Entwicklung und Bewertung von intrazellulären Infektionsmodellen für Staphylococcus aureus

Zusammenfassung

Staphylococcus aureus (S. aureus) hat die Fähigkeit, sich im ganzen Körper zu verbreiten und anhaltende und wiederkehrende Infektionen zu verursachen. Um diese Prozesse besser zu verstehen, wird in dieser Studie ein intrazelluläres Infektionsmodell für S. aureus etabliert. Dieses Modell wird eine entscheidende Grundlage für die Untersuchung der Mechanismen hinter intrazellulären Infektionen liefern.

Zusammenfassung

S. aureus kann in Wirtszellen, einschließlich Immunzellen, eindringen und dort persistieren, was es ihm ermöglicht, sich der Immunerkennung und -beseitigung zu entziehen. Diese intrazelluläre Persistenz trägt zu chronischen und wiederkehrenden Infektionen bei, erschwert die Behandlung und verlängert die Krankheit. Folglich besteht ein dringender Bedarf an einem intrazellulären Infektionsmodell, um durch S. aureus verursachte Infektionen besser zu verstehen, zu verhindern und zu behandeln. Diese Studie zeigte, dass Antibiotika extrazelluläre Bakterien effektiv eliminierten, aber nicht diejenigen ausrotten konnten, die in die Zellen eingedrungen waren. So wurde eine stabile intrazelluläre Infektion in vitro durch RAW264.7 etabliert, die mit S. aureus infiziert und mit Antibiotika kokultiviert wurden. Anschließend wurde ein intrazelluläres Infektionsmodell bei Mäusen etabliert, indem Peritonealmakrophagen injiziert wurden, die die intrazelluläre Infektion enthielten. Vancomycin beseitigte effektiv die bakterielle Belastung bei Mäusen, die mit planktonischem S. aureus konfrontiert waren; Es war jedoch unwirksam gegen Mäuse, die mit gleichen oder niedrigeren Mengen an intrazellulären Bakterien in den Peritonealmakrophagen infiziert waren. Dies deutet darauf hin, dass das intrazelluläre Infektionsmodell von S. aureus erfolgreich etabliert wurde und potenzielle Erkenntnisse für die Prävention und Behandlung intrazellulärer Infektionen bietet.

Einleitung

S. aureus ist ein hochansteckender Krankheitserreger, der eine Reihe von Infektionen verursachen kann, darunter Haut- und Weichteilinfektionen, Sepsis, Meningitis, Lungenentzündung und Endokarditis¹. Der klinische Missbrauch von Antibiotika hat zu einer erhöhten Resistenz bei S. aureus und zum Auftreten von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) geführt, der in vielen Ländern eine erhebliche Bedrohung für die öffentliche Gesundheit darstellt².

Obwohl S. aureus traditionell nicht als intrazellulärer Krankheitserreger eingestuft wird, deuten neue Erkenntnisse darauf hin, dass er nach einer Invasion persistent Wirtszellen besiedeln kann³. Die Fähigkeit von S. aureus, intrazellulär in Wirtsphagozyten zu überleben, wird zunehmend als ein Mechanismus anerkannt, der die metastasierende Infektion und Ausbreitung im Wirt erleichtert ^4,5,6. S. aureus sezerniert verschiedene Virulenzfaktoren, die ein Immunmilieu schaffen, das sein Überleben fördert und die Fähigkeit des Wirts erschwert, es vollständig zu eliminieren⁷. Der akzessorische Genregulator (agr) und die Staphylokokken-Helferelemente (Sae) sind zwei wichtige Virulenzregulatoren, die eng mit dem Überleben von Staphylococcus aureus in Phagozyten zusammenhängen ^8,9. Das agr-System ist ein Quorum-Sensing-Mechanismus, der die Expression zahlreicher Virulenzfaktoren in S. aureus reguliert. Es kontrolliert die Produktion von Toxinen und anderen Faktoren, die das Überleben und die Verbreitung von Bakterien erleichtern. Während einer intrazellulären Infektion spielt das agr-System eine entscheidende Rolle bei der Regulation von Virulenzfaktoren, die für die Fähigkeit des Bakteriums unerlässlich sind, sich der Immunantwort des Wirts zu entziehen und in den Wirtszellen zu überleben. Studien haben gezeigt, dass das agr-System die Fähigkeit des Bakteriums beeinflusst, aus Phagosomen zu entkommen und in Makrophagen zu überleben. Das Fehlen von agr kann zu einem verminderten bakteriellen Überleben in den Wirtszellen und einer verminderten Virulenz führen^10,11. Das Sae-System ist ein Zwei-Komponenten-Regulationssystem, das die Expression mehrerer Virulenzfaktoren in S. aureus steuert. Es ist an der Regulierung von Toxinen und Enzymen beteiligt, die zur Fähigkeit des Bakteriums beitragen, in das Wirtsgewebe einzudringen und es zu schädigen. Das Sae-System spielt auch eine entscheidende Rolle für das intrazelluläre Überleben von S. aureus. Es beeinflusst die Fähigkeit des Bakteriums, der Abtötung durch Wirtsphagozyten zu widerstehen und dem autophagischen Abbau zu entgehen^12,13.

Wenn Krankheitserreger eindringen, haben Makrophagen phagozytische Funktionen, die fremde Krankheitserreger verschlingen und abtöten und die adaptive Immunantwort aktivieren können¹⁴. Die meisten eindringenden Bakterien werden von Makrophagen phagozytiert, die dann verschiedene Abtötungsmechanismen aktivieren, um sie zu eliminieren. Einige S. aureus-Bakterien können jedoch in Makrophagen überleben, was zu einer anhaltenden Infektion des Wirts führt. Neben bakteriellen Proteinen beeinflusst der Wirt auch das Überleben und die Proliferation von S. aureus in Makrophagen, indem er Zytokine sezerniert 15,16,17. Einige Studien deuten darauf hin, dass S. aureus dem Abbau entgehen kann, indem er sich in Autophagosomen aufhält und so eine intrazelluläre Nische schafft, die die Verbreitung fördert¹⁸. S. aureus entgeht dem autophagischen Abbau, indem es den Autophagiefluss (z. B. LC3-II, p62) blockiert und den pH-Wert in den Autolysosomen nach der Makrophageninvasion erhöht¹⁹. Diese Immunevasion wird durch die Regulation von S. aureus-Virulenzfaktoren und Autophagie erreicht, was zu persistierenden, versteckten Infektionen führt.

Die Beseitigung intrazellulärer Infektionen von S. aureus ist entscheidend für die Behandlung persistenter und latenter Infektionen in der klinischen Praxis. Derzeit sind Antibiotika die primäre Behandlung von S. aureus-Infektionen, wobei Vancomycin als letzte Verteidigungslinie gegen MRSA-Infektionen dient^20,21. Zahlreiche Studien haben jedoch gezeigt, dass bestehende Antibiotika bei der Eliminierung von intrazellulärem S. aureus sowohl invivo als auch in vitro unwirksam sind 22,23,24.

Es gibt derzeit keinen einheitlichen Standard für die verschiedenen intrazellulären Infektionsmodelle von S. aureus 25,26,27, da sich die Bedingungen der einzelnen Modelle erheblich unterscheiden. Folglich können nicht dieselben Kriterien für die Bewertung der Wirksamkeit dieser Modelle herangezogen werden. In dieser Studie haben wir ein universelles intrazelluläres Infektionsmodell von Staphylococcus aureus etabliert, indem wir die experimentellen Bedingungen optimiert haben. Dieses Modell bietet im Vergleich zu anderen Modellen einen größeren Komfort, da es die Erstinfektion von Bakterien in Zellen in vitro ermöglicht, gefolgt von der Abgabe dieser infizierten Zellen in den Körper.

Um die Mechanismen der intrazellulären S. aureus-Infektion besser zu verstehen und entsprechende Medikamente zu entwickeln, haben wir sowohl in vitro als auch in vivo Modelle etabliert. In vitro wurde erfolgreich ein stabiles intrazelluläres Infektionsmodell erstellt, indem RAW264.7 infiziert und mit Antibiotika co-kultiviert wurde. Dann wurden peritoneale Makrophagen extrahiert und zu intrazellulären Infektionen geformt. Durch Injektion dieser Peritonealmakrophagen wurde ein intrazelluläres Infektionsmodell bei Mäusen etabliert.

Protokoll

Versuchstiere, 6-8 Wochen alte spezifisch pathogenfreie (SPF) weibliche BALB/c-Mäuse, wurden von der Beijing HFK Bioscience Co., Ltd (Peking, China) gekauft. Alle Tierversuche wurden von der Kommission für den Schutz und die Ethik von Labortieren der Dritten Militärmedizinischen Universität genehmigt und in Übereinstimmung mit den institutionellen und nationalen Richtlinien und Richtlinien für die Verwendung von Labortieren durchgeführt. Die Mäuse wurden in SPF-Einrichtungen gehalten und geimpft und erhielten freien Zugang zu sterilem Futter und Wasser. Die Tiere wurden nach dem Zufallsprinzip in Gruppen eingeteilt und erhielten vor Beginn der Versuche eine Anpassungszeit von mindestens 7 Tagen.

1. Vorbereitung auf S. aureus

1. Stammwiederherstellung: Entnehmen Sie ein Röhrchen mit gefrorenem MRSA252, kauterisieren und kühlen Sie den Impfring, um einen Ring aus Bakterienlösung zu erhalten, inokulieren Sie die Bakterien auf Tryptischen Soja-Agar (TSA)-Platten (siehe Materialtabelle) nach der Streifenplattenmethode²⁸ und kultivieren Sie ihn über Nacht bei 37 °C.
2. Bakterielle Aktivierung: Nehmen Sie am nächsten Tag einen 50-ml-Schüttelkolben und fügen Sie 20 ml Tryptische Sojabrühe (TSB)-Medium hinzu (siehe Materialtabelle). Wählen Sie eine einzelne Kolonie mit einer 10 μl Pipettenspitze aus und geben Sie sie in den Shaker. Inkubieren Sie die Bienenvölker über Nacht bei 220 U/min, 37 °C.
3. Sekundäre Aktivierung: Nehmen Sie am nächsten Tag einen 50-ml-Shaker-Kolben mit 15 mL TSB-Medium ein. 200 μl Bakterienlösung aus dem Schüttler mit den ersten aktivierten Bakterien nehmen, in den neuen Kolben mit 20 ml TSB-Medium geben und 4 h bei 220 U/min und 37 °C inkubieren.
4. Sammeln Sie die sekundär aktivierte bakterielle Lösung in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen, zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 3.000 x g und entsorgen Sie den Überstand.
5. Resuspendieren Sie die ausgefällten Bakterien in 10 mL Kochsalzlösung und zentrifugieren Sie sie bei 3.000 x g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 2X.
6. Messen Sie den OD600-Wert der Bakterienlösung und stellen Sie ihn mit Kochsalzlösung auf 1,0 ein. Zu diesem Zeitpunkt betrug die bakterielle Menge an MRSA252 in diesem Experiment 1,0 x 10⁹ KBE/ml.
   HINWEIS: Die bakterielle Lösung wird in ein Medium ohne Antibiotika gegeben und auf die gewünschte Konzentration verdünnt; Alle Bakterien, die in diesem Experiment verwendet wurden, wurden nach der oben genannten Methode präpariert.

2. Etablierung eines intrazellulären Infektionsmodells in vitro

1. Präparation von RAW264.7-Zellen
   HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten Zelllinien wurden von ATCC bezogen. Alle Zelllinien wurden negativ auf Mykoplasmenkontamination getestet. Alle Experimente wurden an Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase durchgeführt.
   1. Entfernen Sie die Zellen aus dem flüssigen Stickstoff und tauen Sie sie in einem 37 °C warmen Wasserbad auf.
   2. RAW264.7-Zellen werden in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben, 2 ml Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM; siehe Materialtabelle) zugegeben, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (siehe Materialtabelle), Penicillin (100 Einheiten/ml) und Streptomycin (100 μg/ml; siehe Materialtabelle; vollständiges Medium) bei 37 °C in 5 % CO₂. Bei 300 x g 5 min zentrifugieren.
   3. Seed: 3 x 10⁶ RAW264.7 Zellen in 100 mm Schalen mit 10 mL vollständigem Medium. 12 h in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C in 5 % CO 2 aufbewahren, so dass der Zusammenfluss der Zellen zwischen 50 %_und 60 % liegt.
2. Intrazelluläre In-vitro-Infektion
   1. Nehmen Sie 10 μl Zellsuspension und geben Sie sie in den Zellzähler, um die Zellkonzentration zu berechnen. Zählen und säen Sie 2 x 10⁵ RAW264.7-Zellen in einer 24-Well-Platte (siehe Materialtabelle) mit 1 ml vollständigem Medium für jede Vertiefung und bewahren Sie sie 10-12 Stunden in einem Zellkultur-Inkubator auf.
   2. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie 1 ml vollständiges Medium mit 2 x 10⁶ KBE Bakterienlösung (Schritt 1.6) in jede Vertiefung. Legen Sie es für 2 h in den Zellkultur-Inkubator. Die MRSA252 infizierten Vielzahl von Infektionen
      (MOI) beträgt 10. (Um die Korrelation zwischen den MOI-Werten (Various Multiplicities of Infection) und der Phagozytose von Bakterien durch Zellen zu verifizieren, haben wir Versuchsgruppen mit MOI-Werten von 20, 30, 40 und 50 etabliert.
      HINWEIS: Das vollständige Medium, das bei der Infektion von Zellen verwendet wird, enthält kein Penicillin und kein Streptomycin.
   3. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen 2x mit PBS (siehe Materialtabelle). Geben Sie 800 μl DMEM mit 100 μg/ml Gentamycin pro Vertiefung hinzu (siehe Materialtabelle) und geben Sie es 2 h lang bei 37 °C in 5 % CO₂ in den Zellinkubator.
3. Evaluierung eines in vitro intrazellulären Infektionsmodells
   1. Intrazellulärer S. aureus-Tötungsassay
      1. Die RAW264.7-Zellen (Schritte 2.2.2 und 2.2.3) werden separat in Zentrifugenröhrchen gesammelt. Waschen Sie die Zellen 2x mit PBS, geben Sie 0,1% Triton X-100 (siehe Materialtabelle) Lösung für 5 min in jedes Röhrchen und sammeln Sie das Lysat in den Zentrifugenröhrchen.
      2. Verwenden Sie PBS, um das Lysat seriell zu verdünnen. Nehmen Sie 20 μl Lysat und geben Sie es in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 180 μl PBS, dann mischen Sie es gründlich durch Pipettieren. Nach diesem Verfahren Schritt für Schritt verdünnen. Jede Verdünnung des Lysats wird auf TSA-Platten aufgetragen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Zählen Sie die Kolonien auf den TSA-Platten für Lysat (Abbildung 1A).
         HINWEIS: Des Weiteren untersuchten wir die optimalen experimentellen Bedingungen für eine intrazelluläre Infektion von MRSA252 in Peritonealmakrophagen. Die bakterielle Belastung in Peritonealmakrophagen, die mit MRSA252 infiziert und mit unterschiedlichen Konzentrationen von Gentamicin behandelt wurden, ist in Abbildung 1B dargestellt, während die bakterielle Belastung nach Behandlung mit 100 μg/ml Gentamicin für unterschiedliche Zeiträume in Abbildung 1C dargestellt ist.
      3. Der Überstand und das Lysat werden nacheinander mit PBS verdünnt, wie in Abschnitt 2.3.1.2 beschrieben, und die Kolonien auf den TSA-Platten für den Überstand und das Lysat beobachten (Abbildung 2A).
   2. Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM)
      1. RAW264.7-Zellen (Schritt 2.2) werden auf einer konfokalen Petrischale in 2 x 10⁵ Zellen/ml verdünnt (siehe Materialtabelle) und zur Adhäsion über Nacht bei 37 °C in 5 % CO₂ in einen Zellinkubator gegeben. 1 ml des vollständigen Mediums mit 2 x 10⁶ KBE und 4 x 10⁶ Bakterienlösung (Schritt 1.6) in jede konfokale Petrischale geben und für 2 Stunden in den Zellinkubator stellen, wobei der MOI 10 bzw. 20 ergibt.
      2. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen 3x mit PBS, fügen Sie 100 μg/ml Gentamycin DMEM für 2 h hinzu und entfernen Sie die extrazellulären Bakterien. Entfernen Sie dann den Überstand und waschen Sie die Zellen 2x mit PBS, fügen Sie DIL Arbeitsmittel hinzu (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie bei 37 °C für 5 min im Dunkeln.
      3. DIL-Arbeitsmittel entfernen und 3x x mit PBS waschen und mit 4%iger Paraformaldehydlösung (siehe Materialtabelle) für 20 min fixieren.
      4. Entfernen Sie die Paraformaldehydlösung und waschen Sie sie 3x mit PBS, fügen Sie DAPI-Farbstoff hinzu (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie 5 Minuten im Dunkeln. Entfernen Sie die DAPI-Färbelösung und waschen Sie sie 5x mit PBS. Verwenden Sie CLSM, um Zellen zu beobachten (Abbildung 2B).
         ANMERKUNG: In dieser Arbeit wurde ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) verwendet MRSA252 entwickelt, das unter Verwendung der homologen Rekombinationsmethode²⁹ konstruiert wurde.

3. Etablierung eines in vivo intrazellulären Infektionsmodells

1. Gewinnung von Peritonealmakrophagen bei Mäusen
   1. 6% Stärkebrühe zubereiten. Entsprechend dem Massenverhältnis 3:10:5 (w/w) drei Arten von Hilfsstoffen (Rindfleischextraktpulver, Trypton, Natriumchlorid; siehe Materialtabelle) nacheinander in den Glasbehälter geben. 1 l ddH₂O in ein Glasgefäß geben, zum Schmelzen rühren und in der Mikrowelle erhitzen. Geben Sie lösliche Stärke (siehe Materialtabelle) mit einem Massenverhältnis von 6 hinzu, rühren Sie um, um zu schmelzen, und stellen Sie sicher, dass der Glasbehälter 30 Minuten lang bei 121 °C autoklaviert wird. Im Kühlschrank bei 4 °C lagern, bis es zu einer Paste wird.
   2. Sammeln Sie Maus-Peritonealmakrophagen mit den unten beschriebenen Schritten.
      1. Wähle zwei Balb/c-Mäuse aus. Greife mit der linken Hand nach dem Hals der Maus und steuere den Schwanz. Klappen Sie die Maus um, und lassen Sie den Kopf nach unten und den Bauch nach oben (Abbildung 3A). Verabreichen Sie eine intraperitoneale Injektion von 6 % Stärkebrühe, 3 ml pro Maus (Abbildung 3B).
         HINWEIS: Aufgrund der Schwerkraft fallen die Organe in der Bauchhöhle nach hinten zur Brust, wodurch verhindert wird, dass die Spritze andere Organe verletzt.
      2. Nach 72 h betäuben Sie die Mäuse mit 3% Isofluran und töten Sie sie dann durch Zervixluxation. Desinfizieren Sie sie mit 75%igem Ethylalkohol. Verwenden Sie eine Augenschere, um den Bauch der Maus aufzuschneiden, um ihr Bauchfell vollständig freizulegen (Abbildung 4A-C).
      3. Injizieren Sie 10 ml DMEM-Medium in die Mäuse, um die Bauchhöhle durch intraperitoneale Injektion zu spülen (Abbildung 4D). Nachdem Sie DMEM in die Bauchhöhle der Maus injiziert haben, reiben Sie den Bauch der Maus etwa 1 Minute lang sanft, um den Bauch gründlicher zu spülen. Verwenden Sie eine Spritze, um Spülflüssigkeit in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen zu füllen (Abbildung 4E).
      4. Die Spülflüssigkeit wird 5 min lang bei 300 x g zentrifugiert und der Überstand wird verworfen.
      5. Verwenden Sie 10 ml DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, Penicillin (100 Einheiten/ml) und Streptomycin (100 μg/ml; vollständiges Medium), um die gesammelten Zellen zu blasen und zu saugen, sie zu zählen und die Zellkonzentration auf 2 x 10⁶/ml zu verdünnen und auf 6-Well-Platten zu bretten (siehe Materialtabelle), 1 mL pro Well.
      6. Die 6-Well-Platte wird bei 37 °C und 5 % CO₂ gestellt, 4 h inkubiert und dann der Überstand entfernt. Waschen Sie die Zellen 2x mit sterilem PBS und kulturieren Sie sie über Nacht mit 1 mL DMEM pro Vertiefung bei 37 °C in 5 % CO₂.
2. Zubereitung von intrazellulären bakteriellen
   1. Die Peritonealmakrophagen (Schritt 3.1.2) werden 2 h lang mit MRSA252 inkubiert. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen 2x mit PBS. Geben Sie DMEM-Komplettmedium mit 100 μg/ml Gentamycin (1 mL pro Well) hinzu und inkubieren Sie 2 Stunden lang bei 37 °C in 5 % CO₂.
   2. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen 3x mit PBS. Verwenden Sie einen Zellschaber, um Maus-Peritonealmakrophagen in 50-ml-Zentrifugenröhrchen zu sammeln, zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 300 x g . Die intrazellulären Bakterien MRSA252 wurden erfolgreich in Peritonealmakrophagen präpariert.
   3. Für die Berechnung der intrazellulären Bakterien wird den mit intrazellulärem MRSA252 infizierten Peritonealmakrophagen Lysozym (10 μg/ml, siehe Materialtabelle) bei 37 °C für 10 min zugegeben und anschließend mit PBS 2x gewaschen. Fügen Sie dann 1 ml PBS hinzu, um die Zellen zu resuspendieren. Lysieren Sie die Zellen durch Zugabe von 0,1% Triton X-100 für 5 Minuten.
   4. Verdünnen Sie die Lyse mit Reihenverdünnungen und lassen Sie sie auf eine TSA-Platte fallen. Kultur über Nacht bei 37 °C. Berechnen Sie die intrazellulären Bakterien von MRSA252 in Peritonealmakrophagen, die 1,8 x 10⁶ KBE pro Maus betrugen, indem Sie die Bakterienkolonien zählen.
      HINWEIS: Wenn der Zellschaber Zellen sammelt, sollte die Aktion sanft sein. Die Zellen werden in eine Richtung abgekratzt, um einen Zellbruch zu vermeiden, der das nachfolgende Experiment beeinträchtigen könnte.
3. Intrazelluläre bakterielle Infektion bei Mäusen
   1. Teilen Sie 20 Balb/c-Mäuse nach dem Zufallsprinzip in vier Gruppen auf (n=5, Abbildung 5A).
   2. Für Gruppe I werden 3 x 10⁶ KBE planktonische MRSA252 pro Maus durch intravenöse Injektion injiziert. Für Gruppe II sind 3 x 10⁶ KBE planktonisches MRSA252 und Vancomycin (110 mg/kg; siehe Materialtabelle) pro Maus durch intravenöse Injektion zu injizieren. Für Gruppe III werden die intrazellulären Bakterien (hergestellt in Schritt 3.2) durch intravenöse Injektion injiziert. Für Gruppe IV sind die intrazellulären Bakterien (hergestellt in Schritt 3.2) und Vancomycin (110 mg/kg) pro Maus durch intravenöse Injektion zu injizieren.
   3. Legen Sie die Mäuse unter die Infrarot-Physiotherapielampe, bis sich ihre Schwanzvenen erweitert haben.
   4. Intravenöse Injektion von 3 x 10⁶ KBE planktonischen MRSA252 pro Maus der Gruppe I und II. Intravenöse Injektion der intrazellulären Bakterien (hergestellt in Schritt 3.2) pro Maus der Gruppe III und IV.
      HINWEIS: Wenn Sie eine Spritze verwenden, um Flüssigkeit zu sammeln, die intrazelluläre Bakterien enthält, wird empfohlen, die Flüssigkeit zuerst vorsichtig gleichmäßig mit einer Pipette zu mischen, um ein gleichmäßiges Infektionsniveau bei allen Mäusen zu gewährleisten.
   5. Nach 30 Minuten injizieren Sie vancomycin intravenös in die Gruppen II und IV pro Maus.
4. Evaluierung eines in vivo intrazellulären Infektionsmodells
   1. Bewerten Sie das intrazelluläre Infektionsmodell von Mäusen, indem Sie die Besiedlung der Nieren mit Bakterien zählen. Nach 24 Stunden Injektion betäuben Sie die Mäuse mit 3% Isofluran und opfern Sie sie durch Zervixluxation. Desinfizieren Sie sie in 75%igem Ethylalkohol.
   2. Immobilisieren Sie die Mäuse, heben Sie mit einer Hand die Bauchhaut mit einer Pinzette an, schneiden Sie mit der anderen Hand die Bauchhaut der Maus mit einer Augenschere ab, finden Sie die Nieren in der Bauchhöhle und entfernen Sie die Nieren vollständig. Stecken Sie sie in PBS.
   3. Geben Sie 1 ml PBS in das Gewebemahlröhrchen. Übertragen Sie die Nieren von jeder Maus in separate Mahlröhrchen und mahlen Sie, bis kein festes Gewebe mehr übrig ist. Gießen Sie das homogenisierte Gewebe in einzelne EP-Röhrchen und beschriften Sie jedes Röhrchen mit der entsprechenden Mauskennzeichnung.
   4. Verwenden Sie PBS, um das Gewebehomogenat seriell zu verdünnen. Jede Verdünnung auf separate TSA-Platten auftragen und über Nacht bei 37 °C inkubieren. Zählen Sie die Kolonien und analysieren Sie die Daten (Abbildung 5B).

Ergebnisse

Intrazelluläre Infektionsmodelle von S. aureus wurden sowohl in vitro als auch in vivo erfolgreich etabliert. Durch die Optimierung der experimentellen Bedingungen für die Phagozytose und die Verlängerung der Konzentration und Dauer der Antibiotikabehandlung überlebten einige S. aureus in den Makrophagen (Abbildung 1). Um die Antibiotikaresistenz von S. aureus weiter zu beurtei...

Diskussion

S. aureus kann als fakultativer intrazellulärer Erreger in verschiedene Zelltypen eindringen und dort überleben, wobei diese Fähigkeit genutzt wird, um Antibiotika und Immunantworten während einer Infektion zu umgehen³⁰. In dieser Studie wurde ein intrazelluläres Infektionsmodell von S. aureusin vivo etabliert, um eine Grundlage für die Untersuchung der intrazellulären Infektionsmechanismen des Erregers zu schaffen. Durch die Untersuchung ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plate	Corning Incorporated, USA	3524
4 % paraformaldehyde solutione	BBI, UK	E672002-0500
6-well plate	Corning Incorporated, USA	3516
Beef extract powder	BBI, UK	A600114-0500
Biohazard safety equipment	Heal force, China	VS-1300L-u
Cell incubator	ESCO, Singapore	CCL-170B-8
Cell scraper	Nest	710001
Centrifuge M1416R	RWD, China	M1416R
Centrifuge tube	Guanghou Labselect, China	CT-002-50A
Confocal laser scanning microscope (CLSM)	Zeiss, Germany	880
Confocal petri dish	Biosharp, China	BS-20-GJM
DAPI dye	Shanghai Beyotime, China	C1006
DIL working fluid	Shanghai Beyotime, China	C1991S
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Thermo Gibco, USA	C11995500BT
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SV30208.02
Gentamycin	Shanghai Sangon, China	B540724-0010
Incubator	Shanghai Hengzi, China	HDPF-150
Lysozyme	Beijing Solarbio, China	L9070
MRSA252	Third Military Medical University, China	null
MRSA252(GPF)	Third Military Medical University, China	null
Penicillin and Streptomycin	Shanghai Beyotime, China	C0222
Phosphate Buffer Solution	Shanghai Beyotime, China	ST476
Saline	Sichuan Kelun, China	null
Sodium chloride	Shanghai Macklin, China	S805275
Starch soluble	Shanghai Sangon, China	A500904-0500
Triton X-100	Shanghai Beyotime, China	P0096-100ml
Tryptic Soy Agar (TSA) plates	Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China	02-130
Tryptic Soy Broth (TSB) medium	Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China	02-102K
Tryptone	OXOID, UK	LP0042B
Vancomycin	Shanghai Beyotime, China	ST2807-250mg
RAW264.7 cell	USA, ATCC	null