohl Süß- als auch Salzwasserfeuchtgebiete gehören2, sind hochproduktiv und fungieren als kritische Zonen für die Aufnahme von Kohlendioxid (CO2) und binden organisches Material aus der Land- und Meeresumwelt 3,4. Die dynamischen Wechselwirkungen innerhalb dieser Feuchtgebiete stimulieren die Produktion und den Verbrauch von mikrobiellem CH4 5 und positionieren sie als eine der größten natürlichen Quellen für CH46. Als zweitwichtigstes Treibhausgas hat CH4 ein Treibhauspotenzial, das etwa 27-30x höher ist als das von CO2 4,7,8,9, was die Untersuchung der CH4-Emissionen aus Küstenfeuchtgebieten im Zeitalter des Klimawandels unerlässlich macht. Die Emission von CH4 wird von verschiedenen Umweltfaktoren beeinflusst, insbesondere vom Salzgehalt, der eine entscheidende Rolle bei mikrobiellen Prozessen spielt10. Süßwasserfeuchtgebiete tragen aufgrund ihres niedrigeren Sulfatgehalts erheblich zum atmosphärischen Methan bei, was eine höhere mikrobielle CH4-Produktion ermöglicht, während Salzwasserfeuchtgebiete aufgrund höherer Sulfatkonzentrationen im Allgemeinen weniger CH4 ausstoßen 11,12,13.

CH4-Emissionen aus Küstenfeuchtgebieten werden im Allgemeinen durch zwei Gruppen von Mikroorganismen kontrolliert, die als Methanogene und Methanotrophe bekannt sind14. Methanogene produzieren CH4 in anoxischen Sedimenten, indem sie Substrate wie Formiat, Acetat, Wasserstoff oder methylierte Verbindungen durch einen Prozess abbauen, der als Methanogenesebekannt ist 15. Das wichtige Enzym in diesem Signalweg ist die Methyl-Coenzym-M-Reduktase (MCR), da es den letzten und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Methanogenese katalysiert 15,16,17. Das mcrA-Gen, das für die Alpha-Untereinheit von MCR kodiert, ist ein funktioneller Marker, der in allen methanogenen Archaeen zu finden ist18. Darüber hinaus bildet sich in küstennahen Feuchtgebieten die Sulfat-Methan-Übergangszone (SMTZ) über der methanogenen Zone, in der das nach oben diffundierende Methan und das sich nach unten bewegende Sulfat zusammenlaufen und abgebaut werden19. Innerhalb dieser Zone oxidieren anaerobe methanotrophe Archaeen (ANME) Methan mit Hilfe des MCR-Enzyms zu Kohlendioxid, während sulfatreduzierende Bakterien (SRB) Sulfat zu Sulfid reduzieren. SRB verdrängt Methanogene um Wasserstoff und Acetat und begrenzt die Methanproduktion, bis Sulfat erschöpft ist16,17.

Im Gegensatz dazu oxidieren aerobe methanotrophe Bakterien CH4 in aeroben Umgebungen20 unter Verwendung verschiedener Formen der Methanmonooxygenase (MMO). Dazu gehören die partikuläre Methanmonooxygenase (pMMO), ein kupferhaltiges Enzym, das in die intrazytoplasmatische Membran eingebettet ist, und die lösliche Methanmonooxygenase (sMMO), ein eisenhaltiges Enzym, das im Zytoplasma vorkommt. Für pMMO gibt es jedoch drei Genoperone: pmoCAB21; Unter ihnen ist das pmoA-Gen das konservativste für alle Methanotrophen. Es gibt zwei verschiedene Biomarker-Gene für pmoA: pmoA1 und pmoA222. Darüber hinaus wird das mmoX-Gen für ein umfassendes Verständnis von Methanotrophen in der Molekularbiologie als Werkzeug zur Identifizierung von sMMO-haltigen Methanotrophen verwendet23. Diese Unterscheidung der Stoffwechselwege und Umweltanforderungen von Methanogenen und aeroben Methanotrophen unterstreicht die komplexen mikrobiellen Wechselwirkungen, die den Methankreislauf in Küstenfeuchtgebietsökosystemen regulieren.

Das Feuchtgebiet Boca Chica (BC), eine produktive Salzwasserumgebung in Südtexas, ist Gezeiteneinflüssen aus dem Golf von Mexiko (GOM) ausgesetzt, was zu unterschiedlichen Salzgehalten an der Oberfläche führt, insbesondere aufgrund seiner Nähe zur hypersalinen Laguna Madre24. Diese Gezeitenwirkung, die zwischen Ebbe und Flut wechselt, führt zu Schwankungen des Sauerstoffgehalts25 , was die Methanogen- und Methanotrophaktivität in den Sedimenten verändern könnte26. Im Gegensatz dazu gelten küstennahe Süßwasserfeuchtgebiete als signifikanter Hotspot für CH4-Flüsse 27. Die küstennahen Süßwasserfeuchtgebiete in Südtexas, einschließlich Resaca Del Rancho Viejo (RV) und Lozano Banco (LB), die weit von den Gezeiteneffekten der GOM entfernt sind, weisen ein ausgeprägtes hydrologisches Management auf. RV erlebt bei niedrigem Wasserstand Impulsströmungen, die durch Flusswasser ergänzt werden, während LB als Offline-Strömungssystem ohne eine solche Ergänzung arbeitet. Darüber hinaus weisen RV und LB einen niedrigeren Salzgehalt bei, da sie einen hohen Abfluss von künstlich gepumptem Süßwasser aufweisen und es sich um einen Altarm handelt. Die verschiedenen Umweltfaktoren können den Methankreislauf in den Küstenfeuchtgebieten von Südtexas erheblich beeinflussen. Der Methankreislauf in den Feuchtgebieten der südtexanischen Küste ist jedoch nach wie vor ein Bereich, der noch nicht gründlich untersucht wurde.

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und die real-time PCR (auch quantitative PCR [qPCR] genannt) stellen grundlegende und weit verbreitete Techniken zum Nachweis und zur Quantifizierung der relativen Häufigkeit spezifischer Gene in Umweltproben dar. Diese Techniken amplifizieren gezielt Zielregionen der DNA, um das Vorhandensein und die relative Menge von Genen, diemit dem CH-4-Kreislauf in Verbindung stehen, anzuzeigen und Indikatoren für einen potenziellen Methankreislauf zu liefern. Nichtsdestotrotz kann die Verfügbarkeit und Wirksamkeit von PCR-Primer-Sets durch verschiedene inhibitorische Faktoren in der extrahierten Umwelt-DNA eingeschränkt werden, die von der Art der Umgebungen beeinflusst werden28,29. Daher etablierte diese Studie hauptsächlich eine optimale PCR-Methode zum Nachweis des Vorhandenseins von CH 4-Schaltkreis-bezogenen Genen in südtexanischen Küstenfeuchtgebieten (Abbildung 1) und visualisierte dann deren quantifizierte relative Häufigkeit in diesen Ökosystemen. Die Ergebnisse dieser Studie können auf andere Küstenregionen übertragen werden, um das Verständnis des CH4-Kreislaufs und der mikrobiellen Dynamik in verschiedenen Küstenökosystemen zu verbessern.

Protokoll

1. Probenentnahme

  1. Sammeln Sie Sedimentproben mit einem Sedimentgreifer oder einer Schaufel.
    HINWEIS: Die Proben wurden an zwei Stationen von drei verschiedenen Küstenfeuchtgebieten während der kühlen (Oktober-Februar, Durchschnittstemperatur beträgt 20 °C) und warmen (April-Juni, Durchschnittstemperatur 27 °C) Jahreszeiten 2023 und 2024 entnommen. Bei der Entnahme von Proben aus küstennahen Süßwasserfeuchtgebieten (Abbildung 2) wurde ein Sedimentgreifer verwendet, und für gezeitenbeeinflusste Salzwasserfeuchtgebiete an der Küste wurde eine Schaufel verwendet.
  2. Senken Sie den Probenehmer zuerst in das flache Gewässer ab und lassen Sie ihn unter seinem eigenen Gewicht an die Sedimentoberfläche sinken (innerhalb der oberen 50 cm), um die Störung der Sedimentstruktur zu minimieren, wie in Abbildung 2 gezeigt.
  3. Ziehen Sie es aus der Wassersäule, wo die Tiefe typischerweise 60 cm bis 215 cm30 betrug, geben Sie die Sedimentproben in Zip-Lock-Beutel und bewahren Sie sie sofort in einer Eisbox auf.
    HINWEIS: Reinigen und waschen Sie den Probenehmer mit deionisiertem (DI) Wasser, bevor Sie zu den nächsten Stationen gehen.
  4. Lagern Sie alle Proben sofort bei -20 °C im Labor.
  5. Messen Sie an jeder Probenahmestelle Parameter der Oberflächenwasserqualität wie Salzgehalt und Temperatur vor Ort mit einem Multiparameter-Wasserqualitätsmessgerät.
    HINWEIS: Die Sonden wurden nach dem Gebrauch in jeder Station mit entionisiertem Wasser (DI-Wasser) gespült.

2. Extraktion genomischer DNA

  1. Tauen Sie die Proben bei Raumtemperatur auf, bevor Sie mit dem Verfahren zur Extraktion genomischer DNA beginnen.
  2. Übertragen Sie ca. 500 mg Sedimentproben in ein 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie 3 Minuten lang bei 4.250 × g , um das gesamte Wasser zu entfernen.
  3. Extrahieren Sie genomische DNA mit einem DNA-Extraktionskit für Böden nach dem Protokoll31 des Herstellers mit einer kleinen Modifikation und lagern Sie es sofort bei -20 °C.
    HINWEIS: Die Änderungen wurden vorgenommen, um Redundanz zu reduzieren und einen effizienten Arbeitsablauf zu gewährleisten.
    1. Geben Sie bis zu 500 mg Bodenprobe in ein Röhrchen mit Glasperlen/Keramikkugeln.
    2. Geben Sie 978 μl Natriumphosphatpuffer in die Probe in das Kügelchen-/Kugel-enthaltende Röhrchen.
    3. Geben Sie 122 μl Puffer-Lyselösung in die Probe im Bead-/Kugel-haltigen Röhrchen, um externe Verunreinigungen zu lösen.
    4. Mit einem Kugelmühlen-Homogenisator bei 5-facher Drehzahl für 20 s homogenisieren und 2x wiederholen.
      HINWEIS: In dieser Studie wurde ein Kugelmühlen-Homogenisator verwendet, weshalb die Drehzahl angepasst wurde.
    5. Die Mischung 10 min bei 14.000 × g zentrifugieren .
    6. Übertragen Sie den Überstand in ein sauberes 2,0-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
    7. Fügen Sie 250 μl Proteinfällungslösung (PPS) hinzu, um die löslichen Nukleinsäuren von den Zelltrümmern und der Lysematrix zu trennen. Mixen, indem man das Röhrchen 10x umdreht.
    8. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 14.000 × g , um das Pellet auszufällen und die Zelltrümmer und die Lysematrix zu entfernen.
    9. Übertragen Sie den Überstand in ein sauberes 15-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
    10. Geben Sie 1,0 mL der Binding Matrix-Suspension in den Überstand im 15-ml-Röhrchen.
      HINWEIS: Schütteln Sie die Bindungsmatrix-Suspension, um sie erneut zu suspendieren, bevor Sie sie hinzufügen.
    11. Ermöglichen Sie die Bindung der DNA an die Bindungsmatrix, indem Sie die Röhrchen für 2 Minuten auf einen Rotator legen.
    12. Legen Sie alle Röhrchen auf ein Gestell und inkubieren Sie sie 3 Minuten lang, damit sich die Bindungsmatrix absetzen kann.
    13. Nach 3 Minuten werden 750 μl verworfen und der restliche Überstand mit einer Pipette vorsichtig mit dem Pellet vermischt.
    14. 750 μl der Mischung in einen SPIN-Filter geben und 1 min bei 14.000 × g zentrifugieren. Leeren Sie das Auffangrohr und verwenden Sie es wieder. Wiederholen Sie den Vorgang mit der restlichen Mischung.
    15. Fügen Sie 500 μl der vorbereiteten Waschlösung (mit der entsprechenden Menge Ethanol) hinzu, um Verunreinigungen weiter aufzulösen. Suspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit der Kraft der Flüssigkeit aus der Pipettenspitze.
    16. Zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei 14.000 × g , um Verunreinigungen zu entfernen. Leeren Sie das Auffangrohr und verwenden Sie es wieder.
    17. Erneut bei 14.000 × g für 2 min zentrifugieren, ohne etwas hinzuzufügen.
    18. Ersetzen Sie das Auffangrohr durch ein neues, sauberes Auffangrohr und trocknen Sie den SPIN-Filter 5 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft.
    19. 50 μl DNAse freies Wasser (DES) zugeben und bei 14.000 × g für 1 min zentrifugieren.
      HINWEIS: In diesem Protokoll wurden 50 μl DES für die DNA-Elution verwendet, um eine optimale Rückgewinnung und Stabilität der extrahierten Umwelt-DNA (eDNA) zu gewährleisten.

3. DNA-Quantifizierung

  1. 1 μl extrahierte DNA mit 200 μl Fluoreszenzfarbstoff in ein 0,5-ml-Röhrchen geben und durch Pipettieren gründlich mischen.
  2. Wickeln Sie das Röhrchen sofort mit Alufolie ein, damit kein Licht eindringen kann, und inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  3. Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Fluorometer im ONE DNA-Konzentrationsmodus gemäß dem Protokoll des Herstellers.

4. Nachweis von 16S rRNA, pmoA1 , pmoA2 , mmoX und mcrA durch konventionelle PCR

  1. Tauen Sie vor der herkömmlichen PCR (cPCR) alle Proben und Reagenzien in einem Eiskübel auf.
  2. Verdünnen Sie alle extrahierten eDNA-Proben auf 10 ng/μl.
    HINWEIS: Eine Liste der Grundierungen ist in Tabelle 1 enthalten.
  3. Bereiten Sie für jede Probe ein 25-μl-cPCR-Reaktionsgemisch vor, einschließlich 12,5 μl 2x PCR-Mastermix, 0,5 μl Vorwärts- und Rückwärtsprimer (10 μM) (siehe Tabelle 1 für die Primerliste), 1 μl 10 ng/μl eDNA und 10,5 μl nukleasefreies Wasser.
    HINWEIS: Bereiten Sie den Mastermix mit genügend Volumen für eine zusätzliche Probe vor, um Pipettierfehler zu minimieren.
  4. Die cPCR-Reaktion nach dem Protokoll besteht aus einer anfänglichen Denaturierung bei 95 °C für 2 Minuten, gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 45 s, einer Verlängerung bei 72 °C für 30 s und einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 5 m, mit unterschiedlicher Glühtemperatur für verschiedene Primer (siehe Tabelle 1 für die Glühtemperaturen verschiedener Primer, die für verschiedene Gene verwendet wurden).
    HINWEIS: Für das mcrA-Gen zeigten ML-Primer die gewünschte Bande mit einer langsamen Rampenrate von 0,1 °C/s zwischen den Annealing- und Extensionsschritten für die ersten fünf Zyklen32.
  5. Visualisieren Sie cPCR-Produkte in einem Agarosegel, das mit Ethidiumbromid (EtBr) vorgefärbt ist.
    HINWEIS: Verwenden Sie 2,5 % Agarosegel für eine 50 bp Leiter und 0,9 % Gel für eine 1 kb Leiter. Verwenden Sie 1x TAE-Puffer für ein 2,5%iges Agarose-Gel und 0,5x TAE-Puffer für ein 0,9%iges Agarose-Gel.

5. Nachweis von pmoA1 , pmoA2 , mmoX und mcrA durch quantitative real-time PCR

HINWEIS: Die Häufigkeit von Methanogen- und Methanotroph-Zielgenen wie pmoA1, pmoA2, mmoX und mcrA wurde mittels qPCR unter Verwendung eines real-Time-PCR-Systems beobachtet.

  1. Bereiten Sie die Standards für jedes Gen separat vor, um die Standardkurve für jedes Gen zu erhalten.
    1. Amplifizieren Sie das Zielgen mit cPCR, indem Sie die Proben verwenden, die während der Gelelektrophorese jedes Gens die hellste Bande erzeugt haben. Befolgen Sie die Methode und die Primer, die in Abschnitt 4 beschrieben sind.
    2. Die amplifizierten Produkte werden mit einem Gelextraktionskit gereinigt und die DNA-Konzentration nach der in Abschnitt 3 beschriebenen Methode gemessen und bei -20 °C gelagert.
      HINWEIS: Aliquotieren Sie die gereinigten Standards zur weiteren Verwendung in separate Röhrchen.
    3. Berechnen Sie Genkopien aus der gemessenen DNA-Konzentration unter Verwendung der Website zur Berechnung der Kopienzahl für die qPCR.
    4. Verdünnen Sie die berechnete Kopienzahl des Standards mit nukleasefreiem Wasser, um jeden Standard herzustellen, und zwar im Bereich von 108 bis 102 Kopien/μl, bevor Sie die qPCR durchführen.
    5. Bereiten Sie die Standardkurve mit drei Replikaten jeder Kopienzahl vor, einschließlich einer Negativkontrolle (NTC, keine Template-DNA).
      HINWEIS: DerR2-Wert jeder Normkurve war größer als 0,99.
  2. Bereiten Sie ein 20-μl-qPCR-Reaktionsgemisch für alle Proben, Standards und NTC vor. Führen Sie die qPCR-Analyse in dreifacher Ausfertigung für alle Proben durch.
    1. Legen Sie alle Reaktionskomponenten, einschließlich qPCR-Mastermix, Primer, nukleasefreies Wasser, Standards und Proben, auf ein Eisgitter, bevor Sie beginnen.
    2. Bereiten Sie für jede Probe, jeden Standard und jeden NTC ein 20-μl-qPCR-Reaktionsgemisch vor, das 10 μl SYBR Green Mastermix, 0,5 μl von jedem 10 μM Forward- und Reverse-Primer, 8 μl nukleasefreies Wasser und 1 μl entweder 10 ng/μl Template-DNA oder Standard- bzw. DI-Wasser enthält.
      HINWEIS: Verwenden Sie die gezeigten Primer-Sets, um optimale Ergebnisse für pmoA1 - und mcrA-Gene in der konventionellen PCR für qPCR zu erzielen (siehe Tabelle 1). Um die Genauigkeit zu verbessern, führen Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung aus. Die folgenden Schritte bieten eine effiziente Methode zur Herstellung von dreifachen Proben mit einem kombinierten Volumen von 60 μl pro Probe.
      1. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch vor, um den Mastermix, die Vorwärts- und Rückwärtsprimer für das spezifische Gen und nukleasefreies Wasser in einem 2-ml-Röhrchen mit Ausnahme der Matrizen-DNA zu kombinieren.
        HINWEIS: Bereiten Sie das Volumen der Reaktionsmischung unter Berücksichtigung eines Pipettierfehlers vor. Wenn z. B. 24 Proben und 8 Standards vorhanden sind, berechnen Sie das Gesamtvolumen für 33 Reaktionen anstelle von 32 Reaktionen, um Pipettierfehler zu minimieren. In diesem Fall wäre das für dreifache Reaktionen erforderliche Gesamtvolumen wie folgt: 990 μl Mastermix (33 Proben x 3 Replikate x 10 μl), 49,5 μl Forward-Primer (33 Proben x 3 Replikate x 0,5 μl), 49,5 μl Reverse-Primer (33 Proben x 3 Replikate x 0,5 μl) und 792 μl nukleasefreies Wasser (33 Proben x 3 Replikate x 8 μl).
      2. Bereiten Sie PCR-Röhrchen entsprechend der Anzahl der Proben und Standards vor.
      3. Geben Sie 57 μl des vorbereiteten Reaktionsgemisches in jedes PCR-Röhrchen.
        HINWEIS: Um die qPCR für jede Probe in dreifacher Ausfertigung durchzuführen, bereiten Sie ein Gesamtvolumen des Reaktionsgemisches von 57 μl pro Probe vor (ohne Template-DNA, Standard oder Wasser). Dieses Volumen wird zu gleichen Teilen in drei Vertiefungen für eine Probe aufgeteilt, wobei jeder Vertiefung 19 μl zugewiesen werden.
      4. Geben Sie 3 μl Matrizen-DNA, Standard- oder nukleasefreies Wasser in jedes Röhrchen und mischen Sie, indem Sie vorsichtig auf den Boden des Röhrchens klopfen.
        HINWEIS: Das Gesamtvolumen des für eine Probe vorbereiteten Reaktionsgemisches würde jetzt 60 μl in jedem Röhrchen betragen.
    3. Aliquotieren Sie 20 μl des vorbereiteten Reaktionsgemisches aus jedem Röhrchen in die dafür vorgesehenen Vertiefungen einer 96-Well-qPCR-Platte. Verschließen Sie die PCR-Platte mit einem Applikator mit einer selbstklebenden PCR-Siegelfolie.
    4. Zentrifugieren Sie die versiegelte Platte 1 Minute lang bei 1.000 × g , um eine ordnungsgemäße Durchmischung zu gewährleisten und Blasen in den Vertiefungen zu entfernen.
  3. Setzen Sie die PCR-Platte in den Thermocycler ein. Schalten Sie das qPCR-Gerät ein und öffnen Sie dann die zugehörige Software, um das Protokoll einzurichten.
    1. Richten Sie das Protokoll gemäß den qPCR-Mastermix-Richtlinien ein. Verwenden Sie das folgende Protokoll: 95 °C für 10 Minuten, gefolgt von 95 °C für 15 s und eine Verlängerungsstufe bei 72 °C für 30 s. Der Glühschritt wird bei der für die entsprechenden Primer in Tabelle 1 angegebenen Glühtemperatur 45 s lang durchgeführt. Führen Sie alle qPCR-Läufe über 35 Zyklen durch.
    2. Richten Sie die 96-Well-qPCR-Platte mit Standards und NTCs in der gleichen Konfiguration wie die probenhaltige Platte ein.
  4. Es wird die Standardkurvenmethode der absoluten Quantifizierung verwendet, um das amplifizierte Produkt und die Genkopienzahl in jeder Probe zu quantifizieren33.

6. Visualisierung von Genen des Methankreislaufs in der Karte der Feuchtgebiete an der Küste von Südtexas

  1. Öffnen Sie die GIS-Software (GIS) ArcGIS Pro , und speichern Sie die Projektdatei mit dem Namen Untersuchungsgebiet im angegebenen Ordner auf dem Computer.
  2. Klicken Sie oben links auf Karte | Grundkarte, und wählen Sie Terrain mit Beschriftungen als Grundkarte aus.
  3. Klicken Sie auf Suchen | Suchen Sie und wenn sich die Suchleiste öffnet, suchen Sie das Untersuchungsgebiet, indem Sie den Namen des Gebiets eingeben. Der Bereich wird angezeigt.
  4. Zeichnen Sie den spezifischen Bereich mithilfe der Georeferenzierung.
    1. Klicken Sie auf Ansicht | Katalogbereich aus der obersten Ebene.
    2. Doppelklicken Sie auf Ordner aus dem Katalog | Dateiname.
    3. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Geodatabase-Datei (.gdb), und klicken Sie dann auf Neu | Feature-Class und Feature-Class erstellen werden angezeigt.
    4. Geben Sie das Feld Name und Alias ein und klicken Sie unten auf Fertig stellen .
    5. Klicken Sie auf Ansicht | Inhalt. Der Aliasname wird im Inhaltsbereich angezeigt.
    6. Klicken Sie in der obersten Ebene auf Bearbeiten | Kreieren. Der Bereich Features erstellen wird geöffnet. Doppelklicken Sie im Bereich Features erstellen auf den Alias, und die Feedback-Optionen für das Werkzeug konfigurieren werden angezeigt.
    7. Wählen Sie Linien aus, und skizzieren Sie dann Linien auf der Karte, um eine äußere Begrenzung des Untersuchungsgebiets zu erstellen. Doppelklicken Sie auf die Karte, wenn Sie fertig sind.
  5. Minimieren Sie die GIS-Software, und öffnen Sie dann eine Tabelle. Geben Sie den Namen des Beispiels in die erste Spalte ein, geben Sie den Breitengrad in der zweiten Spalte und den Längengrad in der dritten Spalte ein. Verwenden Sie die nächsten vier Spalten für die qPCR-Daten von pmoA1, pmoA2, mmoX und mcrA.
  6. Speichern Sie die Datei im CSV-Format in einem bestimmten Ordner des Computers.
  7. Öffnen Sie die GIS-Software erneut, und klicken Sie auf Daten hinzufügen | XY-Punkt-Daten.
  8. Wählen Sie die CSV-Datei aus dem Ordner auf dem Computer im Feld Eingabetabelle aus. Benennen Sie den Dateinamen in der Ausgabe-Feature-Class um, und klicken Sie dann auf Ausführen , um die Probenahmepunkte auf der Karte anzuzeigen.
  9. Klicken Sie auf dievSuchleiste oben und suchen Sie nach Kriging.
  10. Wählen Sie die Datei der Probenahmestation und dann pmoA1 aus.
  11. Klicken Sie auf die Schaltfläche Umgebung | Wählen Sie die Probenahmestation in Layer und Maske aus | Klicken Sie auf Ausführen.
  12. Befolgen Sie die in den Schritten 6.9, 6.10 und 6.11 genannten Protokolle, um Kriging für pmoA2, mmoX und mcrA für das gesamte Untersuchungsgebiet zu erstellen.
  13. Erstellen Sie ein Layout der Karte.
    1. Klicken Sie auf Aus der obersten Ebene einfügen | Neues Layout, und wählen Sie ANSI - Querformat aus.
    2. Klicken Sie auf Kartenrahmen, wählen Sie die Karte mit dem Kriging aus und platzieren Sie alle Karten im Layout, indem Sie ein Rechteck zeichnen. Dadurch wird die Karte im Layout sichtbar.
    3. Wählen Sie den Nordpfeil aus, und platzieren Sie ihn im Layout, um die Nordrichtung anzugeben.
    4. Wählen Sie Maßstabsleiste aus, um den Maßstab des Bereichs auf der Karte anzuzeigen.
    5. Klicken Sie auf Legende , um die Legenden anzuzeigen, und platzieren Sie sie dann im Layout.
    6. Klicken Sie auf Raster und wählen Sie eine der Optionen für das schwarze Raster aus. Dadurch wird das Raster mit dem Breiten- und Längengrad erstellt und im Inhaltsbereich mit der Beschriftung Schwarzes horizontales Beschriftungsraster angezeigt.
    7. Doppelklicken Sie auf Schwarzes horizontales Beschriftungsraster und wählen Sie dann Komponenten. Klicken Sie auf die Häkchen 1 und das Raster und entfernen Sie diese Komponenten, indem Sie auf das Kreuzzeichen rechts davon klicken.
  14. Klicken Sie in der obersten Ebene auf Freigeben und dann auf Layout exportieren. Wählen Sie den Dateityp als PDF aus, speichern Sie die Datei über das Namensfeld auf dem Computer, stellen Sie die vertikale Auflösung auf 500 DPI ein, und klicken Sie auf Exportieren , um die PDF-Datei der Karte zu erstellen.

Ergebnisse

Um die Verteilung und Häufigkeit von CH 4-Zyklus-bezogenen Genen (mcrA, pmoA1, pmoA2 und mmoX) in den Küstenfeuchtgebieten von Südtexas zu verstehen, wurde die extrahierte eDNA aus jeder Probe mittels cPCR und qPCR analysiert. Für die Durchführung der cPCR aus früheren Studien wurden universelle Primer für jeden Biomarker ausgewählt (Tabelle 1)22,34,35,36,37, und es wurden Modifikationen vorgenommen, um die Glühtemp...

Diskussion

Küstenfeuchtgebiete gelten als bedeutende Verursacher von atmosphärischem Methan, einem wichtigen Treibhausgas40. Obwohl es Studien über den Methanfluss und Methanogene in Feuchtgebieten gibt 41,42,43, ist wenig darüber bekannt, wie Methanotrophen in verschiedenen Umgebungen oder unter verschiedenen Bewirtschaftungspraktiken funktionieren, insbesondere in Feuchtgebieten mit schwankenden Wasserständen<...

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Wir danken den C-REAL-Mitgliedern für ihre Unterstützung bei der Feldbeobachtung und bei Laboranalysen.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL PCR tubesThermoFisher ScientificAB0620https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AB0620?SID=srch-srp-AB0620
0.5 mL PCR TubesPromegaE4941https://www.promega.com/products/biochemicals-and-labware/tips-and-accessories/0_5ml-pcr-tubes/?catNum=E4941
10 μL tipsThermoFisher Scientific05-408-187Fisherbrand SureGrip Pipet Tip Racked or Reload System Tips Natural; 10μL; | Fisher Scientific
15 mL centrifuge tubeThermoFisher Scientific14-959-53Ahttps://www.fishersci.com/shop/products/falcon-15ml-conical-centrifuge-tubes-5/p-193301
200 μL tipsThermoFisher Scientific05-408-190Fisherbrand SureGrip Pipet Tip Racked or Reload System Tips Natural; 200μL; | Fisher Scientific
1000 μL tipsThermoFisher Scientific02-707-402https://www.fishersci.com/shop/products/sureone-micropoint-pipette-tips-specific-standard-fit/02707402?gclid=Cj0KCQiAp
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Applied Biosystem Power SYBR Green Master Mix ThermoFisher Scientific4368577https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4368577
ArcGIS Pro esrihttps://www.esri.com/en-us/arcgis/products/arcgis-pro/overview?srsltid=AfmBOopatJ4
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vYkkBvfOqE-uNSsMghN1
CFX Duet Real-Time PCR system Bio-Rad12016265https://www.bio-rad.com/en-us/product/cfx-duet-real-time-pcr-system?ID=97722926-9ed9-16a4-1d83-c92f587e427a
Corning Lambda plus single channel pipettor
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