황색포도상구균에 대한 세포 내 감염 모델의 개발 및 평가

요약

황색포도상구균 (S. aureus)은 몸 전체로 퍼질 수 있는 능력이 있어 지속적이고 재발성 감염을 일으킵니다. 이러한 과정을 더 잘 이해하기 위해 이 연구는 S. aureus에 대한 세포 내 감염 모델을 확립합니다. 이 모델은 세포 내 감염의 기전을 조사하는 데 중요한 토대를 제공할 것입니다.

초록

S. aureus는 면역 세포를 포함한 숙주 세포에 침입하여 잔존할 수 있으며, 이를 통해 면역 탐지 및 제거를 회피할 수 있습니다. 이러한 세포 내 지속성은 만성 및 재발성 감염에 기여하여 치료를 복잡하게 만들고 질병을 연장시킵니다. 따라서 황색포도상구균(S. aureus)에 의한 감염을 더 잘 이해하고, 예방하고, 치료하기 위한 세포 내 감염 모델이 매우 필요합니다. 이 연구는 항생제가 세포외 박테리아를 효과적으로 제거하지만 세포에 침투한 박테리아를 박멸할 수는 없다는 것을 보여주었습니다. 따라서, 황색포도상구균(S. aureus)에 감염된 RAW264.7을 항생제와 함께 배양함으로써 안정적인 체외 세포 내 감염이 확립되었습니다. 그 후, 세포 내 감염을 포함하는 복막 대식세포를 주입하여 마우스에서 세포 내 감염 모델을 확립했습니다. Vancomycin은 플랑크톤 S. aureus에 감염된 쥐의 박테리아 부하를 효과적으로 제거했습니다. 그러나 복막 대식세포 내에서 동일하거나 더 낮은 수준의 세포 내 박테리아에 감염된 마우스에는 효과가 없었습니다. 이는 S. aureus의 세포 내 감염 모델이 성공적으로 확립되었음을 나타내며, 세포 내 감염의 예방 및 치료에 대한 잠재적인 통찰력을 제공합니다.

서문

S. aureus 는 피부 및 연조직 감염, 패혈증, 뇌수막염, 폐렴 및 심내막염¹을 포함한 다양한 감염을 유발할 수 있는 전염성이 매우 높은 병원체입니다. 항생제의 임상적 오용으로 인해 황색포도상구 균의 내성이 증가하고 메티실린 내성 황색포도상구균 (MRSA)이 출현하여 많은 국가에서 심각한 공중 보건 위협을 초래하고 있습니다².

S. aureus는 전통적으로 세포 내 병원체로 분류되지 않지만, 새로운 증거에 따르면 침입 후 숙주 세포에 지속적으로 군집할 수 있습니다³. S. aureus가 숙주 식세포 내에서 세포 내에서 생존할 수 있는 능력은 전이성 감염 및 숙주 전체의 전파를 촉진하는 메커니즘으로 점점 더 인식되고 있습니다 ^4,5,6. 황색포도상구균은 다양한 독성 인자를 분비하는데, 이는 생존을 촉진하는 면역 환경을 조성하고 숙주가 이 바이러스를 완전히 제거하는 능력을 복잡하게 만든다⁷. 부속 유전자 조절인자(accessory gene regulator, agr)와 포도상구균 보조 요소(Staphylococcal helper elements, Sae)는 식세포에서 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 생존과 밀접한 관련이 있는 두 가지 중요한 독성 조절인자입니다 ^8,9. agr 시스템은 S. aureus에서 수많은 독성 인자의 발현을 조절하는 정족수 감지 메커니즘입니다. 그것은 독소 및 박테리아의 생존과 전파를 촉진하는 다른 요인의 생성을 통제합니다. 세포 내 감염 동안 agr 시스템은 박테리아가 숙주 면역 반응을 회피하고 숙주 세포 내에서 생존하는 능력에 필수적인 독성 인자를 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 연구에 따르면 agr 시스템은 박테리아가 식체에서 탈출하여 대식세포 내에서 잔류하는 능력에 영향을 미칩니다. agr이 없으면 숙주 세포 내 세균 생존율이 감소하고 독성이 감소할 수 있습니다 ^10,11. Sae 시스템은 S. aureus에서 여러 독성 인자의 발현을 제어하는 두 가지 구성 요소로 구성된 조절 시스템입니다. 그것은 독소와 효소의 조절에 관여하는데, 이는 박테리아가 숙주 조직을 침입하고 손상시키는 능력에 기여합니다. Sae 시스템은 또한 S. aureus 세포 내 생존에 중요한 역할을 합니다. 그것은 숙주 식세포에 의한 살해에 저항하고 자가포식 분해를 회피하는 박테리아의 능력에 영향을 미칩니다^12,13.

병원체가 침입할 때 대식세포는 식세포 기능을 가지고 있어 외부 병원체를 집어삼키고 죽이고 적응 면역 반응을 활성화할 수 있습니다¹⁴. 대부분의 침입 박테리아는 대식세포에 의해 식세포화되며, 대식세포는 다양한 살해 메커니즘을 활성화하여 제거합니다. 그러나 일부 S. aureus 박테리아는 대식세포 내에서 생존하여 숙주에 지속적인 감염을 유발할 수 있습니다. 박테리아 단백질 외에도 숙주는 사이토카인 15,16,17을 분비하여 대식세포 내에서 S. aureus의 생존 및 증식에 영향을 미칩니다. 일부 연구에 따르면 S. aureus는 자가포식소체(autophagosome)에 상주하여 세포 내 파종(dissemination)을 촉진하는 틈새(niche)를 생성함으로써 분해를 피할 수 있다고 합니다¹⁸. S. aureus는 자가포식 플럭스(예: LC3-II, p62)를 차단하고 대식세포 침입 후 자가분해체 내 pH를 증가시킴으로써 자가포식 분해를 피합니다¹⁹. 이러한 면역 회피는 S. aureus 독성 인자와 자가포식의 조절을 통해 이루어지며, 이는 지속적이고 숨겨진 감염으로 이어집니다.

S. aureus의 세포 내 감염을 제거하는 것은 임상 실습에서 지속적이고 잠재된 감염을 관리하는 데 매우 중요합니다. 현재 항생제는 황색포도상구균 감염의 주요 치료법이며, 반코마이신은 MRSA 감염에 대한 최후의 방어선 역할을 하고 있다^20,21. 그러나 수많은 연구에서 기존 항생제는 invivo 및 in vitro 모두에서 세포 내 S. ureus를 제거하는 데 효과적이지 않다는 것을 보여주었습니다 22,23,24.

현재 S. aureus^25,26,27의 다양한 세포 내 감염 모델에 대한 통일된 표준은 없으며, 이는 각 모델의 조건이 크게 다르기 때문입니다. 따라서 이러한 모델의 효과를 평가하기 위해 동일한 기준을 적용할 수 없습니다. 본 연구에서는 실험 조건을 최적화하여 황색포도상구균의 보편적인 세포 내 감염 모델을 확립하였다. 이 모델은 체외에서 박테리아를 세포로 처음 감염시킨 다음 감염된 세포를 신체로 전달할 수 있기 때문에 다른 모델에 비해 더 편리합니다.

세포 내 S. aureus 감염의 메커니즘을 더 잘 이해하고 관련 약물을 개발하기 위해 in vitro 및 in vivo 모델을 모두 확립했습니다. RAW264.7을 감염시키고 항생제와 공동 배양하여 시험관 내에서 안정적인 세포 내 감염 모델을 성공적으로 만들었습니다. 그런 다음 복막 대식세포를 추출하여 세포 내 감염으로 형성했습니다. 생쥐의 세포 내 감염 모델은 이러한 복막 대식세포를 주입하여 확립되었습니다.

프로토콜

생후 6-8주 된 특이 병원체가 없는(SPF) 암컷 BALB/c 마우스인 실험 동물을 Beijing HFK Bioscience Co., Ltd(중국 베이징)에서 구입했습니다. 모든 동물연구는 제3군의과대학의 실험동물복지윤리위원회의 승인을 받았으며, 실험동물 사용에 대한 제도적, 국가적 정책 및 지침에 따라 수행되었다. 쥐는 SPF 시설에서 사육 및 예방 접종을 받았으며 멸균 음식과 물을 무료로 이용할 수 있었습니다. 동물들은 무작위로 그룹으로 나뉘어 실험 시작 최소 7일 전에 적응 시간을 가졌습니다.

1. S. aureus에 대한 준비

1. 균주 회수 : 냉동 MRSA252 튜브를 얻고, 접종 링을 소작 및 냉각하여 박테리아 용액 고리를 얻고, 줄무늬 플레이트 방법²⁸에 의해 Tryptic Soy Agar (TSA) 플레이트 (재료 표 참조)에 박테리아를 접종하고 37 ° C에서 밤새 배양합니다.
2. 박테리아 활성화: 다음날 50mL 셰이커 플라스크 1개를 복용하고 20mL의 트립틱 소이 육수(TSB) 배지를 추가합니다( 재료 표 참조). 10 μL 피펫 팁이 있는 단일 콜로니를 선택하여 쉐이커에 추가합니다. 220rpm, 37°C에서 밤새 군체를 배양합니다.
3. 2차 활성화: 다음 날, TSB 배지 15mL가 들어 있는 50mL 셰이커 플라스크 1개를 복용합니다. 첫 번째 활성 박테리아가 포함된 셰이커에서 200μL의 박테리아 용액을 제거하고 20mL의 TSB 배지가 들어 있는 새 플라스크 1개에 추가한 다음 220rpm, 37°C에서 4시간 동안 배양합니다.
4. 50mL 원심분리 튜브에 2차 활성 세균 용액을 모으고 3,000 x g 에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 버립니다.
5. 침전된 박테리아를 10mL의 식염수와 3,000 x g 의 원심분리에 10분 동안 재현탁시킵니다. 이 단계를 2회 반복합니다.
6. 세균액의 OD600 값을 측정하고 식염수로 1.0으로 조정합니다. 이때 본 실험에서 MRSA252의 세균량은 1.0 x 10⁹ CFU/mL였다.
   참고: 박테리아 용액을 항생제가 없는 배지에 첨가하고 원하는 농도로 희석합니다. 본 실험에 사용된 모든 세균은 위와 같은 방법으로 제조하였다.

2. in vitro 세포 내 감염 모델 구축

1. RAW264.7 세포의 준비
   참고: 이 연구에 사용된 세포주는 ATCC에서 얻었습니다. 모든 세포주에서 마이코플라즈마 오염에 대해 음성 판정을 받았습니다. 모든 실험은 로그 성장 단계의 세포에 대해 수행되었습니다.
   1. 액체 질소에서 세포를 제거하고 37°C 수조에서 해동합니다.
   2. RAW264.7 세포를 15mL 원심분리 튜브에 넣고 10% 소 태아 혈청(재료표 참조), 페니실린(100 units/mL) 및 스트렙토마이신(100 μg/mL, 재료 표 참조, 완전한 배지)이 보충된 Dulbecco의 변형된 독수리 배지(DMEM, 재료 표 참조) 2mL를 5% CO₂에서 37°C로 추가합니다. 300 x g에서 5분 동안 원심분리기
   3. 3 x 10⁶ RAW264.7 세포를 100mm 접시에 10mL의 완전한 배지로 시딩합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 37 ° C에서 5 % CO₂ 에서 12 시간 동안 유지하여 세포의 합류점이 50 % -60 % 사이가되도록합니다.
2. 체외 세포 내 감염
   1. 10μL의 세포 현탁액을 세포 카운터에 추가하여 세포 농도를 계산합니다. 각 웰에 대해 1mL의 완전한 배지를 사용하여 24웰 플레이트(재료 표 참조)에서 2 x 10⁵ RAW264.7 세포를 계수 및 시딩하고 세포 배양 인큐베이터에 10-12시간 동안 보관합니다.
   2. 상등액을 제거하고 각 웰에 2 x 10⁶ CFU 박테리아 용액(단계 1.6)을 포함하는 완전한 배지 1mL를 추가합니다. 세포 배양 인큐베이터에 2시간 동안 넣습니다. 감염의 MRSA252 다품종 감염
      (MOI)는 10입니다. (다양한 감염 다중성(MOI) 값과 세포에 의한 박테리아의 식세포작용 사이의 상관관계를 확인하기 위해 MOI 값이 20, 30, 40 및 50인 실험군을 설정했습니다.)
      참고: 세포를 감염시킬 때 사용되는 전체 배지에는 페니실린과 스트렙토마이신이 포함되어 있지 않습니다.
   3. 상층액을 제거하고 PBS로 셀을 2회 세척합니다( 재료 표 참조). 100μg/mL 겐타마이신( 재료 표 참조)과 함께 DMEM 웰당 800μL를 추가하고 37°C의 5% CO₂ 에서 2시간 동안 세포 배양기에 넣습니다.
3. in vitro intracellular 감염 모델 평가
   1. 세포 내 S. 아우레우스 사멸 분석
      1. RAW264.7 세포(단계 2.2.2 및 2.2.3)를 원심분리 튜브에 별도로 수집합니다. PBS로 세포를 2x 세척하고 각 튜브에 0.1% Triton X-100( 재료 표 참조) 용액을 5분 동안 첨가한 다음 원심분리기 튜브에 용해물을 수집합니다.
      2. PBS를 사용하여 용해물을 연속적으로 희석합니다. 20μL의 용해물을 180μL의 PBS가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브에 넣은 다음 피펫팅으로 완전히 혼합합니다. 이 절차에 따라 단계별로 희석하십시오. TSA 플레이트에 용해물의 각 희석액을 찾아 37°C에서 밤새 배양합니다. 용해물을 위해 TSA 플레이트의 콜로니를 계산합니다(그림 1A).
         참고: 또한, 복막 대식세포에서 MRSA252의 세포 내 감염에 대한 최적의 실험 조건을 조사했습니다. MRSA252에 감염되어 다양한 농도의 겐타마이신으로 처리된 복막 대식세포의 박테리아 부하가 그림 1B에 나와 있으며, 100μg/mL 겐타마이신으로 다양한 기간 동안 처리된 후 박테리아 부하가 그림 1C에 나와 있습니다.
      3. 섹션 2.3.1.2에 설명된 대로 상층액과 용해액을 PBS로 직렬로 희석하고 TSA 플레이트에서 상등액 및 용해물에 대한 집락을 관찰합니다(그림 2A).
   2. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)
      1. RAW264.7 세포를 공초점 페트리 접시에서 2 x 10⁵ cells/mL로 희석하고( 표 참조) 세포 배양기에 넣어 37°C에서 5% CO₂로 밤새 접착합니다. 2 x 10⁶ CFU 및 4 x 10⁶ 박테리아 용액(단계 1.6)을 포함하는 완전한 배지 1mL를 각 컨포칼 페트리 접시에 추가하고 세포 배양기에 2시간 동안 넣어 각각 MOI 10 및 20을 만듭니다.
      2. 상층액을 제거하고 PBS로 세포를 3회 세척하고 100μg/mL 겐타마이신 DMEM을 2시간 동안 첨가한 후 세포외 세균을 제거합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고 PBS로 세포를 2x 세척하고 DIL 작동 유체( 재료 표 참조)를 추가한 다음 37°C에서 어둠 속에서 5분 동안 배양합니다.
      3. DIL 작동액을 제거하고 PBS로 3회 세척한 후 4% 파라포름알데히드 용액( 재료표 참조)으로 20분 동안 고정합니다.
      4. 파라포름알데히드 용액을 제거하고 PBS로 3회 세척하고 DAPI 염료( 재료 표 참조)를 첨가하고 어두운 곳에서 5분 동안 배양합니다. DAPI 염료 용액을 제거하고 PBS로 5x 세척합니다. CLSM을 사용하여 세포를 관찰합니다(그림 2B).
         참고: 이 작업은 상동 재조합 방법²⁹를 사용하여 구성된 녹색 형광 단백질(GFP)로 설계 MRSA252 사용되었습니다.

3. in vivo intracellular 감염 모델 구축

1. 마우스에서 복막 대식세포의 획득
   1. 6% 전분 육수를 준비합니다. 질량 비율 3:10:5(w/w)에 따라 유리 용기에 세 가지 종류의 부형제(쇠고기 추출물 분말, 트립톤, 염화나트륨, 재료 표 참조)를 연속적으로 첨가합니다. 유리 용기에 ddH₂O 1L를 넣고 저어 녹인 다음 전자 레인지에서 가열합니다. 용성 전분( 재료 표 참조)을 질량비가 6으로 추가하고 저어 녹인 다음 유리 용기를 121°C에서 30분 동안 오토클레이브합니다. 반죽이 될 때까지 4°C의 냉장고에 보관하십시오.
   2. 아래 설명된 단계에 따라 마우스 복막 대식세포를 수집합니다.
      1. Balb/c 마우스 두 개를 선택합니다. 왼손을 사용하여 마우스의 목을 잡고 꼬리를 제어합니다. 마우스를 뒤집고 머리는 아래로, 복부는 위로 올립니다(그림 3A). 마우스당 3mL의 6% 전분 육수를 복강내 주사합니다(그림 3B).
         참고: 중력으로 인해 복강의 장기가 가슴 쪽으로 뒤로 떨어져 주사기가 다른 장기를 손상시키는 것을 방지합니다.
      2. 72시간 후, 3% 이소플루란으로 마우스를 마취한 다음 경추 탈구로 희생합니다. 75% 에틸 알코올로 소독하십시오. 안과 가위를 사용하여 마우스의 복부를 잘라 복막을 완전히 노출시킵니다(그림 4A-C).
      3. 10mL의 DMEM 배지를 마우스에 주입하여 복강내 주사로 복강을 세척합니다(그림 4D). DMEM을 마우스의 복강에 주입한 후 마우스의 복부를 약 1분 동안 부드럽게 문질러 복부를 더 철저히 세척합니다. 주사기를 사용하여 세척액을 50mL 원심분리 튜브에 모읍니다(그림 4E).
      4. 세척액을 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
      5. 10% 소 태아 혈청, 페니실린(100 units/mL) 및 스트렙토마이신(100 μg/mL, 완전한 배지)이 보충된 10mL DMEM을 사용하여 수집된 세포를 불어 흡입하고, 계수하고, 세포 농도를 2 x 10⁶/mL로 희석한 다음 웰당 1mL인 6-well plate( 재료 표 참조)에 플랭크합니다.
      6. 6웰 플레이트를 37°C에서 5% CO₂에 놓고 4시간 동안 배양한 다음 상등액을 제거합니다. 멸균 PBS로 셀을 2x 세척하고 37°C에서 웰당 1mL의 DMEM으로 5% CO₂로 밤새 배양합니다.
2. 세포 내 세균의 제조
   1. 복막 대식세포(3.1.2단계)를 2시간 동안 MRSA252로 배양합니다. 상층액을 제거하고 PBS로 세포를 2회 세척합니다. 100μg/mL 겐타마이신(웰당 1mL)이 포함된 DMEM 완전 배지를 추가하고 5% CO₂에서 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
   2. 상층액을 제거하고 PBS로 세포를 3x 세척합니다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 50mL 원심분리 튜브에서 마우스 복막 대식세포를 수집하고 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. MRSA252의 세포 내 박테리아는 복막 대식세포에서 성공적으로 준비되었습니다.
   3. 세포 내 박테리아를 계산하려면 세포 내 MRSA252에 감염된 복막 대식세포에 라이소자임(10μg/mL, 재료 표 참조)을 37°C에서 10분 동안 첨가한 다음 PBS 2x로 세척합니다. 그런 다음 PBS 1mL를 첨가하여 세포를 재현탁합니다. 0.1% Triton X-100을 5분 동안 첨가하여 세포를 용해합니다.
   4. 연속 희석액으로 용해를 희석하고 TSA 플레이트에 떨어뜨립니다. 37 °C에서 하룻밤 사이 문화. 박테리아 군체를 세어 마우스당 1.8 x 10⁶ CFU인 복막 대식세포에 있는 MRSA252의 세포 내 박테리아를 계산합니다.
      참고: 세포 스크레이퍼가 세포를 수집할 때 작업은 부드러워야 합니다. 세포는 후속 실험에 영향을 미칠 수 있는 세포 파손을 피하기 위해 한 방향으로 긁어냅니다.
3. 마우스의 세포 내 세균 감염
   1. 20Balb/c 마우스를 무작위로 4개의 그룹으로 나눕니다(n=5, 그림 5A).
   2. 그룹 I의 경우, 마우스당 3 x 10⁶ CFU 플랑크톤 MRSA252을 정맥 주사로 주입합니다. 그룹 II의 경우, 마우스당 3 x 10⁶ CFU 플랑크톤 MRSA252와 반코마이신(110mg/kg, 재료 표 참조)을 정맥 주사로 주입합니다. 그룹 III의 경우 세포 내 박테리아(3.2단계에서 준비)를 정맥 주사로 주입합니다. 그룹 IV의 경우, 마우스 1개당 세포 내 박테리아(3.2단계에서 준비)와 반코마이신(110mg/kg)을 정맥 주사로 주입합니다.
   3. 꼬리 정맥이 확장될 때까지 쥐를 적외선 물리 치료 램프 아래에 놓습니다.
   4. 그룹 I 및 그룹 II의 마우스당 3 x 10⁶ CFU 플랑크톤 MRSA252를 정맥 주사합니다. 그룹 III 및 그룹 IV의 마우스 당 세포 내 박테리아(3.2단계에서 준비)를 정맥 주사합니다.
      알림: 주사기를 사용하여 세포 내 박테리아가 포함된 액체를 수집할 때는 먼저 액체를 피펫으로 고르게 부드럽게 혼합하여 모든 마우스에서 일관된 감염 수준을 보장하는 것이 좋습니다.
   5. 30분 후, 반코마이신을 마우스 한 마리당 그룹 II 및 그룹 IV에 정맥 주사합니다.
4. in vivo 세포 내 감염 모델 평가
   1. 신장에서 박테리아의 집락화를 계산하여 마우스의 세포 내 감염 모델을 평가합니다. 주사 24시간 후, 3% 이소플루란으로 마우스를 마취하고 경추 탈구로 희생합니다. 75% 에틸 알코올로 소독하십시오.
   2. 마우스를 움직이지 못하게 하고, 한 손으로는 핀셋으로 복부 피부를 들어 올리고, 다른 손으로는 안과 가위로 마우스의 복부 피부를 자르고, 복강에서 신장을 찾아 신장을 완전히 벗겨냅니다. PBS에 넣으십시오.
   3. 조직 분쇄 튜브에 PBS 1mL를 추가합니다. 각 마우스의 신장을 별도의 분쇄 튜브로 옮기고 고체 조직이 남지 않을 때까지 분쇄합니다. 균질화된 조직을 개별 EP 튜브에 붓고 각 튜브에 해당 마우스 ID를 표시합니다.
   4. PBS를 사용하여 조직 균질액을 연속적으로 희석합니다. 각 희석액을 별도의 TSA 플레이트에 찾아보고 37°C에서 밤새 배양합니다. 군체의 수를 세고 데이터를 분석합니다(그림 5B).

결과

S. aureus의 세포 내 감염 모델은 in vitro 및 in vivo 모두에서 성공적으로 확립되었습니다. 식세포작용(phagocytosis)을 위한 실험 조건을 최적화하고 항생제 처리의 농도와 기간을 모두 연장함으로써 일부 S. aureus는 대식세포 내에서 살아남았습니다(그림 1). S. aureus의 항생제 내성을 추가로 평가하기...

토론

S. aureus는 통성 세포 내 병원체로서 다양한 세포 유형에 침입하여 생존할 수 있으며, 이러한 능력을 사용하여 감염 중 항생제 및 면역 반응을 회피할 수 있습니다³⁰. 이 연구는 병원체의 세포 내 감염 메커니즘을 조사하기 위한 기반을 제공하기 위해 S. aureusin vivo 의 세포 내 감염 모델을 확립했습니다. 다양한 MOI 값이 S. aureus의 대식세?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plate	Corning Incorporated, USA	3524
4 % paraformaldehyde solutione	BBI, UK	E672002-0500
6-well plate	Corning Incorporated, USA	3516
Beef extract powder	BBI, UK	A600114-0500
Biohazard safety equipment	Heal force, China	VS-1300L-u
Cell incubator	ESCO, Singapore	CCL-170B-8
Cell scraper	Nest	710001
Centrifuge M1416R	RWD, China	M1416R
Centrifuge tube	Guanghou Labselect, China	CT-002-50A
Confocal laser scanning microscope (CLSM)	Zeiss, Germany	880
Confocal petri dish	Biosharp, China	BS-20-GJM
DAPI dye	Shanghai Beyotime, China	C1006
DIL working fluid	Shanghai Beyotime, China	C1991S
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Thermo Gibco, USA	C11995500BT
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SV30208.02
Gentamycin	Shanghai Sangon, China	B540724-0010
Incubator	Shanghai Hengzi, China	HDPF-150
Lysozyme	Beijing Solarbio, China	L9070
MRSA252	Third Military Medical University, China	null
MRSA252(GPF)	Third Military Medical University, China	null
Penicillin and Streptomycin	Shanghai Beyotime, China	C0222
Phosphate Buffer Solution	Shanghai Beyotime, China	ST476
Saline	Sichuan Kelun, China	null
Sodium chloride	Shanghai Macklin, China	S805275
Starch soluble	Shanghai Sangon, China	A500904-0500
Triton X-100	Shanghai Beyotime, China	P0096-100ml
Tryptic Soy Agar (TSA) plates	Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China	02-130
Tryptic Soy Broth (TSB) medium	Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China	02-102K
Tryptone	OXOID, UK	LP0042B
Vancomycin	Shanghai Beyotime, China	ST2807-250mg
RAW264.7 cell	USA, ATCC	null