Sviluppo e valutazione di modelli di infezione intracellulare per Staphylococcus aureus

Riepilogo

Lo Staphylococcus aureus (S. aureus) ha la capacità di diffondersi in tutto il corpo, causando infezioni persistenti e ricorrenti. Per comprendere meglio questi processi, questo studio stabilisce un modello di infezione intracellulare per S. aureus. Questo modello fornirà una base cruciale per studiare i meccanismi alla base delle infezioni intracellulari.

Abstract

S. aureus può invadere e persistere all'interno delle cellule ospiti, comprese le cellule immunitarie, il che gli consente di eludere il rilevamento e l'eliminazione immunitaria. Questa persistenza intracellulare contribuisce alle infezioni croniche e ricorrenti, complicando il trattamento e prolungando la malattia. Di conseguenza, c'è un bisogno critico di un modello di infezione intracellulare per comprendere, prevenire e trattare meglio le infezioni causate da S. aureus. Questo studio ha indicato che gli antibiotici eliminano efficacemente i batteri extracellulari ma non riescono a sradicare quelli che sono entrati nelle cellule. Pertanto, RAW264.7 ha infettato con S. aureus un'infezione intracellulare stabile in vitro e li ha co-coltivati con antibiotici. Successivamente, è stato stabilito un modello di infezione intracellulare nei topi iniettando macrofagi peritoneali contenenti l'infezione intracellulare. La vancomicina ha eliminato efficacemente le cariche batteriche nei topi sfidati con S. aureus planctonico; Tuttavia, è risultato inefficace contro i topi infettati con livelli uguali o inferiori di batteri intracellulari all'interno dei macrofagi peritoneali. Ciò indica che il modello di infezione intracellulare di S. aureus è stato stabilito con successo, offrendo potenziali intuizioni per la prevenzione e il trattamento delle infezioni intracellulari.

Introduzione

S. aureus è un agente patogeno altamente contagioso che può causare una serie di infezioni, tra cui infezioni della pelle e dei tessuti molli, sepsi, meningite, polmonite ed endocardite¹. L'uso clinico improprio di antibiotici ha portato a un aumento della resistenza in S. aureus e all'emergere di Staphylococcus aureus resistente alla meticillina (MRSA), che rappresenta una significativa minaccia per la salute pubblica in molti paesi².

Sebbene S. aureus non sia tradizionalmente classificato come patogeno intracellulare, prove emergenti suggeriscono che può colonizzare in modo persistente le cellule ospiti dopo l'invasione³. La capacità di S. aureus di sopravvivere intracellulare all'interno dei fagociti dell'ospite è sempre più riconosciuta come un meccanismo che facilita l'infezione metastatica e la disseminazione in tutto l'ospite ^4,5,6. S. aureus secerne vari fattori di virulenza, che creano un ambiente immunitario che ne favorisce la sopravvivenza e complica la capacità dell'ospite di eliminarlo completamente⁷. Il regolatore genico accessorio (agr) e gli elementi helper dello stafilococco (Sae) sono due importanti regolatori di virulenza strettamente correlati alla sopravvivenza dello Staphylococcus aureus nei fagociti ^8,9. Il sistema agr è un meccanismo di quorum-sensing che regola l'espressione di numerosi fattori di virulenza in S. aureus. Controlla la produzione di tossine e altri fattori che facilitano la sopravvivenza e la diffusione batterica. Durante l'infezione intracellulare, il sistema agr svolge un ruolo critico nella regolazione dei fattori di virulenza che sono essenziali per la capacità del batterio di eludere le risposte immunitarie dell'ospite e sopravvivere all'interno delle cellule ospiti. Gli studi hanno dimostrato che il sistema agr influenza la capacità del batterio di sfuggire ai fagosomi e persistere all'interno dei macrofagi. L'assenza di agr può portare a una ridotta sopravvivenza batterica all'interno delle cellule ospiti e a una diminuzione della virulenza^10,11. Il sistema Sae è un sistema regolatorio a due componenti che controlla l'espressione di diversi fattori di virulenza in S. aureus. È coinvolto nella regolazione delle tossine e degli enzimi che contribuiscono alla capacità del batterio di invadere e danneggiare i tessuti ospiti. Il sistema Sae svolge anche un ruolo cruciale nella sopravvivenza intracellulare di S. aureus. Influenza la capacità del batterio di resistere all'uccisione da parte dei fagociti ospiti e di eludere la degradazione autofagica^12,13.

Quando i patogeni invadono, i macrofagi hanno funzioni fagocitarie, che possono inghiottire e uccidere i patogeni estranei e attivare la risposta immunitaria adattativa¹⁴. La maggior parte dei batteri invasori viene fagocitata dai macrofagi, che quindi attivano vari meccanismi di uccisione per eliminarli. Tuttavia, alcuni batteri S. aureus possono sopravvivere all'interno dei macrofagi, portando a un'infezione persistente dell'ospite. Oltre alle proteine batteriche, l'ospite influisce anche sulla sopravvivenza e sulla proliferazione di S. aureus all'interno dei macrofagi secernendo citochine 15,16,17. Alcuni studi indicano che S. aureus può eludere la degradazione risiedendo negli autofagosomi, creando una nicchia intracellulare che promuove la disseminazione¹⁸. S. aureus sfugge alla degradazione autofagica bloccando il flusso autofagico (ad esempio, LC3-II, p62) e aumentando il pH all'interno degli autolisosomi dopo l'invasione dei macrofagi¹⁹. Questa evasione immunitaria si ottiene attraverso la regolazione dei fattori di virulenza e dell'autofagia di S. aureus, portando a infezioni persistenti e nascoste.

L'eliminazione delle infezioni intracellulari di S. aureus è fondamentale per la gestione delle infezioni persistenti e latenti nella pratica clinica. Attualmente, gli antibiotici sono il trattamento principale per le infezioni da S. aureus, con la vancomicina che funge da ultima linea di difesa per le infezioni da MRSA^20,21. Tuttavia, numerosi studi hanno dimostrato che gli antibiotici esistenti sono inefficaci nell'eliminare S. aureus intracellulare, sia in vivo che in vitro 22,23,24.

Attualmente non esiste uno standard unificato per i vari modelli di infezione intracellulare di S. aureus 25,26,27, poiché le condizioni di ciascun modello differiscono in modo significativo. Di conseguenza, gli stessi criteri non possono essere applicati per valutare l'efficacia di tali modelli. In questo studio, abbiamo stabilito un modello di infezione intracellulare universale di Staphylococcus aureus ottimizzando le condizioni sperimentali. Questo modello offre una maggiore comodità rispetto ad altri, in quanto consente l'infezione iniziale dei batteri in cellule in vitro, seguita dalla consegna di queste cellule infette nel corpo.

Per comprendere meglio i meccanismi dell'infezione intracellulare da S. aureus e sviluppare farmaci correlati, abbiamo stabilito modelli sia in vitro che in vivo . Un modello stabile di infezione intracellulare è stato creato con successo in vitro infettando RAW264.7 e co-coltivandolo con antibiotici. Quindi, i macrofagi peritoneali sono stati estratti e formati in infezioni intracellulari. Un modello di infezione intracellulare nei topi è stato stabilito iniettando questi macrofagi peritoneali.

Protocollo

Gli animali da esperimento, topi femmina BALB/c di 6-8 settimane privi di patogeni specifici (SPF), sono stati acquistati dalla Beijing HFK Bioscience Co., Ltd (Pechino, Cina). Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato per il Benessere e l'Etica degli Animali da Laboratorio della Terza Università Medica Militare e sono stati eseguiti in conformità con le politiche e le linee guida istituzionali e nazionali per l'uso degli animali da laboratorio. I topi sono stati tenuti e vaccinati in strutture SPF e hanno avuto libero accesso a cibo e acqua sterili. Gli animali sono stati divisi in modo casuale in gruppi e hanno avuto un tempo di adattamento di almeno 7 giorni prima dell'inizio degli esperimenti.

1. Preparazione per S. aureus

1. Recupero del ceppo: Procurarsi una provetta di MRSA252 congelata, cauterizzare e raffreddare l'anello di inoculazione per ottenere un anello di soluzione batterica, inoculare i batteri su piastre di Tryptic Soy Agar (TSA) (vedi Tabella dei materiali) con il metodo²⁸ della piastra di striatura e coltura per una notte a 37 °C.
2. Attivazione batterica: il giorno successivo, prendere un pallone shaker da 50 ml e aggiungere 20 ml di terreno di brodo di soia triptico (TSB) (vedi Tabella dei materiali). Prelevare una singola colonia con un puntale per pipetta da 10 μl e aggiungerla allo shaker. Incubare le colonie durante la notte a 220 giri/min, 37 °C.
3. Attivazione secondaria: il giorno successivo, assumere un pallone shaker da 50 ml contenente 15 ml di terreno TSB. Rimuovere 200 μL di soluzione batterica dall'agitatore contenente i primi batteri attivati, aggiungerli all'unico nuovo pallone contenente 20 mL di terreno TSB e incubare a 220 giri/min, 37 °C per 4 ore.
4. Raccogliere la soluzione batterica attivata secondaria in una provetta da centrifuga da 50 mL, centrifugare a 3.000 x g per 10 minuti ed eliminare il surnatante.
5. Risospendere i batteri precipitati in 10 mL di soluzione fisiologica e centrifugare a 3.000 x g per 10 min. Ripetere questo passaggio 2 volte.
6. Misurare il valore OD600 della soluzione batterica e regolarlo a 1,0 con soluzione fisiologica. A quel tempo, la quantità batterica di MRSA252 in questo esperimento era di 1,0 x 10⁹ CFU/mL.
   NOTA: La soluzione batterica viene aggiunta a un terreno privo di antibiotici e diluita alla concentrazione desiderata; Tutti i batteri utilizzati in questo esperimento sono stati preparati con il metodo di cui sopra.

2. Definizione di un modello di infezione intracellulare in vitro

1. Preparazione delle celle RAW264.7
   NOTA: Le linee cellulari utilizzate in questo studio sono state ottenute da ATCC. Tutte le linee cellulari sono risultate negative per la contaminazione da micoplasma. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti su cellule in fase di crescita logaritmica.
   1. Togliere le cellule dall'azoto liquido e scongelarle a bagnomaria a 37 °C.
   2. Mettere le cellule RAW264.7 in una provetta da centrifuga da 15 mL, aggiungere 2 mL di terreno eagle modificato di Dulbecco (DMEM; vedere Tabella dei materiali) integrato con il 10% di siero fetale bovino (vedere Tabella dei materiali), penicillina (100 unità/mL) e streptomicina (100 μg/mL; vedere Tabella dei materiali; terreno completo) a 37 °C in CO_{2 al} 5%. Centrifugare a 300 x g per 5 min.
   3. Seminare 3 x 10⁶ cellule RAW264.7 in piastre da 100 mm con 10 mL di terreno completo. Conservare per 12 ore in un incubatore per colture cellulari a 37 °C in CO₂ al 5% in modo che la confluenza delle cellule sia compresa tra il 50% e il 60%.
2. Infezione intracellulare in vitro
   1. Prelevare 10 μl di sospensione cellulare e aggiungerla al contatore di cellule per calcolare la concentrazione cellulare. Contare e seminare 2 x 10⁵ cellule RAW264.7 in una piastra da 24 pozzetti (vedere la Tabella dei materiali) utilizzando 1 mL di terreno completo per ogni pozzetto e conservarlo in un incubatore per colture cellulari per 10-12 ore.
   2. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 mL di terreno completo contenente 2 x 10⁶ CFU di soluzione batterica (fase 1.6) in ciascun pozzetto. Metterlo nell'incubatore per colture cellulari per 2 ore. La molteplicità di infezioni MRSA252 infette
      (MOI) è 10. (Per verificare la correlazione tra i vari valori di molteplicità di infezione (MOI) e la fagocitosi dei batteri da parte delle cellule, abbiamo stabilito gruppi sperimentali con valori MOI di 20, 30, 40 e 50.).
      NOTA: Il mezzo completo utilizzato per infettare le cellule non contiene penicillina e streptomicina.
   3. Rimuovere il surnatante e lavare le celle 2 volte con PBS (vedere la tabella dei materiali). Aggiungere 800 μL per pozzetto di DMEM con 100 μg/mL di gentamicina (vedere la Tabella dei materiali) e porre nell'incubatore cellulare a 37 °C in CO₂ al 5% per 2 ore.
3. Valutazione di un modello di infezione intracellulare in vitro
   1. Saggio intracellulare di uccisione di S. aureus
      1. Raccogliere le celle RAW264.7 (passaggi 2.2.2 e 2.2.3) separatamente in provette da centrifuga. Lavare le cellule 2 volte con PBS, aggiungere la soluzione di Triton X-100 allo 0,1% (vedere Tabella dei materiali) in ciascuna provetta per 5 minuti e raccogliere il lisato nelle provette da centrifuga.
      2. Usa PBS per diluire il lisato in serie. Prelevare 20 μl di lisato e aggiungerli a una provetta da microcentrifuga contenente 180 μl di PBS, quindi miscelare accuratamente mediante pipettaggio. Diluire passo dopo passo seguendo questa procedura. Individuare ogni diluizione del lisato sulle piastre TSA e incubare per una notte a 37 °C. Contare le colonie sulle piastre TSA per il lisato (Figura 1A).
         NOTA: Inoltre, abbiamo studiato le condizioni sperimentali ottimali per l'infezione intracellulare di MRSA252 nei macrofagi peritoneali. La carica batterica nei macrofagi peritoneali infettati con MRSA252 e trattati con concentrazioni variabili di gentamicina è mostrata nella Figura 1B, mentre la carica batterica dopo il trattamento con 100 μg/mL di gentamicina per durate diverse è mostrata nella Figura 1C.
      3. Diluire il surnatante e lisato in serie con PBS come descritto nella sezione 2.3.1.2 e osservare le colonie sulle piastre TSA per il surnatante e il lisato (Figura 2A).
   2. Microscopio confocale a scansione laser (CLSM)
      1. Diluire le cellule RAW264.7 (fase 2.2) in 2 x 10⁵ cellule/mL su una piastra di Petri confocale (vedere la Tabella dei materiali) e porle in un incubatore cellulare per l'adesione per una notte a 37 °C in CO₂ al 5%. Aggiungere 1 mL di terreno completo contenente 2 x 10⁶ CFU e 4 x 10⁶ soluzione batterica (fase 1.6) a ciascuna capsula di Petri confocale e metterla nell'incubatore cellulare per 2 ore, rendendo il MOI rispettivamente 10 e 20.
      2. Rimuovere il surnatante e lavare le cellule 3 volte con PBS, aggiungere 100 μg/mL di gentamicina DMEM per 2 ore e rimuovere i batteri extracellulari. Quindi rimuovere il surnatante e lavare le celle 2 volte con PBS, aggiungere il fluido di lavoro DIL (vedere la Tabella dei materiali) e incubare a 37 °C per 5 minuti al buio.
      3. Rimuovere il fluido di lavoro DIL e lavare 3 volte con PBS e fissare con una soluzione di paraformaldeide al 4% (vedi Tabella dei materiali) per 20 minuti.
      4. Rimuovere la soluzione di paraformaldeide e lavare 3 volte con PBS, aggiungere il colorante DAPI (vedi Tabella dei materiali) e incubare per 5 minuti al buio. Rimuovere la soluzione colorante DAPI e lavare 5 volte con PBS. Utilizzare CLSM per osservare le celle (Figura 2B).
         NOTA: Questo lavoro utilizzato MRSA252 ingegnerizzato con una proteina fluorescente verde (GFP), che è stata costruita utilizzando il metodo di ricombinazione omologa²⁹.

3. Definizione di un modello di infezione intracellulare in vivo

1. Acquisizione di macrofagi peritoneali nei topi
   1. Preparare il brodo di amido al 6%. In base al rapporto di massa 3:10:5 (p/p), aggiungere tre tipi di eccipienti (estratto di manzo in polvere, triptone, cloruro di sodio; vedi Tabella dei materiali) in successione nel contenitore di vetro. Aggiungere 1 L di ddH₂O in un contenitore di vetro, mescolare per farlo sciogliere e scaldare nel microonde. Aggiungere l'amido solubile (vedi Tabella dei materiali) con un rapporto di massa di 6, mescolare per sciogliere e assicurarsi di sterilizzare in autoclave il contenitore di vetro a 121 °C per 30 minuti. Conservare in frigorifero a 4 °C fino a quando non diventa una pasta.
   2. Raccogliere i macrofagi peritoneali di topo seguendo i passaggi descritti di seguito.
      1. Scegli due mouse Balb/c. Usa la mano sinistra per afferrare il collo del mouse e controllare la coda. Capovolgi il mouse e abbassa la testa e alza l'addome (Figura 3A). Somministrare un'iniezione intraperitoneale di brodo di amido al 6%, 3 ml per topo (Figura 3B).
         NOTA: A causa della gravità, gli organi nella cavità addominale cadranno all'indietro verso il torace, impedendo alla siringa di ferire altri organi.
      2. Dopo 72 ore, anestetizzare i topi con isoflurano al 3% e poi sacrificarli per lussazione cervicale. Disinfettarli con alcool etilico al 75%. Utilizzare una forbice oftalmica per aprire l'addome del topo per esporre completamente il suo peritoneo (Figura 4A-C).
      3. Iniettare 10 mL di terreno DMEM nei topi per lavare la cavità addominale mediante iniezione intraperitoneale (Figura 4D). Dopo aver iniettato il DMEM nella cavità addominale dei topi, strofinare delicatamente l'addome dei topi per circa 1 minuto per lavare l'addome più a fondo. Utilizzare una siringa per raccogliere il liquido di lavaggio in una provetta da centrifuga da 50 ml (Figura 4E).
      4. Centrifugare il liquido di lavaggio a 300 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
      5. Utilizzare 10 ml di DMEM integrati con il 10% di siero fetale bovino, penicillina (100 unità/mL) e streptomicina (100 μg/mL; terreno completo) per soffiare e aspirare le cellule raccolte, contarle e diluire la concentrazione cellulare a 2 x 10⁶/mL e plank su piastre a 6 pozzetti (vedere la Tabella dei materiali), 1 mL per pozzetto.
      6. Posizionare la piastra a 6 pozzetti a 37 °C in CO₂ al 5%, incubare per 4 ore e quindi rimuovere il surnatante. Lavare le cellule 2 volte con PBS sterile e colturarle per una notte con 1 mL di DMEM per pozzetto a 37 °C in CO₂ al 5%.
2. Preparazione di batteri intracellulari
   1. Incubare i macrofagi peritoneali (passaggio 3.1.2) con MRSA252 per 2 ore. Rimuovere il surnatante e lavare le celle 2 volte con PBS. Aggiungere DMEM terreno completo con 100 μg/mL di gentamicina (1 mL per pozzetto) e incubare per 2 ore a 37 °C in CO₂ al 5%.
   2. Rimuovere il surnatante e lavare le celle 3 volte con PBS. Utilizzare un raschietto cellulare per raccogliere i macrofagi peritoneali di topo in provette da centrifuga da 50 mL, centrifugare a 300 x g per 5 minuti. I batteri intracellulari di MRSA252 sono stati preparati con successo nei macrofagi peritoneali.
   3. Per il calcolo dei batteri intracellulari, ai macrofagi peritoneali infettati da MRSA252 intracellulari, aggiungere lisozima (10 μg/mL, vedi Tabella dei Materiali) a 37 °C per 10 min e quindi lavare con PBS 2x. Quindi, aggiungere 1 ml di PBS per risospendere le cellule. Liare le cellule aggiungendo lo 0,1% di Triton X-100 per 5 minuti.
   4. Diluire la lisi con diluizioni in serie e farla cadere su una piastra TSA. Coltura notturna a 37 °C. Calcolare i batteri intracellulari di MRSA252 nei macrofagi peritoneali, che erano 1,8 x 10⁶ CFU per topo, contando le colonie batteriche.
      NOTA: Quando il raschietto per celle raccoglie le cellule, l'azione deve essere delicata. Le cellule vengono raschiate in una direzione per evitare la rottura delle cellule, che potrebbe influire sull'esperimento successivo.
3. Infezione batterica intracellulare nei topi
   1. Dividi casualmente 20 topi Balb/c in quattro gruppi (n=5, Figura 5A).
   2. Per il Gruppo I, iniettare 3 x 10⁶ CFU di MRSA252 planctonico per topo mediante iniezione endovenosa. Per il Gruppo II, iniettare 3 x 10⁶ CFU di MRSA252 planctonica e vancomicina (110 mg/kg; vedere Tabella dei materiali) per topo mediante iniezione endovenosa. Per il Gruppo III, iniettare i batteri intracellulari (preparati al punto 3.2) mediante iniezione endovenosa. Per il Gruppo IV, iniettare i batteri intracellulari (preparati al punto 3.2) e la vancomicina (110 mg/kg) per topo mediante iniezione endovenosa.
   3. Posiziona i topi sotto la lampada fisioterapica a infrarossi fino a quando le vene della coda non si dilatano.
   4. Iniettare per via endovenosa 3 x 10⁶ CFU MRSA252 planctonico per topo del Gruppo I e del Gruppo II. Iniettare per via endovenosa i batteri intracellulari (preparati al punto 3.2) per topo del Gruppo III e del Gruppo IV.
      NOTA: Quando si utilizza una siringa per raccogliere un liquido contenente batteri intracellulari, si consiglia di mescolare delicatamente il liquido in modo uniforme con una pipetta per garantire livelli di infezione costanti in tutti i topi.
   5. Dopo 30 minuti, iniettare per via endovenosa la vancomicina al Gruppo II e al Gruppo IV per topo.
4. Valutazione di un modello di infezione intracellulare in vivo
   1. Valutare il modello di infezione intracellulare dei topi contando la colonizzazione dei batteri nei reni. Dopo 24 ore di iniezione, anestetizzare i topi con isoflurano al 3% e sacrificarli per lussazione cervicale. Disinfettarli in alcool etilico al 75%.
   2. Immobilizzare i topi, sollevare la pelle addominale con una pinzetta con una mano, tagliare la pelle addominale del topo con le forbici oftalmiche con l'altra mano, trovare i reni nella cavità addominale e spogliare completamente i reni. Mettili in PBS.
   3. Aggiungere 1 mL di PBS alla provetta per la macinazione dei tessuti. Trasferire i reni di ciascun topo in tubi di macinazione separati e macinare fino a quando non rimane tessuto solido. Versare il tessuto omogeneizzato nelle singole provette EP ed etichettare ciascuna provetta con la corrispondente identificazione del topo.
   4. Utilizzare PBS per diluire in serie l'omogeneizzato tissutale. Individuare ogni diluizione su piastre TSA separate e incubare per una notte a 37 °C. Contare le colonie e analizzare i dati (Figura 5B).

Risultati

I modelli di infezione intracellulare di S. aureus sono stati stabiliti con successo sia in vitro che in vivo. Ottimizzando le condizioni sperimentali per la fagocitosi ed estendendo sia la concentrazione che la durata del trattamento antibiotico, alcuni S. aureus sono sopravvissuti all'interno dei macrofagi (Figura 1). Per valutare ulteriormente la resistenza agli antibiotici di S. aur...

Discussione

S. aureus, come patogeno intracellulare facoltativo, può invadere e sopravvivere in vari tipi di cellule, utilizzando questa capacità di eludere gli antibiotici e le risposte immunitarie durante l'infezione³⁰. Questo studio ha stabilito un modello di infezione intracellulare di S. aureus in vivo per fornire una base per lo studio dei meccanismi di infezione intracellulare del patogeno. Esplorando l'impatto di vari valori di MOI sulla fagocitosi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plate	Corning Incorporated, USA	3524
4 % paraformaldehyde solutione	BBI, UK	E672002-0500
6-well plate	Corning Incorporated, USA	3516
Beef extract powder	BBI, UK	A600114-0500
Biohazard safety equipment	Heal force, China	VS-1300L-u
Cell incubator	ESCO, Singapore	CCL-170B-8
Cell scraper	Nest	710001
Centrifuge M1416R	RWD, China	M1416R
Centrifuge tube	Guanghou Labselect, China	CT-002-50A
Confocal laser scanning microscope (CLSM)	Zeiss, Germany	880
Confocal petri dish	Biosharp, China	BS-20-GJM
DAPI dye	Shanghai Beyotime, China	C1006
DIL working fluid	Shanghai Beyotime, China	C1991S
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Thermo Gibco, USA	C11995500BT
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SV30208.02
Gentamycin	Shanghai Sangon, China	B540724-0010
Incubator	Shanghai Hengzi, China	HDPF-150
Lysozyme	Beijing Solarbio, China	L9070
MRSA252	Third Military Medical University, China	null
MRSA252(GPF)	Third Military Medical University, China	null
Penicillin and Streptomycin	Shanghai Beyotime, China	C0222
Phosphate Buffer Solution	Shanghai Beyotime, China	ST476
Saline	Sichuan Kelun, China	null
Sodium chloride	Shanghai Macklin, China	S805275
Starch soluble	Shanghai Sangon, China	A500904-0500
Triton X-100	Shanghai Beyotime, China	P0096-100ml
Tryptic Soy Agar (TSA) plates	Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China	02-130
Tryptic Soy Broth (TSB) medium	Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China	02-102K
Tryptone	OXOID, UK	LP0042B
Vancomycin	Shanghai Beyotime, China	ST2807-250mg
RAW264.7 cell	USA, ATCC	null