金黄色葡萄球菌细胞内感染模型的开发与评价

摘要

金黄色葡萄球菌 （S. aureus） 具有向全身传播的能力，导致持续性和反复感染。为了更好地了解这些过程，本研究建立了 金黄色葡萄球菌的细胞内感染模型。该模型将为研究细胞内感染背后的机制提供重要基础。

摘要

金黄色葡萄球菌可以侵入并持续存在于宿主细胞（包括免疫细胞）中，这使得它能够逃避免疫检测和清除。这种细胞内持久性导致慢性和复发性感染，使治疗复杂化并延长疾病。因此，迫切需要细胞内感染模型来更好地了解、预防和治疗由金黄色葡萄球菌引起的感染。这项研究表明，抗生素有效地消除了细胞外细菌，但不能根除那些已经进入细胞的细菌。因此，通过感染金黄色葡萄球菌的 RAW264.7 并将其与抗生素共培养，在体外建立了稳定的细胞内感染。随后，通过注射含有细胞内感染的腹膜巨噬细胞建立了小鼠细胞内感染模型。万古霉素有效清除了浮游金黄色葡萄球菌攻击小鼠的细菌负荷;然而，它对感染腹膜巨噬细胞内细胞内细菌水平相同或较低水平的小鼠无效。这表明金黄色葡萄球菌的细胞内感染模型已成功建立，为预防和治疗细胞内感染提供了潜在的见解。

引言

金黄色 葡萄球菌是一种传染性很强的病原体，可引起一系列感染，包括皮肤和软组织感染、败血症、脑膜炎、肺炎和心内膜炎¹。抗生素的临床滥用导致 金黄色 葡萄球菌的耐药性增加，并出现了耐甲氧西林金 黄色葡萄球菌 （MRSA），这在许多国家/地区构成了重大的公共卫生威胁²。

虽然金黄色葡萄球菌传统上不被归类为细胞内病原体，但新出现的证据表明，它可以在侵袭后持续定植宿主细胞³。金黄色葡萄球菌在宿主吞噬细胞内存活的能力越来越被认为是一种促进转移性感染和在整个宿主中传播的机制 ^4,5,6。 金黄色葡萄球菌分泌各种毒力因子，这些毒力因子创造了一个免疫环境，促进其生存并使宿主完全消除它的能力复杂化⁷。辅助基因调节因子 （agr） 和葡萄球菌辅助元件 （Sae） 是两种重要的毒力调节因子，它们与金黄色葡萄球菌在吞噬细胞中的存活密切相关 ^8,9。agr 系统是一种群体感应机制，可调节金黄色葡萄球菌中多种毒力因子的表达。它控制毒素和其他促进细菌存活和传播的因素的产生。在细胞内感染期间，agr 系统在毒力因子的调节中起着关键作用，这些毒力因子对于细菌逃避宿主免疫反应并在宿主细胞内存活的能力至关重要。研究表明，agr 系统会影响细菌从吞噬体中逃逸并在巨噬细胞内持续存在的能力。agr 的缺失会导致宿主细胞内的细菌存活率降低和毒力降低^10,11。Sae 系统是一个双组分调节系统，控制金黄色葡萄球菌中几种毒力因子的表达。它参与毒素和酶的调节，这些毒素和酶有助于细菌侵入和破坏宿主组织的能力。Sae 系统在金黄色葡萄球菌的细胞内存活中也起着至关重要的作用。它影响细菌抵抗宿主吞噬细胞杀伤和逃避自噬降解的能力^12,13。

当病原体入侵时，巨噬细胞具有吞噬功能，可以吞噬和杀死外来病原体并激活适应性免疫反应¹⁴。大多数入侵细菌被巨噬细胞吞噬，然后巨噬细胞激活各种杀伤机制来消除它们。然而，一些金黄色葡萄球菌可以在巨噬细胞内存活，导致宿主持续感染。除了细菌蛋白外，宿主还通过分泌细胞因子来影响金黄色葡萄球菌在巨噬细胞内的存活和增殖 15,16,17。一些研究表明，金黄色葡萄球菌可以通过驻留在自噬体中来逃避降解，从而形成促进传播的细胞内生态位¹⁸。金黄色葡萄球菌通过阻断自噬通量（例如 LC3-II，p62）和在巨噬细胞侵袭后增加自噬溶酶体内的 pH 值来逃避自噬降解¹⁹。这种免疫逃避是通过调节金黄色葡萄球菌毒力因子和自噬来实现的，从而导致持续的隐性感染。

清除金黄色葡萄球菌的细胞内感染对于临床实践中管理持续性和潜伏性感染至关重要。目前，抗生素是金黄色葡萄球菌感染的主要治疗方法，万古霉素是 MRSA 感染的最后一道防线^20,21。然而，大量研究表明，现有的抗生素在体内和体外消除细胞内金黄色葡萄球菌方面无效 22,23,24。

目前没有针对金黄色葡萄球菌 25,26,27 的各种细胞内感染模型的统一标准，因为每个模型的条件差异很大。因此，不能使用相同的标准来评估这些模型的有效性。在本研究中，我们通过优化实验条件建立了金黄色葡萄球菌的通用细胞内感染模型。与其他模型相比，这种模型提供了更大的便利，因为它允许在体外将细菌最初感染到细胞中，然后将这些受感染的细胞输送到体内。

为了更好地了解细胞内 金黄色葡萄球菌 感染的机制并开发相关药物，我们建立了 体外 和 体内 模型。通过感染 RAW264.7 并将其与抗生素共培养，在 体外 成功构建了稳定的细胞内感染模型。然后，提取腹膜巨噬细胞并形成细胞内感染。通过注射这些腹膜巨噬细胞建立小鼠细胞内感染模型。

研究方案

实验动物，6-8 周龄无特异性病原体 （SPF） 雌性 BALB/c 小鼠，购自北京 HFK 生物科学有限公司（中国北京）。所有动物研究均经第三军医大学实验动物福利与伦理委员会批准，并按照机构和国家实验动物使用政策和指导方针进行。小鼠被饲养在 SPF 设施中并接种疫苗，并免费获得无菌食物和水。将动物随机分成几组，并在实验开始前至少 7 天让步适应时间。

1. 金黄色葡萄球菌的准备工作

1. 菌株回收：获得一管冷冻MRSA252，烧灼并冷却接种环，得到一环细菌溶液，通过条纹板法²⁸将细菌接种在胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）板上（参见材料表），并在37°C下培养过夜。
2. 细菌活化：第二天，取一个 50 mL 摇瓶，加入 20 mL 胰蛋白酶大豆肉汤 （TSB） 培养基（参见 材料表）。用 10 μL 移液器吸头挑取一个菌落，并将其添加到摇床中。将菌落在 220 rpm，37 °C 下孵育过夜。
3. 二次激活：第二天，取一个 50 mL 摇瓶，其中含有 15 mL TSB 培养基。从含有第一个活化细菌的摇床中取出 200 μL 细菌溶液，加入一个含有 20 mL TSB 培养基的新烧瓶中，并在 220 rpm、37 °C 下孵育 4 小时。
4. 将二次活化的细菌溶液收集在 50 mL 离心管中，以 3,000 x g 离心 10 分钟，然后弃去上清液。
5. 将沉淀的细菌重悬于 10 mL 盐水中，并以 3,000 x g 离心 10 分钟。重复此步骤 2 次。
6. 测量细菌溶液的 OD 600 值，并用生理盐水将其调整为 1.0。此时，本实验中 MRSA252 的细菌量为 1.0 x 10⁹ CFU/mL。
   注：将细菌溶液加入不含抗生素的培养基中，并稀释至所需浓度;本实验中使用的所有细菌均按上述方法制备。

2. 体外细胞内感染模型的建立

1. RAW264.7 细胞的制备
   注：本研究中使用的细胞系购自 ATCC。所有细胞系的支原体污染检测均呈阴性。所有实验均在对数生长期细胞上进行。
   1. 从液氮中取出细胞并在 37 °C 水浴中解冻。
   2. 将 RAW264.7 细胞放入 15 mL 离心管中，加入 2 mL Dulbecco 改良的 eagle 培养基（DMEM;参见 材料表），其中补充有 10% 胎牛血清（参见 材料表）、青霉素（100 单位/mL）和链霉素（100 μg/mL;参见 材料表;完全培养基），在 37 °C 下，5% CO₂。以 300 x g 离心 5 分钟。
   3. 用 10 mL 完全培养基在 100 mm 培养皿中接种 3 x 10⁶ 个 RAW264.7 细胞。在细胞培养箱中于37°C，在5%CO₂ 中保存12小时，使细胞的汇合度在50%-60%之间。
2. 体外 细胞内感染
   1. 取 10 μL 细胞悬液，将其添加到细胞计数器中以计算细胞浓度。在 24 孔板中计数和接种 2 x 10⁵ 个 RAW264.7 细胞（参见 材料表），每个孔使用 1 mL 完全培养基，并在细胞培养箱中保存 10-12 小时。
   2. 去除上清液，向每个孔中加入 1 mL 含有 2 x 10⁶ CFU 细菌溶液的完全培养基（步骤 1.6）。将其置于细胞培养箱中 2 小时。感染MRSA252 感染的多重性
      （MOI） 为 10。（为了验证各种感染复数 （MOI） 值与细胞吞噬细菌之间的相关性，我们建立了 MOI 值为 20、30、40 和 50 的实验组。
      注：感染细胞时使用的完全培养基不含青霉素和链霉素。
   3. 去除上清液并用 PBS 洗涤细胞 2 次（参见 材料表）。每孔加入 800 μL 含 100 μg/mL 庆大霉素的 DMEM（参见 材料表），并置于 37 °C 的 5% CO₂ 细胞培养箱中 2 小时。
3. 体外细胞内感染模型的评价
   1. 细胞内 金黄色葡萄球菌 杀伤试验
      1. 将 RAW264.7 细胞（步骤 2.2.2 和 2.2.3）分别收集到离心管中。用 PBS 洗涤细胞 2 次，向每个试管中加入 0.1% Triton X-100（参见 材料表）溶液 5 分钟，并将裂解物收集在离心管中。
      2. 使用 PBS 连续稀释裂解物。取 20 μL 裂解物，将其添加到含有 180 μL PBS 的微量离心管中，然后通过移液充分混合。按照此程序逐步稀释。将裂解物的每种稀释液点在 TSA 板上，并在 37 °C 下孵育过夜。 计数 TSA 平板上的菌落以获取裂解物（图 1A）。
         注意：此外，我们研究了腹膜巨噬细胞中 MRSA252 细胞内感染的最佳实验条件。用 MRSA252 感染并用不同浓度的庆大霉素处理的腹膜巨噬细胞中的细菌载量如图 1B 所示，而用 100 μg/mL 庆大霉素处理不同持续时间后的细菌载量如图 1C 所示。
      3. 如第 2.3.1.2 节所述，用 PBS 连续稀释上清液和裂解物，并观察 TSA 平板上上清液和裂解物的菌落（图 2A）。
   2. 共聚焦激光扫描显微镜 （CLSM）
      1. 在共聚焦培养皿上将 RAW264.7 细胞（步骤 2.2）稀释成 2 x 10⁵ 个细胞/mL（参见 材料表），并将它们置于细胞培养箱中，在 37 °C 的 5% CO₂ 中粘附过夜。向每个共聚焦培养皿中加入 1 mL 含有 2 x 10⁶ CFU 和 4 x 10⁶ 细菌溶液（步骤 1.6）的完全培养基，并将其置于细胞培养箱中 2 小时，分别得到 MOI 10 和 20。
      2. 去除上清液，用 PBS 洗涤细胞 3 次，加入 100 μg/mL 庆大霉素 DMEM 2 小时，并去除细胞外细菌。然后去除上清液，用PBS洗涤细胞2次，加入DIL工作流体（参见 材料表），并在37°C下避光孵育5分钟。
      3. 取出 DIL 工作流体，用 PBS 洗涤 3 次，并用 4% 多聚甲醛溶液固定（参见 材料表）固定 20 分钟。
      4. 去除多聚甲醛溶液并用 PBS 洗涤 3 次，加入 DAPI 染料（参见 材料表）并在黑暗中孵育 5 分钟。去除 DAPI 染料溶液并用 PBS 洗涤 5 次。使用 CLSM 观察细胞（图 2B）。
         注：这项工作使用了绿色荧光蛋白 （GFP） MRSA252，该蛋白是使用同源重组法构建的²⁹。

3. 体内 细胞内感染 模型的建立

1. 小鼠腹膜巨噬细胞的获取
   1. 准备 6% 的淀粉汤。根据质量比 3：10：5 （w/w），在玻璃容器中依次加入三种赋形剂（牛肉提取物粉、胰蛋白胨、氯化钠;见 材料表）。将 1 L ddH₂O 加入玻璃容器中，搅拌至融化，然后在微波炉中加热。加入质量比为 6 的淀粉可溶性（参见 材料表），搅拌至熔化，并确保在 121 °C 下高压灭菌玻璃容器 30 分钟。储存在 4 °C 的冰箱中，直到它变成糊状。
   2. 按照下面描述的步骤收集小鼠腹膜巨噬细胞。
      1. 选择两只 Balb/c 鼠标。用左手抓住鼠标的脖子并控制鼠标的尾巴。翻转鼠标，让头向下，腹部向上（图 3A）。腹膜内注射 6% 淀粉汤，每只小鼠 3 mL（图 3B）。
         注意：由于重力作用，腹腔内的器官会向后落到胸部，从而防止注射器伤害其他器官。
      2. 72 小时后，用 3% 异氟醚麻醉小鼠，然后通过颈椎脱位处死它们。用 75% 的乙醇消毒。使用眼剪刀切开小鼠的腹部，以完全暴露其腹膜（图 4A-C）。
      3. 将 10 mL DMEM 培养基注射到小鼠体内，通过腹膜内注射灌洗腹腔（图 4D）。将 DMEM 注射到小鼠腹腔后，轻轻摩擦小鼠腹部约 1 分钟，以更彻底地灌洗腹部。使用注射器将灌洗液收集到 50 mL 离心管中（图 4E）。
      4. 将灌洗液以 300 x g 离心 5 分钟，然后弃去上清液。
      5. 使用补充有 10% 胎牛血清、青霉素 （100 单位/mL） 和链霉素（100 μg/mL;完全培养基）的 10 mL DMEM 吹扫和抽吸收集的细胞，计数，将细胞浓度稀释至 2 x 10⁶/mL，然后铺在 6 孔板上（参见 材料表），每孔 1 mL。
      6. 将 6 孔板置于 37 °C 的 5% CO₂ 中，孵育 4 小时，然后去除上清液。用无菌 PBS 洗涤细胞 2 次，并在 37 °C 和 5% CO₂ 中用每孔 1 mL DMEM 培养过夜。
2. 细胞内细菌的制备
   1. 将腹膜巨噬细胞（步骤 3.1.2）与 MRSA252 孵育 2 小时。去除上清液并用 PBS 洗涤细胞 2 次。加入含 100 μg/mL 庆大霉素（每孔 1 mL）的 DMEM 完全培养基，并在 37 °C 下在 5% CO₂ 中孵育 2 小时。
   2. 去除上清液，用 PBS 洗涤细胞 3 次。使用细胞刮刀将小鼠腹膜巨噬细胞收集在 50 mL 离心管中，以 300 x g 离心 5 分钟。在腹膜巨噬细胞中成功制备了 MRSA252 的细胞内细菌。
   3. 为了计算细胞内细菌，向细胞内MRSA252感染的腹膜巨噬细胞中加入溶菌酶（10 μg/mL，参见 材料表）在 37 °C 下 10 分钟，然后用 PBS 2x 洗涤。然后，加入 1 mL PBS 以重悬细胞。通过添加 0.1% Triton X-100 裂解细胞 5 分钟。
   4. 用系列稀释液稀释裂解液，然后将其滴到 TSA 板上。在 37 °C 下培养过夜。 通过计数细菌菌落，计算腹膜巨噬细胞中MRSA252的细胞内细菌，每只小鼠为 1.8 x 10⁶ CFU。
      注意：当细胞刮刀收集细胞时，动作应轻柔。细胞沿一个方向刮下以避免细胞破裂，这可能会影响后续实验。
3. 小鼠细胞内细菌感染
   1. 将 20 只 Balb/c 小鼠随机分成四组（n=5， 图 5A）。
   2. 对于第 I 组，通过静脉注射每只小鼠注射 3 x 10⁶ CFU 浮游 MRSA252。对于第 II 组，通过静脉注射每只小鼠注射 3 x 10⁶ CFU 浮游MRSA252和万古霉素（110 mg/kg;参见 材料表）。对于第 III 组，通过静脉注射注射细胞内细菌（在步骤 3.2 中制备）。对于第 IV 组，通过静脉注射每只小鼠注射细胞内细菌（在步骤 3.2 中制备）和万古霉素（110 mg/kg）。
   3. 将小鼠置于红外理疗灯下，直到它们的尾静脉扩张。
   4. I 组和 II 组每只小鼠静脉注射 3 x 10⁶ CFU 浮游MRSA252。静脉注射 III 组和 IV 组的每只小鼠的细胞内细菌（在步骤 3.2 中制备）。
      注：使用注射器收集含有细胞内细菌的液体时，建议先用移液管轻轻混合液体，以确保所有小鼠的感染水平一致。
   5. 30 分钟后，每只小鼠静脉注射万古霉素至 II 组和 IV 组。
4. 体内细胞内感染模型的评价
   1. 通过计数细菌在肾脏中的定植来评估小鼠的细胞内感染模型。注射 24 小时后，用 3% 异氟醚麻醉小鼠并通过宫颈脱位处死它们。用 75% 乙醇消毒。
   2. 固定小鼠，一只手用镊子提起腹部皮肤，另一只手用眼剪刀剪开小鼠腹部皮肤，在腹腔找到肾脏，将肾脏完全剥离。把它们放在 PBS 中。
   3. 向组织研磨管中加入 1 mL PBS。将每只小鼠的肾脏转移到单独的研磨管中并研磨，直到没有固体组织残留。将匀浆组织倒入单独的 EP 管中，并用相应的小鼠标识标记每个管。
   4. 使用 PBS 连续稀释组织匀浆。将每种稀释液点到单独的 TSA 板上，并在 37 °C 下孵育过夜。 计数菌落并分析数据（图 5B）。

结果

金黄色葡萄球菌的细胞内感染模型在体外和体内均成功建立。通过优化吞噬作用的实验条件并延长抗生素治疗的浓度和持续时间，一些金黄色葡萄球菌在巨噬细胞中存活（图 1）。为了进一步评估金黄色葡萄球菌的抗生素耐药性，用抗生素处理感染MRSA252的巨噬细胞 2 小时，直到细胞上清液不...

讨论

金黄色葡萄球菌作为一种兼性细胞内病原体，可以侵入并在各种细胞类型中存活，利用这种能力在感染期间逃避抗生素和免疫反应³⁰。本研究建立了 金黄色葡萄球菌体内 细胞内感染模型，为研究病原体的细胞内感染机制提供基础。通过探索各种 MOI 值对 金黄色葡萄球菌巨噬细胞吞噬作用的影响，以及不同抗生素浓度和治疗持续时间?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plate	Corning Incorporated, USA	3524
4 % paraformaldehyde solutione	BBI, UK	E672002-0500
6-well plate	Corning Incorporated, USA	3516
Beef extract powder	BBI, UK	A600114-0500
Biohazard safety equipment	Heal force, China	VS-1300L-u
Cell incubator	ESCO, Singapore	CCL-170B-8
Cell scraper	Nest	710001
Centrifuge M1416R	RWD, China	M1416R
Centrifuge tube	Guanghou Labselect, China	CT-002-50A
Confocal laser scanning microscope (CLSM)	Zeiss, Germany	880
Confocal petri dish	Biosharp, China	BS-20-GJM
DAPI dye	Shanghai Beyotime, China	C1006
DIL working fluid	Shanghai Beyotime, China	C1991S
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Thermo Gibco, USA	C11995500BT
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SV30208.02
Gentamycin	Shanghai Sangon, China	B540724-0010
Incubator	Shanghai Hengzi, China	HDPF-150
Lysozyme	Beijing Solarbio, China	L9070
MRSA252	Third Military Medical University, China	null
MRSA252(GPF)	Third Military Medical University, China	null
Penicillin and Streptomycin	Shanghai Beyotime, China	C0222
Phosphate Buffer Solution	Shanghai Beyotime, China	ST476
Saline	Sichuan Kelun, China	null
Sodium chloride	Shanghai Macklin, China	S805275
Starch soluble	Shanghai Sangon, China	A500904-0500
Triton X-100	Shanghai Beyotime, China	P0096-100ml
Tryptic Soy Agar (TSA) plates	Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China	02-130
Tryptic Soy Broth (TSB) medium	Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China	02-102K
Tryptone	OXOID, UK	LP0042B
Vancomycin	Shanghai Beyotime, China	ST2807-250mg
RAW264.7 cell	USA, ATCC	null