Visualizando a dinâmica microbiana do ciclo de metano em zonas úmidas costeiras

Resumo

O protocolo detecta os principais genes do ciclo de metano nas zonas úmidas costeiras do sul do Texas e visualiza sua distribuição espacial para melhorar a compreensão da regulação do metano e seus impactos ambientais nesses ecossistemas dinâmicos.

Resumo

As zonas úmidas costeiras são a maior fonte biótica de metano, onde os metanógenos convertem matéria orgânica em metano e os metanotróficos oxidam o metano, desempenhando assim um papel crítico na regulação do ciclo do metano. As zonas úmidas no sul do Texas, que estão sujeitas a eventos climáticos frequentes, níveis flutuantes de salinidade e atividades antropogênicas devido às mudanças climáticas, influenciam o ciclo do metano. Apesar da importância ecológica desses processos, o ciclo de metano nas zonas úmidas costeiras do sul do Texas permanece insuficientemente explorado. Para resolver essa lacuna, desenvolvemos e otimizamos um método para detectar genes relacionados a metanógenos e metanotróficos, incluindo mcrA como biomarcador para metanógenos e pmoA1, pmoA2 e mmoX como biomarcadores para metanotróficos. Além disso, este estudo teve como objetivo visualizar os padrões de distribuição espacial e temporal da abundância de metanogênios e metanotróficos utilizando o software de sistema de informações geográficas (GIS) ArcGIS Pro. A integração dessas técnicas moleculares com visualização geoespacial avançada forneceu insights críticos sobre a distribuição espacial e temporal de comunidades metanogênicas e metanotróficas nas zonas úmidas do sul do Texas. Assim, a metodologia estabelecida neste estudo oferece uma estrutura robusta para mapear a dinâmica microbiana em zonas úmidas, aprimorando nossa compreensão do ciclo do metano sob condições ambientais variadas e apoiando estudos mais amplos de mudanças ecológicas e ambientais.

Introdução

As zonas úmidas costeiras são ecossistemas vitais que contribuem para a regulação do clima, conservação da biodiversidade e gestão da água por meio de processos como sequestro de carbono, evapotranspiração e emissões de metano (CH₄)¹. Esses ecossistemas, incluindo pântanos de água doce e salgada², são altamente produtivos e atuam como zonas críticas para a absorção de dióxido de carbono (CO₂) e capturam matéria orgânica de ambientes terrestres e marinhos ^3,4. As interações dinâmicas dentro dessas áreas úmidas estimulam a produção e o consumo microbiano de CH₄ ⁵, posicionando-os como uma das maiores fontes naturais de CH₄⁶. Como o segundo gás de efeito estufa mais importante, o CH₄ tem um potencial de aquecimento global aproximadamente 27-30x maior que o de CO₂ ^4,7,8,9, tornando o estudo das emissões de CH₄ de zonas úmidas costeiras essencial na era das mudanças climáticas. A emissão de CH₄ é influenciada por vários fatores ambientais, particularmente a salinidade, desempenhando um papel crucial nos processos microbianos¹⁰. As zonas úmidas de água doce contribuem significativamente para o metano atmosférico devido aos seus níveis mais baixos de sulfato, o que facilita uma maior produção microbiana de CH₄, enquanto as áreas úmidas de água salgada geralmente tendem a emitir menos CH₄ devido a concentrações mais altas de sulfato 11,12,13.

As emissões de CH₄ das zonas úmidas costeiras são geralmente controladas por dois grupos de microrganismos, conhecidos como metanógenos e metanotróficos¹⁴. Os metanógenos produzem CH₄ em sedimentos anóxicos, quebrando substratos como formato, acetato, hidrogênio ou compostos metilados por meio de um processo conhecido como metanogênese¹⁵. A enzima importante nessa via é a metil-coenzima M redutase (MCR), pois catalisa a etapa final e limitante da metanogênese 15,16,17. O gene mcrA, que codifica a subunidade alfa do MCR, é um marcador funcional que pode ser encontrado em todas as arqueias metanogênicas¹⁸. Além disso, em zonas úmidas costeiras, a zona de transição sulfato-metano (SMTZ) se forma acima da zona metanogênica, onde o metano que se difunde para cima e o sulfato que se move para baixo convergem e se esgotam¹⁹. Dentro desta zona, as arqueias metanotróficas anaeróbicas (ANME) oxidam o metano em dióxido de carbono usando a enzima MCR, enquanto as bactérias redutoras de sulfato (SRB) reduzem o sulfato a sulfeto. O SRB supera os metanógenos para hidrogênio e acetato, limitando a produção de metano até que o sulfato se esgote^16,17.

Em contraste, bactérias metanotróficas aeróbias oxidam CH₄ em ambientes aeróbios²⁰, utilizando diferentes formas de metano monooxigenase (MMO). Estes incluem a monooxigenase de metano particulado (pMMO), uma enzima contendo cobre embutida na membrana intracitoplasmática, e a monooxigenase de metano solúvel (sMMO), uma enzima contendo ferro encontrada no citoplasma. No entanto, para pMMO, existem três operons gênicos pmoCAB²¹; entre eles, o gene pmoA é o mais conservador para todos os metanotróficos. Existem dois genes biomarcadores diferentes para pmoA: pmoA1 e pmoA2²². Além disso, para uma compreensão abrangente dos metanotróficos, o gene mmoX é usado como uma ferramenta em biologia molecular para identificar metanotróficos contendo sMMO²³. Essa distinção nas vias metabólicas e nos requisitos ambientais de metanógenos e metanotróficos aeróbios destaca as complexas interações microbianas que regulam o ciclo do metano em ecossistemas de zonas úmidas costeiras.

O pântano de Boca Chica (BC), um ambiente produtivo de água salgada no sul do Texas, experimenta influências de maré do Golfo do México (GOM), levando a níveis variáveis de salinidade superficial, especialmente devido à sua proximidade com a hipersalina Laguna Madre²⁴. Essa ação de maré, alternando entre marés altas e baixas, faz com que os níveis de oxigênio flutuem²⁵ , o que pode alterar a atividade metanogênica e metanotrófica nos sedimentos²⁶. Em contraste, as zonas úmidas costeiras de água doce são consideradas um hotspot significativo para fluxos de CH₄ ²⁷. As zonas úmidas costeiras de água doce no sul do Texas, incluindo Resaca Del Rancho Viejo (RV) e Lozano Banco (LB), distantes dos efeitos das marés do GOM, têm gestão hidrológica distinta. O RV experimenta fluxos de pulso suplementados pela água do rio durante os baixos níveis de água, enquanto o LB opera como um sistema de fluxo off-line sem essa suplementação. Além disso, RV e LB mantêm níveis de salinidade mais baixos devido a uma alta descarga de água doce bombeada artificialmente e por ser um lago em forma de boi, respectivamente. Os diferentes fatores ambientais podem influenciar significativamente o ciclo de metano nas zonas úmidas costeiras do sul do Texas. No entanto, o ciclo de metano nas zonas úmidas costeiras do sul do Texas continua sendo uma área que ainda precisa ser completamente investigada.

A reação em cadeia da polimerase (PCR) e a PCR em tempo real (também chamada de PCR quantitativa [qPCR]) representam técnicas fundamentais e amplamente utilizadas para detectar e quantificar a abundância relativa de genes específicos em amostras ambientais. Essas técnicas amplificam especificamente regiões-alvo do DNA para indicar a presença e a quantidade relativa de genes relacionados ao ciclo de CH₄, fornecendo indicadores de potencial ciclo de metano. No entanto, a disponibilidade e eficácia dos conjuntos de primers de PCR podem ser limitadas por vários fatores inibitórios no DNA ambiental extraído, sendo impactados pelos tipos de ambientes^28,29. Assim, este estudo estabeleceu principalmente um método de PCR ideal para detectar a presença de genes relacionados ao ciclismo CH₄ em zonas úmidas costeiras do sul do Texas (Figura 1) e, em seguida, visualizou sua abundância relativa quantificada nesses ecossistemas. Os resultados deste estudo podem ser aplicados a outras regiões costeiras para melhorar a compreensão do ciclo de CH₄ e da dinâmica microbiana em diversos ecossistemas costeiros.

Protocolo

1. Coleta de amostras

1. Colete amostras de sedimentos usando um amostrador de sedimentos ou pá.
   NOTA: As amostras foram coletadas de duas estações de três zonas úmidas costeiras distintas durante as estações fria (outubro-fevereiro, a temperatura média é de 20 ° C) e quente (abril a junho, temperatura média é de 27 ° C) de 2023 e 2024. Um amostrador de sedimentos foi usado quando as amostras foram coletadas de pântanos costeiros de água doce (Figura 2) e uma pá foi usada para pântanos costeiros de água salgada influenciados pelas marés.
2. Abaixe o amostrador primeiro no corpo d'água raso e deixe-o afundar na superfície do sedimento (dentro dos 50 cm superiores) sob seu próprio peso, minimizando a perturbação da estrutura do sedimento, conforme mostrado na Figura 2.
3. Retire-o da coluna de água onde a profundidade era normalmente de 60 cm a 215 cm³⁰, transfira as amostras de sedimentos para sacos zip-lock e guarde-as em uma caixa de gelo imediatamente.
   NOTA: Limpe e lave o amostrador com água deionizada (DI) antes de prosseguir para as próximas estações.
4. Armazenar todas as amostras a -20 °C imediatamente no laboratório.
5. Em cada local de amostragem, medir os parâmetros de qualidade da água superficial, como salinidade e temperatura, in situ , usando um medidor multiparâmetro da qualidade da água.
   NOTA: As sondas foram enxaguadas com água deionizada (água DI) após o uso em cada estação.

2. Extração de DNA genômico

1. Descongele as amostras à temperatura ambiente antes de iniciar o procedimento de extração de DNA genômico.
2. Transfira aproximadamente 500 mg de amostras de sedimentos para um tubo de 15 mL e centrifugue a 4.250 × g por 3 min para remover toda a água.
3. Extrair o ADN genómico utilizando um kit de extracção de ADN para o solo, de acordo com o protocolo³¹ do fabricante, com uma pequena modificação, e conservar imediatamente a -20 °C.
   NOTA: As alterações foram feitas para reduzir a redundância e o fluxo de trabalho eficiente.
   1. Adicione até 500 mg de amostra de solo a um tubo contendo esferas de vidro/esfera de cerâmica.
   2. Adicione 978 μL de tampão fosfato de sódio à amostra no tubo contendo esfera/esfera.
   3. Adicione 122 μL de solução de lise tampão à amostra no tubo contendo esfera/esfera para solubilizar contaminantes externos.
   4. Homogeneizar usando um homogeneizador de moinho de esferas a 5x o nível de velocidade por 20 s e repetir 2x.
      NOTA: Um homogeneizador de moinho de esferas foi usado neste estudo, razão pela qual a velocidade foi ajustada.
   5. Centrifugue a mistura por 10 min a 14.000 × g.
   6. Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo de 2,0 mL.
   7. Adicione 250 μL de solução de precipitação de proteínas (PPS) para separar os ácidos nucléicos solubilizados dos detritos celulares e da matriz de lisagem. Misture invertendo o tubo 10x.
   8. Centrifugue a 14.000 × g por 5 min para precipitar o pellet, removendo os detritos celulares e a matriz de lisagem.
   9. Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo de 15 ml.
   10. Adicione 1,0 mL da suspensão Binding Matrix ao sobrenadante no tubo de 15 mL.
       NOTA: Agite a suspensão da Matriz de Encadernação para ressuspender antes de adicioná-la.
   11. Permita a ligação do DNA à matriz de ligação colocando os tubos em um rotador por 2 min.
   12. Coloque todos os tubos em um rack e incube por 3 min para permitir o assentamento da Matriz de Encadernação.
   13. Após 3 min, descarte 750 μL e misture suavemente o sobrenadante restante com o pellet usando uma pipeta.
   14. Transfira 750 μL da mistura para um filtro SPIN e centrifugue a 14.000 × g por 1 min. Esvazie o tubo de recolha e volte a utilizá-lo. Repita com a mistura restante.
   15. Adicione 500 μL da solução de lavagem preparada (com a quantidade apropriada de etanol adicionada) para solubilizar ainda mais as impurezas. Ressuspenda suavemente o pellet usando a força do líquido da ponta da pipeta.
   16. Centrifugue a 14.000 × g por 1 min para remover as impurezas. Esvazie o tubo de recolha e volte a utilizá-lo.
   17. Centrifugue novamente a 14.000 × g por 2 min sem adicionar nada.
   18. Substitua o tubo coletor por um tubo coletor novo e limpo e seque o filtro SPIN por 5 minutos em temperatura ambiente.
   19. Adicione 50 μL de água livre de DNAse (DES) e centrifugue a 14.000 × g por 1 min.
       NOTA: Neste protocolo, 50 μL de DES foram usados para eluição de DNA para garantir a recuperação e estabilidade ideais do DNA ambiental extraído (eDNA).

3. Quantificação de DNA

1. Adicione 1 μL de DNA extraído com 200 μL de corante fluorescente em um tubo de 0,5 mL e misture bem por pipetagem.
2. Enrole o tubo imediatamente com papel alumínio para que a luz não penetre e incube em temperatura ambiente por 5 min.
3. Meça a concentração de DNA usando um fluorômetro no modo de concentração de DNA ONE seguindo o protocolo do fabricante.

4. Detecção de 16S rRNA, pmoA1 , pmoA2 , mmoX e mcrA por PCR convencional

1. Antes de executar a PCR convencional (cPCR), descongele todas as amostras e reagentes em um balde de gelo.
2. Dilua todas as amostras de eDNA extraídas para 10 ng/μL.
   NOTA: Uma lista de primers é fornecida na Tabela 1.
3. Prepare uma mistura de reação de cPCR de 25 μL para cada amostra, incluindo 12,5 μL de mistura 2x PCR Master, 0,5 μL de primers diretos e reversos (10 μM) (consulte a Tabela 1 para obter a lista de primers), 1 μL de 10 ng/μL de eDNA e 10,5 μL de água livre de nuclease.
   NOTA: Prepare a mistura principal com volume suficiente para uma amostra extra para minimizar os erros de pipetagem.
4. Realize a reação de cPCR seguindo o protocolo que consiste em uma desnaturação inicial a 95 ° C por 2 min, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C por 45 s, extensão a 72 ° C por 30 s e extensão final a 72 ° C por 5 m, com temperatura de recozimento variável para diferentes primers (consulte a Tabela 1 para temperaturas de recozimento de diferentes primers usados para diferentes genes).
   NOTA: Para o gene mcrA , os primers ML mostraram a banda desejada usando uma taxa de rampa lenta de 0,1 ° C / s entre as etapas de recozimento e extensão para os primeiros cinco ciclos³².
5. Visualize os produtos de cPCR em um gel de agarose pré-fabricado com brometo de etídio (EtBr).
   NOTA: Use gel de agarose a 2.5% para uma escada de 50 pb e gel a 0.9% para uma escada de 1 kb. Use 1x tampão TAE para um gel de agarose a 2,5% e tampão TAE 0,5x para um gel de agarose a 0,9%.

5. Detecção de pmoA1, pmoA2, mmoX e mcrA por PCR quantitativo em tempo real

NOTA: A abundância de genes direcionados a metanogênios e metanotróficos, como pmoA1, pmoA2, mmoX e mcrA , foi observada por qPCR usando um sistema de PCR em tempo real.

1. Prepare os padrões para cada gene separadamente para obter a curva padrão para cada gene.
   1. Amplificar o gene alvo com cPCR, usando as amostras que produziram a banda mais brilhante durante a eletroforese em gel de cada gene. Siga o método e os primers descritos na seção 4.
   2. Purificar os produtos amplificados com um kit de extracção em gel e medir a concentração de ADN seguindo o método descrito na secção 3 e conservar a -20 °C.
      NOTA: Aliquota os padrões purificados em tubos separados para uso posterior.
   3. Calcule as cópias de genes da concentração de DNA medida usando o site de cálculo do número de cópias para qPCR.
   4. Dilua o número de cópias calculado do padrão com água livre de nuclease para preparar cada padrão, variando de 10⁸ a 10² cópias/μL, antes de executar o qPCR.
   5. Preparar a curva-padrão utilizando três réplicas de cada número de cópias, incluindo um controlo negativo (NTC, sem ADN molde).
      NOTA: O valor de R² de cada curva padrão foi maior que 0,99.
2. Prepare uma mistura de reação qPCR de 20 μL para todas as amostras, padrões e NTC. Realize a análise de qPCR em triplicados para todas as amostras.
   1. Coloque todos os componentes da reação, incluindo mistura principal de qPCR, primers, água livre de nuclease, padrões e amostras, em uma prateleira de gelo antes de começar.
   2. Prepare uma mistura de reação qPCR de 20 μL para cada amostra, padrão e NTC, contendo 10 μL de master mix SYBR Green, 0,5 μL de cada primer direto e reverso de 10 μM, 8 μL de água livre de nuclease e 1 μL de DNA molde de 10 ng/μL, ou água padrão ou DI, respectivamente.
      NOTA: Use os conjuntos de primers mostrados para produzir resultados ideais para os genes pmoA1 e mcrA em PCR convencional para qPCR (consulte a Tabela 1). Para melhorar a precisão, execute cada amostra em triplicado. As etapas a seguir fornecem um método eficiente para preparar amostras triplicadas com um volume combinado de 60 μL por amostra.
      1. Prepare a mistura de reação para combinar a mistura principal, primers direto e reverso para o gene específico e água livre de nuclease em um tubo de 2 mL, exceto o DNA molde.
         NOTA: Prepare o volume da mistura de reação considerando o erro de pipetagem. Por exemplo, se houver 24 amostras e 8 padrões, calcule o volume total de 33 reações em vez de 32 reações para minimizar erros de pipetagem. Neste caso, o volume total necessário para as reações triplicadas seria o seguinte: 990 μL de master mix (33 amostras x 3 repetições x 10 μL), 49,5 μL de primers diretos (33 amostras x 3 repetições x 0,5 μL), 49,5 μL de primers reversos (33 amostras x 3 repetições x 0,5 μL) e 792 μL de água livre de nuclease (33 amostras x 3 repetições x 8 μL).
      2. Prepare os tubos de PCR de acordo com o número de amostras e padrões.
      3. Dispense 57 μL da mistura de reação preparada em cada tubo de PCR.
         NOTA: Para realizar qPCR para cada amostra em triplicata, prepare um volume total de mistura de reação de 57 μL por amostra (excluindo DNA modelo, padrão ou água). Este volume será dividido igualmente em três poços para uma amostra, com 19 μL alocados para cada poço.
      4. Adicione 3 μL de DNA molde, água padrão ou livre de nuclease a cada tubo e misture batendo suavemente no fundo do tubo.
         NOTA: O volume total da mistura de reação preparada para uma amostra seria de 60 μL agora em cada tubo.
   3. Alíquota de 20 μL da mistura de reação preparada de cada tubo para os poços designados de uma placa de qPCR de 96 poços. Sele a placa PCR com filme de vedação PCR adesivo usando um aplicador.
   4. Centrifugue a placa selada a 1.000 × g por 1 min para garantir a mistura adequada para eliminar quaisquer bolhas dentro dos poços.
3. Coloque a placa PCR no termociclador. Ligue a máquina qPCR e abra o software relacionado para configurar o protocolo.
   1. Configure o protocolo de acordo com as diretrizes de mistura principal de qPCR. Use o seguinte protocolo: 95 °C por 10 min, seguido por 95 °C por 15 s e uma etapa de extensão a 72 °C por 30 s. Execute a etapa de recozimento na temperatura de recozimento especificada para os primers relevantes na Tabela 1 por 45 s. Realize todas as execuções de qPCR por 35 ciclos.
   2. Configure a placa qPCR de 96 poços com padrões e NTCs na mesma configuração da placa contendo amostras.
4. Utilizar o método da curva padrão de quantificação absoluta para quantificar o produto amplificado e o número de cópias do gene em cada amostra³³.

6. Visualizando genes do ciclo de metano no mapa das zonas úmidas costeiras do sul do Texas

1. Abra o software de sistema de informações geográficas (GIS) ArcGIS Pro e salve o arquivo de projeto com o nome Área de Estudo na pasta especificada no computador.
2. Clique em Mapa no canto superior esquerdo | Mapa base e selecione Terreno com Rótulos como o mapa base.
3. Clique em Localizar | Pesquise e quando a barra de pesquisa abrir, localize a área de estudo digitando o nome da área; a área aparecerá.
4. Desenhe a área específica usando georreferenciamento.
   1. Clique em Exibir | Painel de catálogo da camada superior.
   2. Clique duas vezes em Pasta do catálogo | Nome do arquivo.
   3. Clique com o botão direito do mouse no arquivo geodatabase (.gdb) e clique em Novo | Classe de Feição e Criar Classe de Feição aparecerão.
   4. Digite a caixa Nome e alias e clique em Concluir na parte inferior.
   5. Clique em Exibir | Conteúdo. O nome do alias aparecerá no painel de conteúdo.
   6. Clique em Editar na camada superior | Criar. O painel Criar Feições será aberto. Clique duas vezes no Alias no painel Criar Recursos e a opção Configurar Opções de Feedback da Ferramenta será exibida.
   7. Selecione Linhas e, em seguida, desenhe linhas no mapa para criar um limite externo da área de estudo. Clique duas vezes no mapa quando terminar.
5. Minimize o software GIS e abra uma planilha. Digite o nome da amostra na primeira coluna, insira a latitude na segunda coluna e a longitude na terceira coluna. Use as próximas quatro colunas para os dados qPCR de pmoA1, pmoA2, mmoX e mcrA.
6. Salve o arquivo no formato CSV em qualquer pasta específica do computador.
7. Abra o software GIS novamente e clique em Adicionar dados | Dados de ponto XY.
8. Selecione o arquivo CSV da pasta no computador na caixa Tabela de Entrada . Renomeie o nome do arquivo na Classe de Feição de Saída e clique em Executar para exibir os pontos de amostragem no mapa.
9. Clique novbarra de pesquisa na parte superior e pesquise Krigagem.
10. Selecione o arquivo da estação de amostragem e, em seguida, selecione pmoA1.
11. Clique no menu Ambiente | selecione a estação de amostragem em camada e máscara | clique em Executar.
12. Siga os protocolos mencionados nas etapas 6.9, 6.10 e 6.11 para criar Krigagem para pmoA2, mmoX e mcrA para toda a área de estudo.
13. Crie um layout do mapa.
    1. Clique em Inserir na camada superior | Novo layout e selecione ANSI - Paisagem.
    2. Clique em Map Frame, selecione o mapa com a Krigagem e coloque todos os mapas no layout desenhando um retângulo. Isso tornará o mapa visível no layout.
    3. Selecione a seta norte e coloque-a no layout para indicar a direção norte.
    4. Selecione Barra de escala para exibir a escala da área no mapa.
    5. Clique em Legenda para exibir as legendas e coloque-a no layout.
    6. Clique em Grade e selecione qualquer uma das opções de retícula preta. Isso criará a grade com latitude e longitude e a exibirá no Painel de Conteúdo com o rótulo Retícula de rótulo horizontal preto.
    7. Clique duas vezes em Retícula de etiqueta horizontal preta e selecione Componentes. Clique em Ticks 1 e Grid e remova esses componentes clicando no sinal de cruz à direita.
14. Clique em Compartilhar na camada superior e, em seguida, clique em Exportar layout. Selecione o tipo de arquivo como PDF, salve o arquivo no computador utilizando a Caixa de Nome, defina a resolução vertical para 500 DPI e clique em Exportar para criar o arquivo PDF do mapa.

Resultados

Para entender a distribuição e abundância de genes relacionados ao ciclismo CH₄ (mcrA, pmoA1, pmoA2 e mmoX) nas zonas úmidas costeiras do sul do Texas, o eDNA extraído de cada amostra foi analisado por cPCR e qPCR. Primers universais para cada biomarcador foram selecionados para executar cPCR de estudos anteriores (Tabela 1) ^{22 , 34 ,}

Discussão

As zonas úmidas costeiras são reconhecidas como contribuintes significativos para o metano atmosférico, um importante gás de efeito estufa⁴⁰. Embora existam estudos sobre fluxo de metano e metanógenos em áreas úmidas^{41 , 42 , 43} , pouco se sabe sobre como os metanotróficos operam em diferentes ambientes ou sob várias práticas de manejo, especialmente em áreas ?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tubes	ThermoFisher Scientific	AB0620	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AB0620?SID=srch-srp-AB0620
0.5 mL PCR Tubes	Promega	E4941	https://www.promega.com/products/biochemicals-and-labware/tips-and-accessories/0_5ml-pcr-tubes/?catNum=E4941
10 μL tips	ThermoFisher Scientific	05-408-187	Fisherbrand SureGrip Pipet Tip Racked or Reload System Tips Natural; 10μL; | Fisher Scientific
15 mL centrifuge tube	ThermoFisher Scientific	14-959-53A	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-15ml-conical-centrifuge-tubes-5/p-193301
200 μL tips	ThermoFisher Scientific	05-408-190	Fisherbrand SureGrip Pipet Tip Racked or Reload System Tips Natural; 200μL; | Fisher Scientific
1000 μL tips	ThermoFisher Scientific	02-707-402	https://www.fishersci.com/shop/products/sureone-micropoint-pipette-tips-specific-standard-fit/02707402?gclid=Cj0KCQiAp NW6BhD5ARIsACmEb kUsQ9Lu0YIq5i4vWege 17qPdtxIYZyvmJH1cDo ARuwereO1V4GLz9UaA lDREALw_wcB&ef_id=C j0KCQiApNW6BhD5ARI sACmEbkUsQ9Lu0YIq5i 4vWege17qPdtxIYZyvmJ H1cDoARuwereO1V4GLz 9UaAlDREALw_wcB:G:s &ppc_id=PLA_goog_2175 7693617_171052169911_02 707402__715434303113_1555 377385658230343&ev_chn=sh op&s_kwcid=AL!4428!3!71543430 3113!!!g!2366517300713!&gad_source=1
Applied Biosystem Power SYBR Green Master Mix	ThermoFisher Scientific	4368577	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4368577
ArcGIS Pro	esri		https://www.esri.com/en-us/arcgis/products/arcgis-pro/overview?srsltid=AfmBOopatJ4 JvHJfscHRcAaDx0Jz5_Jrl8l5 vYkkBvfOqE-uNSsMghN1
CFX Duet Real-Time PCR system	Bio-Rad	12016265	https://www.bio-rad.com/en-us/product/cfx-duet-real-time-pcr-system?ID=97722926-9ed9-16a4-1d83-c92f587e427a
Corning Lambda plus single channel pipettor volume 0.5-10 μL	Sigma-Aldrich	CLS4071-1EA	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cls4071
Corning Lambda plus single channel pipettor volume 100-1000 μL	Sigma-Aldrich	CLS4075-1EA	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cls4075
Corning Lambda plus single channel pipettor volume 20-200 μL	Sigma-Aldrich	CLS4074-1EA	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cls4074
FastDNA spin kit for soil	MP Biomedical	116560200-CF	https://www.mpbio.com/us/116560000-fastdna-spin-kit-for-soil-samp-cf?srsltid=AfmBOoqOxxGilzY3IHNIZR ajegGTr9MoX1oMZUh 3dcbJqe0UvvukY128
Gene copy  calculator	Science Primer		https://scienceprimer.com/copy-number-calculator-for-realtime-pcr .
High speed benchtop centrifuge	ThermoFisher Scientific	75004241	https://newlifescientific.com/products/thermo-scientific-sorvall-st16-high-speed-benchtop-centrifuge-75004241?gad_source=1&gclid=Cj0KCQiApN W6BhD5ARIsACmEbkVC_-cCIN9j 20TvYq8iDsBlUR5cPK_1_wN OBEcjMdv-CYVoGCfeOLYaAv enEALw_wcB
High speed microcentrifuge	VWR	75838-336	https://us.vwr.com/store/product/20546590/null
Lysing Matrix E tube			glass bead/ceramic sphere-containing tube
Microcentrifuge tube	ThermoFisher Scientific	02-681-320	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/02681320?gclid=Cj0KCQiAp NW6BhD5ARIsACm EbkWbG4_o3oUiGk HJPU-_31-CuexDwQ fmWPnfyhBOf2BHXsy K3fFW1toaAgJbEALw_ wcB&ef_id=Cj0KCQiAp NW6BhD5ARIsACmEb kWbG4_o3oUiGkHJPU- _31-CuexDwQfmWPnfy hBOf2BHXsyK3fFW1toa AgJbEALw_wcB:G:s&ppc _id=PLA_goog_21757693 617_171052169911_0268 1320__715434303113_10 349826094968484711&ev _chn=shop&s_kwcid=AL!4 428!3!715434303113!!!g!23 66517300713!&gad_source=1
PCR Master mix	Promega	M7502	https://www.promega.com/products/pcr/taq-polymerase/master-mix-pcr/?catNum=M7502
Quantiflour ONE dsDNA system	Promega	E4871	https://www.promega.com/products/rna-analysis/dna-and-rna-quantitation/quantifluor-one-dsdna-system/?gad_source=1&gbraid=0AAAAAD _rg189yJTY3cxeVqMdu8RPx10 Ma&gclid=CjwKCAjwxNW2BhAk EiwA24Cm9FUgViPNyWq7UfZL VeeoroLAZ5JIP6w07RGK_4D0w oZgAqf-G1XTmxoCxm8QAvD_B wE&catNum=E4871
Quantus Fluorometer	Promega	E6150	https://www.promega.com/products/microplate-readers-fluorometers-luminometers/fluorometers/quantus-fluorometer/?catNum=E6150
YSI Pro 2030	YSI a xylem brand	603174	https://www.ysi.com/product/id-p2030/pro2030-kits