JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Protokol, Güney Teksas kıyı sulak alanlarındaki temel metan döngüsü genlerini tespit eder ve bu dinamik ekosistemlerdeki metan düzenlemesi ve çevresel etkilerinin anlaşılmasını geliştirmek için mekansal dağılımlarını görselleştirir.

Özet

Kıyı sulak alanları, metanojenlerin organik maddeyi metana dönüştürdüğü ve metanotrofların metanı oksitlediği ve böylece metan döngüsünün düzenlenmesinde kritik bir rol oynadığı en büyük biyotik metan kaynağıdır. İklim değişikliği nedeniyle sık sık hava olaylarına, dalgalanan tuzluluk seviyelerine ve antropojenik faaliyetlere maruz kalan Güney Teksas'taki sulak alanlar metan döngüsünü etkiler. Bu süreçlerin ekolojik önemine rağmen, Güney Teksas kıyı sulak alanlarında metan döngüsü yeterince araştırılmamıştır. Bu boşluğu gidermek için, metanojenler ve metanotröflerle ilgili genleri tespit etmek için, metanojenler için bir biyobelirteç olarak mcrA ve metanotroflar için biyobelirteçler olarak pmoA1, pmoA2 ve mmoX dahil olmak üzere bir yöntem geliştirdik ve optimize ettik. Ek olarak, bu çalışma, coğrafi bilgi sistemi (CBS) yazılımı ArcGIS Pro kullanılarak metanojen ve metanotrof bolluğunun mekansal ve zamansal dağılım modellerini görselleştirmeyi amaçlamıştır. Bu moleküler tekniklerin gelişmiş jeo-uzamsal görselleştirme ile entegrasyonu, Güney Teksas sulak alanlarındaki metanojen ve metanotrof topluluklarının mekansal ve zamansal dağılımı hakkında kritik bilgiler sağladı. Bu nedenle, bu çalışmada oluşturulan metodoloji, sulak alanlardaki mikrobiyal dinamikleri haritalamak, değişen çevresel koşullar altında metan döngüsü anlayışımızı geliştirmek ve daha geniş ekolojik ve çevresel değişim çalışmalarını desteklemek için sağlam bir çerçeve sunmaktadır.

Giriş

Kıyı sulak alanları, karbon tutma, evapotranspirasyon ve metan (CH4) emisyonları gibi süreçler yoluyla iklim düzenlemesine, biyolojik çeşitliliğin korunmasına ve su yönetimine katkıda bulunan hayati ekosistemlerdir1. Hem tatlı su hem de tuzlu su sulak alanları2 dahil olmak üzere bu ekosistemler oldukça üretkendir ve karbondioksit (CO2) alımı için kritik bölgeler olarak hareket eder ve karasal ve deniz ortamlarından organik maddeleri yakalar 3,4. Bu sulak alanlardaki dinamik etkileşimler, mikrobiyal CH4 üretimini ve tüketimini5 teşvik eder ve onları CH46'nın en büyük doğal kaynaklarından biri olarak konumlandırır. İkinci en önemli sera gazı olan CH4, CO 2 4,7,8,9'dan yaklaşık 27-30 kat daha büyük bir küresel ısınma potansiyeline sahiptir ve bu da kıyı sulak alanlarından kaynaklanan CH4 emisyonlarının incelenmesini iklim değişikliği çağında gerekli kılmaktadır. CH4 emisyonu, mikrobiyal süreçlerde çok önemli bir rol oynayan tuzluluk başta olmak üzere çeşitli çevresel faktörlerden etkilenir10. Tatlı su sulak alanları, daha fazla mikrobiyal CH4 üretimini kolaylaştıran düşük sülfat seviyeleri nedeniyle atmosferik metana önemli ölçüde katkıda bulunurken, tuzlu su sulak alanları genellikle daha yüksek sülfat konsantrasyonları nedeniyle daha az CH4 yayma eğilimindedir 11,12,13.

Kıyı sulak alanlarından kaynaklananCH4 emisyonları genellikle metanojenler ve metanotroflar olarak bilinen iki mikroorganizma grubu tarafından kontrol edilir14. Metanojenler, metanogenez15 olarak bilinen bir işlemle format, asetat, hidrojen veya metillenmiş bileşikler gibi substratları parçalayarak anoksik çökeltilerdeCH4 üretir. Bu yoldaki önemli enzim, metanojenez15,16,17'nin son ve hız sınırlayıcı adımını katalize ettiği için metil-koenzim M redüktazdır (MCR). MCR'nin alfa alt birimini kodlayan mcrA geni, tüm metanojenik arkelerde18 bulunabilen fonksiyonel bir belirteçtir. Ayrıca, kıyı sulak alanlarında, sülfat-metan geçiş bölgesi (SMTZ), metanın yukarı doğru yayılması ve aşağı doğru hareket eden sülfatın birleştiği ve tükendiği metanojenik bölgenin üzerinde oluşur19. Bu bölge içinde, anaerobik metanotrofik arkeler (ANME), MCR enzimini kullanarak metanı karbondioksite oksitlerken, sülfat indirgeyen bakteriler (SRB) sülfatı sülfüre indirger. SRB, hidrojen ve asetat için metanojenleri geride bırakarak sülfat tükenene kadar metan üretimini sınırlar16,17.

Buna karşılık, aerobik metanotrofik bakteriler, farklı metan monooksijenaz (MMO) formlarını kullanarak aerobik ortamlarda20 CH4'ü oksitler. Bunlar, intrasitoplazmik zara gömülü bakır içeren bir enzim olan partikül metan monooksijenaz (pMMO) ve sitoplazmada bulunan demir içeren bir enzim olan çözünür metan monooksijenaz (sMMO) içerir. Bununla birlikte, pMMO için üç gen operonu vardır: pmoCAB21; Bunlar arasında, pmoA geni tüm metanotroflar için en muhafazakar olanıdır. pmoA için iki farklı biyobelirteç geni vardır: pmoA1 ve pmoA222. Ayrıca, metanotrofların kapsamlı bir şekilde anlaşılması için, mmoX geni, moleküler biyolojide sMMO içeren metanotrofları tanımlamak için bir araç olarak kullanılır23. Metanojenlerin ve aerobik metanotrofların metabolik yolakları ve çevresel gereksinimlerindeki bu ayrım, kıyı sulak alan ekosistemlerinde metan döngüsünü düzenleyen karmaşık mikrobiyal etkileşimleri vurgulamaktadır.

Güney Teksas'ta verimli bir tuzlu su ortamı olan Boca Chica (BC) sulak alanı, Meksika Körfezi'nden (GOM) gelgit etkileri yaşar ve özellikle hipersalin LagunaMadre 24'e yakınlığı nedeniyle değişken yüzey tuzluluk seviyelerine yol açar. Yüksek ve düşük gelgitler arasında değişen bu gelgit hareketi, oksijen seviyelerinindalgalanmasına neden olur 25 bu da tortulardaki26 metanojen ve metanotrof aktivitesini değiştirebilir. Buna karşılık, kıyı tatlı su sulak alanları, CH4 akışları27 için önemli bir sıcak nokta olarak kabul edilmektedir. GOM'un gelgit etkilerinden uzakta olan Resaca Del Rancho Viejo (RV) ve Lozano Banco (LB) dahil olmak üzere Güney Teksas'taki kıyı tatlı su sulak alanları, farklı hidrolojik yönetime sahiptir. RV, düşük su seviyeleri sırasında nehir suyu ile desteklenen nabız akışlarını deneyimlerken, LB bu tür bir takviye olmadan çevrimdışı bir akış sistemi olarak çalışır. Ayrıca, RV ve LB, sırasıyla yapay olarak pompalanan tatlı suyun yüksek deşarjı ve bir oxbow gölü olması nedeniyle daha düşük tuzluluk seviyelerini korur. Farklı çevresel faktörler, Güney Teksas kıyı sulak alanlarında metan döngüsünü önemli ölçüde etkileyebilir. Bununla birlikte, Güney Teksas kıyı sulak alanlarında metan döngüsü, henüz kapsamlı bir şekilde araştırılmamış bir alan olmaya devam etmektedir.

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve gerçek zamanlı PCR (kantitatif PCR [qPCR] olarak da adlandırılır), çevresel örneklerdeki spesifik genlerin nispi bolluğunu tespit etmek ve ölçmek için temel ve yaygın olarak kullanılan teknikleri temsil eder. Bu teknikler,CH4 döngüsüyle ilgili genlerin varlığını ve nispi miktarını belirtmek için DNA'nın hedeflenen bölgelerini spesifik olarak çoğaltır ve potansiyel metan döngüsünün göstergelerini sağlar. Bununla birlikte, PCR primer setlerinin mevcudiyeti ve etkinliği, ekstrakte edilen çevresel DNA'daki çeşitli inhibitör faktörler tarafından sınırlandırılabilir ve ortam türlerinden etkilenir28,29. Bu nedenle, bu çalışma esas olarak Güney Teksas kıyı sulak alanlarında CH4 döngüsüyle ilgili genlerin varlığını tespit etmek için optimal bir PCR yöntemi oluşturdu (Şekil 1) ve daha sonra bu ekosistemlerdeki niceliksel nispi bolluklarını görselleştirdi. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, çeşitli kıyı ekosistemlerinde CH4 döngüsü ve mikrobiyal dinamiklerin anlaşılmasını geliştirmek için diğer kıyı bölgelerine uygulanabilir.

Protokol

1. Örnek toplama

  1. Bir tortu tutucu örnekleyici veya kürek kullanarak tortu örneklerini toplayın.
    NOT: Örnekler, 2023 ve 2024 yıllarının serin (Ekim-Şubat, ortalama sıcaklık 20 °C) ve ılık (Nisan-Haziran, ortalama sıcaklık 27 °C) mevsimlerinde üç farklı kıyı sulak alanının iki istasyonundan toplanmıştır. Kıyı tatlı su sulak alanlarından örnekler toplanırken bir tortu kapma örnekleyicisi kullanıldı (Şekil 2) ve gelgitten etkilenen kıyı tuzlu su sulak alanları için bir kürek kullanıldı.
  2. Örnekleyiciyi önce sığ su kütlesine indirin ve Şekil 50'de gösterildiği gibi tortu yapısındaki rahatsızlığı en aza indirerek kendi ağırlığı altında tortu yüzeyine (üst 2 cm içinde) batmasına izin verin.
  3. Derinliğin tipik olarak 60 cm ila 215 cm30 olduğu su sütunundan dışarı çekin, tortu örneklerini kilitli torbalara aktarın ve hemen bir buz kutusunda saklayın.
    NOT: Sonraki istasyonlara geçmeden önce kepçe örnekleyicisini deiyonize (DI) suyla temizleyin ve yıkayın.
  4. Tüm numuneleri hemen laboratuvarda -20 °C'de saklayın.
  5. Her numune alma sahasında, çok parametreli bir su kalitesi ölçer kullanarak tuzluluk ve sıcaklık gibi yüzey suyu kalitesi parametrelerini yerinde ölçün.
    NOT: Problar, her istasyonda kullanımdan sonra deiyonize su (DI su) ile durulanmıştır.

2. Genomik DNA ekstraksiyonu

  1. Genomik DNA ekstraksiyonu prosedürüne başlamadan önce numuneleri oda sıcaklığında çözdürün.
  2. Yaklaşık 500 mg tortu örneğini 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve tüm suyu çıkarmak için 4.250 × g'da 3 dakika santrifüjleyin.
  3. Üreticinin31 protokolünü izleyerek küçük bir değişiklikle toprak için bir DNA ekstraksiyon kiti kullanarak genomik DNA'yı çıkarın ve hemen -20 °C'de saklayın.
    NOT: Değişiklikler, yedekliliği ve verimli iş akışını azaltmak için yapılmıştır.
    1. Cam boncuk / seramik küre içeren bir tüpe 500 mg'a kadar toprak örneği ekleyin.
    2. Boncuk/küre içeren tüpteki numuneye 978 μL Sodyum Fosfat Tamponu ekleyin.
    3. Harici kirleticileri çözündürmek için boncuk / küre içeren tüpteki numuneye 122 μL tampon lizis çözeltisi ekleyin.
    4. 20 saniye boyunca 5 kat hız seviyesinde bir boncuk değirmeni homojenizatörü kullanarak homojenize edin ve 2 kez tekrarlayın.
      NOT: Bu çalışmada bir boncuk değirmeni homojenizatörü kullanılmıştır, bu nedenle hız ayarlanmıştır.
    5. Karışımı 14.000 × g'da 10 dakika santrifüjleyin.
    6. Süpernatanı temiz bir 2.0 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    7. Çözünmüş nükleik asitleri hücresel kalıntı ve parçalanma matrisinden ayırmak için 250 μL protein çökeltme çözeltisi (PPS) ekleyin. Tüpü 10x ters çevirerek karıştırın.
    8. Peletleri çökeltmek, hücresel kalıntıları gidermek ve matrisi parçalamak için 14.000 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
    9. Süpernatanı temiz bir 15 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    10. 15 mL'lik tüpteki süpernatanıma 1.0 mL Bağlayıcı Matris süspansiyonu ekleyin.
      NOT: Eklemeden önce yeniden askıya almak için Bağlama Matrisi süspansiyonunu sallayın.
    11. Tüpleri 2 dakika boyunca bir döndürücü üzerine yerleştirerek DNA'nın Bağlanma Matrisine bağlanmasına izin verin.
    12. Tüm tüpleri bir rafa yerleştirin ve Bağlama Matrisinin yerleşmesini sağlamak için 3 dakika inkübe edin.
    13. 3 dakika sonra 750 μL'yi atın ve kalan süpernatanı bir pipet kullanarak pelet ile nazikçe karıştırın.
    14. Karışımın 750 μL'sini bir SPIN filtresine aktarın ve 14.000 × g'da 1 dakika santrifüjleyin. Yakalama tüpünü boşaltın ve tekrar kullanın. Kalan karışımla tekrarlayın.
    15. Safsızlıkları daha fazla çözündürmek için hazırlanan yıkama çözeltisinden 500 μL (uygun miktarda etanol eklenerek) ekleyin. Pipet ucundan gelen sıvının kuvvetini kullanarak peleti nazikçe yeniden süspanse edin.
    16. Kirleri gidermek için 14.000 × g'da 1 dakika santrifüjleyin. Yakalama tüpünü boşaltın ve tekrar kullanın.
    17. Hiçbir şey eklemeden 14.000 × g'da 2 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.
    18. Yakalama borusunu yeni, temiz bir yakalama borusuyla değiştirin ve SPIN Filtresini oda sıcaklığında 5 dakika havayla kurutun.
    19. 50 μL DNAse serbest su (DES) ekleyin ve 14.000 × g'da 1 dakika santrifüjleyin.
      NOT: Bu protokolde, ekstrakte edilen çevresel DNA'nın (eDNA) optimal geri kazanımını ve stabilitesini sağlamak için DNA elüsyonu için 50 μL DES kullanılmıştır.

3. DNA nicelemesi

  1. 0,5 mL'lik bir tüpe 200 μL floresan boya ile 1 μL ekstrakte edilmiş DNA ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın.
  2. Tüpü hemen alüminyum folyo ile sarın, böylece ışık nüfuz edemez ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edemez.
  3. Üreticinin protokolünü izleyerek ONE DNA konsantrasyon modunda bir florometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün.

4. Konvansiyonel PCR ile 16S rRNA, pmoA1 , pmoA2 , mmoX ve mcrA'nın tespiti

  1. Konvansiyonel PCR'yi (cPCR) çalıştırmadan önce, tüm numuneleri ve reaktifleri bir buz kovasında çözün.
  2. Ekstrakte edilen tüm eDNA örneklerini 10 ng/μL'ye seyreltin.
    NOT: Primerlerin bir listesi Tablo 1'de verilmiştir.
  3. Her numune için 12,5 μL 2x PCR Master karışımı, 0,5 μL ileri ve geri primer (10 μM) (primer listesi için Tablo 1'e bakınız), 1 μL 10 ng/μL eDNA ve 10,5 μL nükleaz içermeyen su dahil olmak üzere 25 μL'lik bir cPCR reaksiyon karışımı hazırlayın.
    NOT: Pipetleme hatalarını en aza indirmek için ana karışımı fazladan bir numune için yeterli hacimde hazırlayın.
  4. 2 dakika boyunca 95 ° C'de bir başlangıç denatürasyonu, ardından 45 s boyunca 95 ° C'de 40 döngü denatürasyon, 30 s boyunca 72 ° C'de uzatma ve 72 ° C'de 5 m boyunca son uzatma, farklı primerler için değişen tavlama sıcaklığı ile (farklı genler için kullanılan farklı primerlerin tavlama sıcaklıkları için Tablo 1'e bakınız).
    NOT: mcrA geni için, ML primerleri, ilk beş döngü32 için tavlama ve uzatma adımları arasında 0.1 °C/s'lik yavaş bir rampa hızı kullanarak istenen bandı gösterdi.
  5. cPCR ürünlerini, etidyum bromür (EtBr) ile boyanmış bir agaroz jel içinde görselleştirin.
    NOT: 50 bp'lik bir merdiven için% 2.5 agaroz jel ve 1 kb'lik bir merdiven için% 0.9 jel kullanın. %2.5 agaroz jel için 1x TAE tamponu ve %0.9 agaroz jel için 0.5x TAE tamponu kullanın.

5. Kantitatif gerçek zamanlı PCR ile pmoA1 , pmoA2 , mmoX ve mcrA'nın tespiti

NOT: pmoA1, pmoA2, mmoX ve mcrA bolluğu gibi metanojen ve metanotrof hedefli genler, gerçek zamanlı bir PCR sistemi kullanılarak qPCR ile gözlemlendi.

  1. Her gen için standart eğriyi elde etmek için her gen için standartları ayrı ayrı hazırlayın.
    1. Her bir genin jel elektroforezi sırasında en parlak bandı üreten örnekleri kullanarak hedeflenen geni cPCR ile amplifiye edin. Bölüm 4'te açıklanan yöntemi ve primerleri izleyin.
    2. Amplifiye edilmiş ürünleri bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak saflaştırın ve bölüm 3'te açıklanan yöntemi izleyerek DNA konsantrasyonunu ölçün ve -20 °C'de saklayın.
      NOT: Saflaştırılmış standartları daha fazla kullanım için ayrı tüplere ayırın.
    3. qPCR için kopya sayısı hesaplama web sitesini kullanarak ölçülen DNA konsantrasyonundan gen kopyalarını hesaplayın.
    4. qPCR'yi çalıştırmadan önce 108 ila 102 kopya/μL arasında değişen her standardı hazırlamak için standardın hesaplanan kopya numarasını nükleaz içermeyen su ile seyreltin.
    5. Negatif bir kontrol (NTC, şablon DNA yok) dahil olmak üzere her kopya numarasının üç kopyasını kullanarak standart eğriyi hazırlayın.
      NOT: Her standart eğrininR2 değeri 0,99'dan büyüktü.
  2. Tüm numuneler, standartlar ve NTC için 20 μL'lik bir qPCR reaksiyon karışımı hazırlayın. qPCR analizini tüm numuneler için üç nüsha halinde gerçekleştirin.
    1. qPCR ana karışımı, astarlar, nükleaz içermeyen su, standartlar ve numuneler dahil olmak üzere tüm reaksiyon bileşenlerini başlamadan önce bir buz rafına yerleştirin.
    2. 10 μL SYBR Green ana karışımı, her 10 μM ileri ve geri primerden 0,5 μL, 8 μL nükleaz içermeyen su ve 1 μL 10 ng/μL şablon DNA veya standart veya DI su içeren her numune, standart ve NTC için 20 μL'lik bir qPCR reaksiyon karışımı hazırlayın.
      NOT: qPCR için konvansiyonel PCR'de pmoA1 ve mcrA genleri için en iyi sonuçları vermek için gösterilen primer setlerini kullanın (bkz. Tablo 1). Doğruluğu artırmak için her örneği üç nüsha halinde çalıştırın. Aşağıdaki adımlar, numune başına toplam hacmi 60 μL olan üçlü numunelerin hazırlanması için etkili bir yöntem sağlar.
      1. Ana karışımı, spesifik gen için ileri ve geri primerleri ve şablon DNA hariç 2 mL'lik bir tüpte nükleaz içermeyen suyu birleştirmek için reaksiyon karışımını hazırlayın.
        NOT: Pipetleme hatasını göz önünde bulundurarak reaksiyon karışımı hacmini hazırlayın. Örneğin, 24 numune ve 8 standart varsa, pipetleme hatalarını en aza indirmek için 32 reaksiyon yerine 33 reaksiyonun toplam hacmini hesaplayın. Bu durumda, üçlü reaksiyonlar için gereken toplam hacim şu şekilde olacaktır: 990 μL ana karışım (33 numune x 3 tekrar x 10 μL), 49.5 μL ileri primer (33 numune x 3 tekrar x 0.5 μL), 49.5 μL ters primer (33 numune x 3 tekrar x 0.5 μL) ve 792 μL nükleaz içermeyen su (33 numune x 3 tekrar x 8 μL).
      2. PCR tüplerini numune sayısına ve standartlara göre hazırlayın.
      3. Hazırlanan reaksiyon karışımından 57 μL'yi her bir PCR tüpüne dağıtın.
        NOT: Üç kopya halinde her numune için qPCR gerçekleştirmek için, numune başına toplam 57 μL'lik bir reaksiyon karışımı hacmi hazırlayın (şablon DNA, standart veya su hariç). Bu hacim, bir numune için eşit olarak üç kuyucuğa bölünecek ve her bir oyuğa 19 μL tahsis edilecektir.
      4. Her tüpe 3 μL şablon DNA, standart veya nükleaz içermeyen su ekleyin ve tüpün dibine hafifçe vurarak karıştırın.
        NOT: Bir numune için hazırlanan reaksiyon karışımının toplam hacmi, şimdi her tüpte 60 μL olacaktır.
    3. Hazırlanan reaksiyon karışımının her tüpten 20 μL'sini 96 oyuklu bir qPCR plakasının belirlenmiş kuyucuklarına alın. PCR plakasını bir aplikatör kullanarak yapışkan PCR Sızdırmazlık Filmi ile kapatın.
    4. Kuyucuklardaki kabarcıkları ortadan kaldırmak için uygun karışımı sağlamak için kapalı plakayı 1.000 × g'da 1 dakika santrifüjleyin.
  3. PCR plakasını termal döngüleyiciye yerleştirin. qPCR makinesini açın ve ardından protokolü ayarlamak için ilgili yazılımı açın.
    1. Protokolü qPCR ana karışım yönergelerine göre ayarlayın. Aşağıdaki protokolü kullanın: 10 dakika boyunca 95 °C, ardından 15 saniye boyunca 95 °C ve 30 saniye boyunca 72 °C'de bir uzatma adımı. Tavlama adımını, Tablo 1'deki ilgili astarlar için belirtilen tavlama sıcaklığında 45 s boyunca gerçekleştirin. Tüm qPCR çalıştırmalarını 35 döngü boyunca gerçekleştirin.
    2. 96 oyuklu qPCR plakasını, numune içeren plaka ile aynı konfigürasyonda standartlar ve NTC'ler ile ayarlayın.
  4. Her bir numunedeki amplifiye edilmiş ürünü ve gen kopya numarasını ölçmek için mutlak miktar tayini standart eğri yöntemini kullanın33.

6. Güney Teksas Kıyı sulak alanlarının haritasında metan döngüsü genlerinin görselleştirilmesi

  1. Coğrafi bilgi sistemi (CBS) yazılımı ArcGIS Pro'yu açın ve proje dosyasını Study Area adıyla bilgisayarda belirtilen klasöre kaydedin.
  2. Sol üstteki Harita'ya tıklayın | Temel Harita'yı seçin ve temel harita olarak Etiketlerle Arazi'yi seçin.
  3. Bul'a tıklayın | Arama yapın ve arama çubuğu açıldığında, alanın adını yazarak çalışma alanını bulun; alan görünecektir.
  4. Georeferencing kullanarak belirli bir alanı çizin.
    1. Görüntüle'ye tıklayın | Üst katmandan Katalog Bölmesi.
    2. Katalogdan Klasör'e çift tıklayın | Dosya Adı.
    3. Geodatabase (.gdb) dosyasına sağ tıklayın ve ardından Yeni | Özellik Sınıfı ve Özellik Sınıfı Oluştur görünecektir.
    4. Ad ve Takma Ad kutusunu yazın ve alttaki Son'a tıklayın.
    5. Görüntüle'ye tıklayın | İçindekiler. Diğer ad adı, İçindekiler Bölmesinde gösterilir.
    6. Üst katmandan Düzenle'ye tıklayın | Oluşturun. Özellik Oluştur bölmesi açılacaktır. Özellik Oluştur bölmesindeki Takma Ad'a çift tıklayın ve Araç Geri Bildirim Seçeneklerini Yapılandır görünecektir.
    7. Çizgiler'i seçin, ardından çalışma alanının dış sınırını oluşturmak için harita üzerinde çizgiler çizin. İşiniz bittiğinde haritaya çift tıklayın.
  5. CBS yazılımını simge durumuna küçültün, ardından bir elektronik tablo açın. İlk sütuna örnek adını yazın, ikinci sütuna enlemi ve üçüncü sütuna boylamı girin. pmoA1, pmoA2, mmoX ve mcrA'nın qPCR verileri için sonraki dört sütunu kullanın.
  6. Dosyayı bilgisayarın herhangi bir klasörüne CSV biçiminde kaydedin.
  7. CBS yazılımını tekrar açın ve Veri Ekle | XY Nokta Verileri.
  8. Bilgisayardaki Giriş Tablosu kutusundaki klasörden CSV dosyasını seçin. Çıktı Özelliği Sınıfı'nda dosya adını yeniden adlandırın, ardından örnekleme noktalarını haritada görüntülemek için Çalıştır'a tıklayın.
  9. Tıklavüstteki arama çubuğuna gidin ve Kriging'i arayın.
  10. Örnekleme istasyonu dosyasını seçin ve ardından pmoA1'i seçin.
  11. Ortam'a tıklayın | Katman ve maskede örnekleme istasyonunu seçin | Çalıştır'ı tıklayın.
  12. Tüm çalışma alanı için pmoA2, mmoX ve mcrA için Kriging oluşturmak için 6.9, 6.10 ve 6.11 adımlarında belirtilen protokolleri izleyin.
  13. Haritanın bir düzenini oluşturun.
    1. Üst katmandan ekle'ye tıklayın | Yeni Düzen'i seçin ve ANSI - Yatay'ı seçin.
    2. Harita Çerçevesi'ne tıklayın, Kriging ile haritayı seçin ve bir dikdörtgen çizerek tüm haritaları düzene yerleştirin. Bu, haritayı düzende görünür hale getirecektir.
    3. Kuzey Okunu seçin ve Kuzey yönünü belirtmek için mizanpaja yerleştirin.
    4. Haritada alanın ölçeğini görüntülemek için Ölçek Çubuğu'nu seçin.
    5. Göstergeleri görüntülemek için Gösterge'ye tıklayın, ardından düzene yerleştirin.
    6. Izgara'ya tıklayın ve siyah graticule seçeneklerinden herhangi birini seçin. Bu, enlem ve boylam ile ızgarayı oluşturur ve İçindekiler Bölmesinde Siyah Yatay Etiket Graticule etiketiyle görüntüler.
    7. Black Horizontal Label Graticule'a çift tıklayın, ardından Components'ı (Bileşenler) seçin. Keneler 1 ve Izgara'ya tıklayın ve sağlarındaki çarpı işaretine tıklayarak bu bileşenleri kaldırın.
  14. Üst katmandan Paylaş'a tıklayın, ardından Düzeni Dışa Aktar'a tıklayın. Dosya türünü PDF olarak seçin, Ad Kutusu'nu kullanarak dosyayı bilgisayara kaydedin, dikey çözünürlüğü 500 DPI olarak ayarlayın ve haritanın PDF dosyasını oluşturmak için Dışa Aktar'ı tıklatın.

Sonuçlar

Güney Teksas'ın kıyı sulak alanlarındakiCH4 döngüsüyle ilgili genlerin (mcrA, pmoA1, pmoA2 ve mmoX) dağılımını ve bolluğunu anlamak için, her numuneden ekstrakte edilen eDNA cPCR ve qPCR ile analiz edildi. Her bir biyobelirteç için evrensel primerler, önceki çalışmalardan cPCR'yi çalıştırmak üzere seçildi (Tablo 1)22,34,35,36,37 ve numune özelliklerine ve çevresel koşullara dayalı olarak tavlam...

Tartışmalar

Kıyı sulak alanları, önemli bir sera gazı olan atmosferik metan gazına önemli katkılarda bulunan kişiler olarak kabul edilmektedir40. Sulak alanlardametan akışı ve metanojenler hakkında çalışmalar yapılmış olmasına rağmen 41,42,43, metanotrofların farklı ortamlarda veya çeşitli yönetim uygulamaları altında, özellikle dalgalanan su seviyelerine...

Açıklamalar

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Saha gözlemi ve laboratuvar analizlerindeki yardımları için C-REAL üyelerine teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL PCR tubesThermoFisher ScientificAB0620https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AB0620?SID=srch-srp-AB0620
0.5 mL PCR TubesPromegaE4941https://www.promega.com/products/biochemicals-and-labware/tips-and-accessories/0_5ml-pcr-tubes/?catNum=E4941
10 μL tipsThermoFisher Scientific05-408-187Fisherbrand SureGrip Pipet Tip Racked or Reload System Tips Natural; 10μL; | Fisher Scientific
15 mL centrifuge tubeThermoFisher Scientific14-959-53Ahttps://www.fishersci.com/shop/products/falcon-15ml-conical-centrifuge-tubes-5/p-193301
200 μL tipsThermoFisher Scientific05-408-190Fisherbrand SureGrip Pipet Tip Racked or Reload System Tips Natural; 200μL; | Fisher Scientific
1000 μL tipsThermoFisher Scientific02-707-402https://www.fishersci.com/shop/products/sureone-micropoint-pipette-tips-specific-standard-fit/02707402?gclid=Cj0KCQiAp
NW6BhD5ARIsACmEb
kUsQ9Lu0YIq5i4vWege
17qPdtxIYZyvmJH1cDo
ARuwereO1V4GLz9UaA
lDREALw_wcB&ef_id=C
j0KCQiApNW6BhD5ARI
sACmEbkUsQ9Lu0YIq5i
4vWege17qPdtxIYZyvmJ
H1cDoARuwereO1V4GLz
9UaAlDREALw_wcB:G:s
&ppc_id=PLA_goog_2175
7693617_171052169911_02
707402__715434303113_1555
377385658230343&ev_chn=sh
op&s_kwcid=AL!4428!3!71543430
3113!!!g!2366517300713!&gad_source=1
Applied Biosystem Power SYBR Green Master Mix ThermoFisher Scientific4368577https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4368577
ArcGIS Pro esrihttps://www.esri.com/en-us/arcgis/products/arcgis-pro/overview?srsltid=AfmBOopatJ4
JvHJfscHRcAaDx0Jz5_Jrl8l5
vYkkBvfOqE-uNSsMghN1
CFX Duet Real-Time PCR system Bio-Rad12016265https://www.bio-rad.com/en-us/product/cfx-duet-real-time-pcr-system?ID=97722926-9ed9-16a4-1d83-c92f587e427a
Corning Lambda plus single channel pipettor
volume 0.5-10 μL		Sigma-AldrichCLS4071-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cls4071
Corning Lambda plus single channel pipettor volume 100-1000 μLSigma-AldrichCLS4075-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cls4075
Corning Lambda plus single channel pipettor volume 20-200 μLSigma-AldrichCLS4074-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cls4074
FastDNA spin kit for soilMP Biomedical116560200-CFhttps://www.mpbio.com/us/116560000-fastdna-spin-kit-for-soil-samp-cf?srsltid=AfmBOoqOxxGilzY3IHNIZR
ajegGTr9MoX1oMZUh
3dcbJqe0UvvukY128
Gene copy  calculatorScience Primerhttps://scienceprimer.com/copy-number-calculator-for-realtime-pcr .
High speed benchtop centrifugeThermoFisher Scientific75004241https://newlifescientific.com/products/thermo-scientific-sorvall-st16-high-speed-benchtop-centrifuge-75004241?gad_source=1&gclid=Cj0KCQiApN
W6BhD5ARIsACmEbkVC_-cCIN9j
20TvYq8iDsBlUR5cPK_1_wN
OBEcjMdv-CYVoGCfeOLYaAv
enEALw_wcB
High speed microcentrifugeVWR75838-336https://us.vwr.com/store/product/20546590/null
Lysing Matrix E tube glass bead/ceramic sphere-containing tube
Microcentrifuge tubeThermoFisher Scientific02-681-320https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/02681320?gclid=Cj0KCQiAp
NW6BhD5ARIsACm
EbkWbG4_o3oUiGk
HJPU-_31-CuexDwQ
fmWPnfyhBOf2BHXsy
K3fFW1toaAgJbEALw_
wcB&ef_id=Cj0KCQiAp
NW6BhD5ARIsACmEb
kWbG4_o3oUiGkHJPU-
_31-CuexDwQfmWPnfy
hBOf2BHXsyK3fFW1toa
AgJbEALw_wcB:G:s&ppc
_id=PLA_goog_21757693
617_171052169911_0268
1320__715434303113_10
349826094968484711&ev
_chn=shop&s_kwcid=AL!4
428!3!715434303113!!!g!23
66517300713!&gad_source=1
PCR Master mix PromegaM7502https://www.promega.com/products/pcr/taq-polymerase/master-mix-pcr/?catNum=M7502
Quantiflour ONE dsDNA system PromegaE4871https://www.promega.com/products/rna-analysis/dna-and-rna-quantitation/quantifluor-one-dsdna-system/?gad_source=1&gbraid=0AAAAAD
_rg189yJTY3cxeVqMdu8RPx10
Ma&gclid=CjwKCAjwxNW2BhAk
EiwA24Cm9FUgViPNyWq7UfZL
VeeoroLAZ5JIP6w07RGK_4D0w
oZgAqf-G1XTmxoCxm8QAvD_B
wE&catNum=E4871
Quantus Fluorometer PromegaE6150https://www.promega.com/products/microplate-readers-fluorometers-luminometers/fluorometers/quantus-fluorometer/?catNum=E6150
YSI Pro 2030YSI a xylem brand603174https://www.ysi.com/product/id-p2030/pro2030-kits

Referanslar

  1. Xu, T., et al. Wetlands of international importance: Status, threats, and future protection. Int J Environ Res Public Health. 16 (10), 1818 (2019).
  2. Corn, M. L. . Deepwater Horizon oil spill: coastal wetland and wildlife impacts and response. , (2010).
  3. Hendriks, I. E., Sintes, T., Bouma, T. J., Duarte, C. M. Experimental assessment and modeling evaluation of the effects of the seagrass Posidonia oceanica on flow and particle trapping. Marine Ecology Progress Series. 356, 163-173 (2008).
  4. Krause, S. J. E., Treude, T. Deciphering cryptic methane cycling: Coupling of methylotrophic methanogenesis and anaerobic oxidation of methane in hypersaline coastal wetland sediment. Geochimica et Cosmochimica Acta. 302, 160-174 (2021).
  5. Reddy, K. R., DeLaune, R. D., Inglett, P. W. . Biogeochemistry of Wetlands: Science and Applications. , (2022).
  6. La, W., et al. Sulfate concentrations affect sulfate reduction pathways and methane consumption in coastal wetlands. Water Research. 217, 118441 (2022).
  7. Derwent, R. G. Global warming potential (GWP) for methane: Monte Carlo analysis of the uncertainties in Global Tropospheric Model predictions. Atmosphere. 11 (5), 486 (2020).
  8. Potter, C., et al. Methane emissions from natural wetlands in the United States: Satellite-derived estimation based on ecosystem carbon cycling. Earth Interactions. 10 (22), 1-12 (2006).
  9. . Understanding global warming potentials Available from: https://www.epa.gov/ghgemissions/understanding-global-warming-potentials (2024)
  10. Wallenius, A. J., Dalcin Martins, P., Slomp, C. P., Jetten, M. S. M. Anthropogenic and environmental constraints on the microbial methane cycle in coastal sediments. Front Microbiol. 12, 631621 (2021).
  11. Qu, Y., et al. Salinity causes differences in stratigraphic methane sources and sinks. Environmental Science and Ecotechnology. 19, 100334 (2024).
  12. Vizza, C., West, W. E., Jones, S. E., Hart, J. A., Lamberti, G. A. Regulators of coastal wetland methane production and responses to simulated global change. Biogeosciences. 14 (2), 431-446 (2017).
  13. van Dijk, G., et al. Salinization lowers nutrient availability in formerly brackish freshwater wetlands; unexpected results from a long-term field experiment. Biogeochemistry. 143 (1), 67-83 (2019).
  14. Aronson, E., Allison, S., Helliker, B. R. Environmental impacts on the diversity of methane-cycling microbes and their resultant function. Front Microbiol. 4, 225 (2013).
  15. Reeburgh, W. S. Oceanic methane biogeochemistry. Chem Rev. 107 (2), 486-513 (2007).
  16. Thauer, R. K. Biochemistry of methanogenesis: a tribute to Marjory Stephenson. Marjory Stephenson Prize Lecture. Microbiology (Reading). 144 (Pt 9), 2377-2406 (1998).
  17. Thauer, R. K. Anaerobic oxidation of methane with sulfate: on the reversibility of the reactions that are catalyzed by enzymes also involved in methanogenesis from CO2. Curr Opin Microbiol. 14 (3), 292-299 (2011).
  18. Friedrich, M. W. Methyl-coenzyme M reductase genes: Unique functional markers for methanogenic and anaerobic methane-oxidizing Archaea. Methods in Enzymology. 397, 428-442 (2005).
  19. Reeburgh, W. S. Oceanic methane biogeochemistry. Chem Rev. 107 (2), 486-513 (2007).
  20. Rasigraf, O., Schmitt, J., Jetten, M. S. M., Lüke, C. Metagenomic potential for and diversity of N-cycle driving microorganisms in the Bothnian Sea sediment. Microbiologyopen. 6 (4), e00475 (2017).
  21. McDonald, I. R., Bodrossy, L., Chen, Y., Murrell, J. C. Molecular ecology techniques for the study of aerobic methanotrophs. Appl Environ Microbiol. 74 (5), 1305-1315 (2008).
  22. Tchawa Yimga, M., Dunfield, P. F., Ricke, P., Heyer, J., Liesack, W. Wide distribution of a novel pmoA-like gene copy among type II methanotrophs, and its expression in Methylocystis strain SC2. Appl Environ Microbiol. 69 (9), 5593-5602 (2003).
  23. Knief, C. Diversity and habitat preferences of cultivated and uncultivated aerobic methanotrophic bacteria evaluated based on pmoA as molecular marker. Front Microbiol. 6, 1346 (2015).
  24. Huang, I. -. S., et al. Preliminary assessment of microbial community structure of Wind-Tidal Flats in the Laguna Madre, Texas, USA. Biology. 9 (8), 183 (2020).
  25. Wilding, T. K., Brown, E., Collier, K. J. Identifying dissolved oxygen variability and stress in tidal freshwater streams of northern New Zealand. Environ Monit Assess. 184 (10), 6045-6060 (2012).
  26. Roy Chowdhury, T., Mitsch, W. J., Dick, R. P. Seasonal methanotrophy across a hydrological gradient in a freshwater wetland. Ecological Engineering. 72, 116-124 (2014).
  27. Sun, Q. -. Q., et al. Carbon dioxide and methane fluxes: Seasonal dynamics from inland riparian ecosystems, northeast China. Sci Total Environ. 465, 48-55 (2013).
  28. Lee, S., et al. Comparison and selection of conventional PCR primer sets for studies associated with nitrogen cycle microorganisms in surface soil. Appl Sci. 12 (20), 10314 (2022).
  29. Bae, K. -. S., et al. Development of diagnostic systems for wide range and highly sensitive detection of two waterborne hepatitis viruses from groundwater using the conventional reverse transcription nested PCR assay. J Virol Methods. 299, 114344 (2022).
  30. Lecusay, D. . Assessment and Monitoring of Deltaic Wetlands and Fluvial Systems: Refining and Validating a Multimetric Index of Resaca Ecosystem Health. , (2021).
  31. . FastDNA SPIN Kit for Soil (Cat No. 116560200) Available from: https://www.mpbio.com/media/productattachment/LS082019-EN-FastDNA-SPIN-Kit-for-Soil-116560200-Manual.pdf (2025)
  32. Luton, P. E., Wayne, J. M., Sharp, R. J., Riley, P. W. The mcrA gene as an alternative to 16S rRNA in the phylogenetic analysis of methanogen populations in landfill. Microbiology (Reading, England). 148 (Pt 11), 3521-3530 (2002).
  33. Changsoo, L., Jaai, K., Seung Gu, S., Seokhwan, H. Absolute and relative QPCR quantification of plasmid copy number in Escherichia coli. J Biotechnol. 123 (3), 273-280 (2006).
  34. Harms, G., et al. Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant. Environ Sci Technol. 37 (2), 343-351 (2003).
  35. Holmes, A. J., Costello, A., Lidstrom, M. E., Murrell, J. C. Evidence that particulate methane monooxygenase and ammonia monooxygenase may be evolutionarily related. FEMS Microbiol Lett. 132 (3), 203-208 (1995).
  36. Fuse, H., et al. Oxidation of trichloroethylene and dimethyl sulfide by a marine Methylomicrobium strain containing soluble methane monooxygenase. Biosci Biotechnol Biochem. 62 (10), 1925-1931 (1998).
  37. Springer, E., Sachs, M. S., Woese, C. R., Boone, D. R. Partial gene sequences for the A subunit of methyl-coenzyme M reductase (mcrI) as a phylogenetic tool for the family Methanosarcinaceae. Int J Syst Bacteriol. 45 (3), 554-559 (1995).
  38. Costello, A. M., Lidstrom, M. E. Molecular characterization of functional and phylogenetic genes from natural populations of methanotrophs in lake sediments. Appl Environ Microbiol. 65 (11), 5066-5074 (1999).
  39. Flores, E. A. . Effects of Nutrient Enrichment on Mangrove and Saltmarsh Habitats. , (2022).
  40. Minjie, H., Jordi, S., Xianyu, Y., Josep, P., Chuan, T. Patterns and environmental drivers of greenhouse gas fluxes in the coastal wetlands of China: A systematic review and synthesis. Environ Res. 186, 109576 (2020).
  41. Bridgham, S. D., Cadillo-Quiroz, H., Keller, J. K., Zhuang, Q. Methane emissions from wetlands: biogeochemical, microbial, and modeling perspectives from local to global scales. Glob Chang Biol. 19 (5), 1325-1346 (2013).
  42. Liu, D. Y., Ding, W. X., Jia, Z. J., Cai, Z. C. Relation between methanogenic archaea and methane production potential in selected natural wetland ecosystems across China. Biogeosciences. 8 (2), 329-338 (2011).
  43. Ke, Z., et al. Methane emissions and methanogenic community investigation from constructed wetlands in Chengdu City. Urban Climate. 39, 100956 (2021).
  44. Chowdhury, T. R., Dick, R. P. Ecology of aerobic methanotrophs in controlling methane fluxes from wetlands. Applied Soil Ecology. 65, 8-22 (2013).
  45. Maja, S., et al. Humic substances cause fluorescence inhibition in real-time polymerase chain reaction. Anal Biochem. 487, 30-37 (2015).
  46. Sanches, T. M., Schreier, A. D. Optimizing an eDNA protocol for estuarine environments: Balancing sensitivity, cost and time. PLOS ONE. 15 (5), e0233522 (2020).
  47. Xia, Z., et al. Conventional versus real-time quantitative PCR for rare species detection. Ecol Evol. 8 (23), 11799-11807 (2018).
  48. Bourne, D. G., McDonald, I. R., Murrell, J. C. Comparison of pmoA PCR primer sets as tools for investigating methanotroph diversity in three Danish soils. Appl Environ Microbiol. 67 (9), 3802-3809 (2001).
  49. Juottonen, H., Galand, P. E., Yrjala, K. Detection of methanogenic Archaea in peat: comparison of PCR primers targeting the mcrA gene. Res Microbiol. 157 (10), 914-921 (2006).
  50. Lueders, T., Friedrich, M. W. Evaluation of PCR amplification bias by terminal restriction fragment length polymorphism analysis of small-subunit rRNA and mcrA genes by using defined template mixtures of methanogenic pure cultures and soil DNA extracts. Appl Environ Microbiol. 69 (1), 320-326 (2003).
  51. Vaksmaa, A., Jetten, M. S., Ettwig, K. F., Luke, C. McrA primers for the detection and quantification of the anaerobic archaeal methanotroph 'Candidatus Methanoperedens nitroreducens'. Appl Microbiol Biotechnol. 101 (4), 1631-1641 (2017).
  52. Ren, G., et al. Electron acceptors for anaerobic oxidation of methane drive microbial community structure and diversity in mud volcanoes. Environ Microbiol. 20 (7), 2370-2385 (2018).
  53. Goldberg, C. S., et al. Critical considerations for the application of environmental DNA methods to detect aquatic species. Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1299-1307 (2016).
  54. McKee, A. M., Spear, S. F., Pierson, T. W. The effect of dilution and the use of a post-extraction nucleic acid purification column on the accuracy, precision, and inhibition of environmental DNA samples. Biological Conservation. 183, 70-76 (2015).
  55. Gohl, D. M., et al. Systematic improvement of amplicon marker gene methods for increased accuracy in microbiome studies. Nat Biotechnol. 34 (9), 942-949 (2016).
  56. Ballarini, A., Segata, N., Huttenhower, C., Jousson, O. Simultaneous quantification of multiple bacteria by the BactoChip microarray designed to target species-specific marker genes. PLOS ONE. 8 (2), e55764 (2013).
  57. Le Mer, J., Roger, P. Production, oxidation, emission and consumption of methane by soils: A review. Eur J Soil Biol. 37 (1), 25-50 (2001).
  58. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 67 (1), 6-20 (2009).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Metan D ng sK y Sulak AlanlarMetanojenlerMetanotroflarG ney Teksasklim De i ikli iGen TespitiBiyobelirteMcrAPmoA1PmoA2MmoXMekansal Da l mZamansal Da l mCBSArcGIS Pro

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır