Développement et évaluation de modèles d’infection intracellulaire pour Staphylococcus aureus

Résumé

Staphylococcus aureus (S. aureus) a la capacité de se disséminer dans tout le corps, provoquant des infections persistantes et récurrentes. Pour mieux comprendre ces processus, cette étude établit un modèle d’infection intracellulaire pour S. aureus. Ce modèle fournira une base cruciale pour étudier les mécanismes à l’origine des infections intracellulaires.

Résumé

S. aureus peut envahir et persister dans les cellules hôtes, y compris les cellules immunitaires, ce qui lui permet d’échapper à la détection et à l’élimination immunitaires. Cette persistance intracellulaire contribue aux infections chroniques et récurrentes, compliquant le traitement et prolongeant la maladie. Par conséquent, il existe un besoin critique d’un modèle d’infection intracellulaire pour mieux comprendre, prévenir et traiter les infections causées par S. aureus. Cette étude a indiqué que les antibiotiques éliminaient efficacement les bactéries extracellulaires, mais ne pouvaient pas éradiquer celles qui avaient pénétré dans les cellules. Ainsi, une infection intracellulaire stable in vitro a été établie par RAW264.7 infectés par S. aureus et co-cultivés avec des antibiotiques. Par la suite, un modèle d’infection intracellulaire chez la souris a été établi en injectant des macrophages péritonéaux contenant l’infection intracellulaire. La vancomycine a efficacement éliminé les charges bactériennes chez les souris confrontées à S. aureus planctonique ; Cependant, il s’est avéré inefficace contre les souris infectées par des niveaux égaux ou inférieurs de bactéries intracellulaires dans les macrophages péritonéaux. Cela indique que le modèle d’infection intracellulaire de S. aureus a été établi avec succès, offrant des informations potentielles pour la prévention et le traitement des infections intracellulaires.

Introduction

S. aureus est un agent pathogène très contagieux qui peut provoquer toute une série d’infections, notamment des infections de la peau et des tissus mous, une septicémie, une méningite, une pneumonie et une endocardite¹. L’utilisation abusive clinique des antibiotiques a conduit à une résistance accrue à S. aureus et à l’émergence de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM), qui constitue une menace importante pour la santé publique dans de nombreux pays².

Bien que S. aureus ne soit pas traditionnellement classé comme un pathogène intracellulaire, de nouvelles preuves suggèrent qu’il peut coloniser de manière persistante les cellules hôtes après l’invasion³. La capacité de S. aureus à survivre intracellulaire dans les phagocytes de l’hôte est de plus en plus reconnue comme un mécanisme qui facilite l’infection métastatique et la dissémination dans l’ensemble de l’hôte ^4,5,6. S. aureus sécrète divers facteurs de virulence, qui créent un environnement immunitaire qui favorise sa survie et complique la capacité de l’hôte à l’éliminer complètement⁷. Le régulateur de gènes accessoires (agr) et les éléments auxiliaires staphylococciques (Sae) sont deux régulateurs de virulence importants qui sont étroitement liés à la survie de Staphylococcus aureus dans les phagocytes ^8,9. Le système agr est un mécanisme de détection du quorum qui régule l’expression de nombreux facteurs de virulence chez S. aureus. Il contrôle la production de toxines et d’autres facteurs qui facilitent la survie et la dissémination des bactéries. Au cours de l’infection intracellulaire, le système agr joue un rôle essentiel dans la régulation des facteurs de virulence qui sont essentiels à la capacité de la bactérie à échapper aux réponses immunitaires de l’hôte et à survivre dans les cellules hôtes. Des études ont montré que le système agr influence la capacité de la bactérie à s’échapper des phagosomes et à persister dans les macrophages. L’absence d’agr peut entraîner une réduction de la survie bactérienne dans les cellules hôtes et une diminution de la virulence^10,11. Le système Sae est un système régulateur à deux composants qui contrôle l’expression de plusieurs facteurs de virulence chez S. aureus. Il est impliqué dans la régulation des toxines et des enzymes qui contribuent à la capacité de la bactérie à envahir et à endommager les tissus de l’hôte. Le système Sae joue également un rôle crucial dans la survie intracellulaire de S. aureus. Il influence la capacité de la bactérie à résister à la destruction par les phagocytes de l’hôte et à échapper à la dégradation autophagique^12,13.

Lorsque des agents pathogènes envahissent, les macrophages ont des fonctions phagocytaires, qui peuvent engloutir et tuer les agents pathogènes étrangers et activer la réponse immunitaire adaptative¹⁴. La plupart des bactéries envahissantes sont phagocytées par les macrophages, qui activent ensuite divers mécanismes de destruction pour les éliminer. Cependant, certaines bactéries S. aureus peuvent survivre dans les macrophages, entraînant une infection persistante de l’hôte. En plus des protéines bactériennes, l’hôte a également un impact sur la survie et la prolifération de S. aureus dans les macrophages en sécrétant des cytokines 15,16,17. Certaines études indiquent que S. aureus peut échapper à la dégradation en résidant dans les autophagosomes, créant ainsi une niche intracellulaire qui favorise la dissémination¹⁸. S. aureus échappe à la dégradation autophagique en bloquant le flux d’autophagie (par exemple, LC3-II, p62) et en augmentant le pH dans les autolysosomes après l’invasion des macrophages¹⁹. Cette évasion immunitaire est obtenue grâce à la régulation des facteurs de virulence de S. aureus et à l’autophagie, ce qui entraîne des infections persistantes et cachées.

L’élimination des infections intracellulaires de S. aureus est cruciale pour la gestion des infections persistantes et latentes dans la pratique clinique. À l’heure actuelle, les antibiotiques sont le traitement principal des infections à S. aureus, la vancomycine servant de dernière ligne de défense contre les infections à SARM^20,21. Cependant, de nombreuses études ont montré que les antibiotiques existants sont inefficaces pour éliminer S. aureus intracellulaire, à la fois in vivo et in vitro 22,23,24.

Il n’existe actuellement aucune norme unifiée pour les différents modèles d’infection intracellulaire de S. aureus 25,26,27, car les conditions de chaque modèle diffèrent considérablement. Par conséquent, les mêmes critères ne peuvent pas être appliqués pour évaluer l’efficacité de ces modèles. Dans cette étude, nous avons établi un modèle universel d’infection intracellulaire de Staphylococcus aureus en optimisant les conditions expérimentales. Ce modèle offre une plus grande commodité par rapport à d’autres, car il permet l’infection initiale des bactéries dans les cellules in vitro, suivie de l’administration de ces cellules infectées dans le corps.

Pour mieux comprendre les mécanismes de l’infection intracellulaire à S. aureus et développer des médicaments connexes, nous avons établi des modèles in vitro et in vivo . Un modèle d’infection intracellulaire stable a été créé avec succès in vitro en infectant RAW264.7 et en les co-cultivant avec des antibiotiques. Ensuite, les macrophages péritonéaux ont été extraits et formés en infections intracellulaires. Un modèle d’infection intracellulaire chez la souris a été établi en injectant ces macrophages péritonéaux.

Protocole

Des animaux de laboratoire, des souris femelles BALB/c exemptes d’agents pathogènes spécifiques (FPS) âgées de 6 à 8 semaines, ont été achetés auprès de Beijing HFK Bioscience Co., Ltd (Pékin, Chine). Toutes les études sur les animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique et de bien-être des animaux de laboratoire de la troisième université de médecine militaire et ont été réalisées conformément aux politiques et directives institutionnelles et nationales relatives à l’utilisation d’animaux de laboratoire. Les souris ont été gardées et vaccinées dans des installations SPF et ont eu accès gratuitement à de la nourriture et à de l’eau stériles. Les animaux ont été répartis au hasard en groupes et ont concédé un temps d’adaptation d’au moins 7 jours avant le début des expériences.

1. Préparation à S. aureus

1. Récupération de la souche : Obtenir un tube de MRSA252 congelé, cautériser et refroidir l’anneau d’inoculation pour obtenir un anneau de solution bactérienne, inoculer les bactéries sur des plaques de gélose tryptique de soja (voir le tableau des matériaux) selon la méthode de la plaque^{striée 28}, et cultiver pendant la nuit à 37 °C.
2. Activation bactérienne : Le lendemain, prendre une fiole agitée de 50 mL et ajouter 20 mL de bouillon de soja tryptique (voir le tableau des matières). Prélevez une seule colonie avec une pointe de pipette de 10 μL et ajoutez-la à l’agitateur. Incuber les colonies pendant la nuit à 220 tr/min, 37 °C.
3. Activation secondaire : Le lendemain, prendre une fiole agitatrice de 50 mL contenant 15 mL de milieu TSB. Retirer 200 μL de solution bactérienne de l’agitateur contenant les premières bactéries activées, les ajouter à un nouveau flacon contenant 20 mL de milieu TSB et incuber à 220 tr/min, à 37 °C pendant 4 h.
4. Recueillir la solution bactérienne activée secondaire dans un tube à centrifuger de 50 ml, centrifuger à 3 000 x g pendant 10 minutes et jeter le surnageant.
5. Remettre en suspension les bactéries précipitées dans 10 mL de solution saline et centrifuger à 3 000 x g pendant 10 min. Répétez cette étape 2 fois.
6. Mesurez la valeur OD600 de la solution bactérienne et ajustez-la à 1,0 avec une solution saline. À ce moment-là, la quantité bactérienne de MRSA252 dans cette expérience était de 1,0 x 10⁹ UFC/mL.
   REMARQUE : La solution bactérienne est ajoutée à un milieu sans antibiotiques et diluée à la concentration souhaitée ; Toutes les bactéries utilisées dans cette expérience ont été préparées par la méthode ci-dessus.

2. Mise en place d’un modèle d’infection intracellulaire in vitro

1. Préparation des cellules RAW264.7
   REMARQUE : Les lignées cellulaires utilisées dans cette étude ont été obtenues à partir de l’ATCC. Toutes les lignées cellulaires ont été testées négatives pour la contamination par les mycoplasmes. Toutes les expériences ont été réalisées sur des cellules en phase de croissance logarithmique.
   1. Retirez les cellules de l’azote liquide et décongelez-les dans un bain-marie à 37 °C.
   2. Placez les cellules RAW264.7 dans un tube à centrifuger de 15 ml, ajoutez 2 ml de milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM ; voir le tableau des matériaux) complété par 10 % de sérum fœtal bovin (voir le tableau des matériaux), de la pénicilline (100 unités/mL) et de la streptomycine (100 μg/mL ; voir le tableau des matériaux ; milieu complet) à 37 °C dans 5 % de CO₂. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min.
   3. Grainez 3 x 10⁶ cellules RAW264.7 dans des boîtes de 100 mm avec 10 mL de milieu complet. Conserver pendant 12 h dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C dans 5 % de CO₂ de sorte que la confluence des cellules soit entre 50 % et 60 %.
2. Infection intracellulaire in vitro
   1. Prenez 10 μL de suspension cellulaire et ajoutez-le au compteur de cellules pour calculer la concentration cellulaire. Compter et ensemencer 2 x 10⁵ cellules RAW264.7 dans une plaque de 24 puits (voir le tableau des matières) à l’aide de 1 mL de milieu complet pour chaque puits et le conserver dans un incubateur de culture cellulaire pendant 10 à 12 h.
   2. Retirer le surnageant et ajouter 1 mL de milieu complet contenant 2 x 10^{solution bactérienne de 6} UFC (étape 1.6) dans chaque puits. Placez-le dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 2 h. La multiplicité des infections MRSA252 infectées
      (MOI) est de 10. (Pour vérifier la corrélation entre diverses valeurs de multiplicités d’infection (MOI) et la phagocytose des bactéries par les cellules, nous avons établi des groupes expérimentaux avec des valeurs de MOI de 20, 30, 40 et 50.).
      REMARQUE : Le milieu complet utilisé pour infecter les cellules ne contient pas de pénicilline ni de streptomycine.
   3. Retirez le surnageant et lavez les cellules 2 fois avec du PBS (voir le tableau des matériaux). Ajouter 800 μL par puits de DMEM avec 100 μg/mL de gentamycine (voir le tableau des matériaux) et placer dans l’incubateur cellulaire à 37 °C dans 5 % de CO₂ pendant 2 h.
3. Évaluation d’un modèle d’infection intracellulaire in vitro
   1. Essai intracellulaire de destruction de S. aureus
      1. Collectez les cellules RAW264.7 (étapes 2.2.2 et 2.2.3) séparément dans des tubes à centrifuger. Lavez les cellules 2 fois avec du PBS, ajoutez 0,1 % de solution de Triton X-100 (voir tableau des matériaux) dans chaque tube pendant 5 min, et récupérez le lysat dans les tubes à centrifuger.
      2. Utilisez PBS pour diluer le lysat en série. Prenez 20 μL de lysat et ajoutez-les dans un tube de microcentrifugation contenant 180 μL de PBS, puis mélangez soigneusement par pipetage. Diluer étape par étape en suivant cette procédure. Repérez chaque dilution du lysat sur des plaques TSA et incubez pendant une nuit à 37 °C. Comptez les colonies sur les plaques TSA pour le lysat (figure 1A).
         REMARQUE : De plus, nous avons étudié les conditions expérimentales optimales pour l’infection intracellulaire des MRSA252 dans les macrophages péritonéaux. La charge bactérienne dans les macrophages péritonéaux infectés par la MRSA252 et traités avec des concentrations variables de gentamicine est illustrée à la figure 1B, tandis que la charge bactérienne après traitement avec 100 μg/mL de gentamicine pendant différentes durées est illustrée à la figure 1C.
      3. Diluer le surnageant et le lysat en série avec du PBS comme décrit à la section 2.3.1.2, et observer les colonies sur les plaques TSA pour le surnageant et le lysat (figure 2A).
   2. Microscope confocal à balayage laser (CLSM)
      1. Diluez les cellules RAW264.7 (étape 2.2) en 2 x 10⁵ cellules/mL sur une boîte de Pétri confocale (voir le tableau des matériaux) et placez-les dans un incubateur cellulaire pour une adhérence pendant la nuit à 37 °C dans 5 % de CO₂. Ajouter 1 mL de milieu complet contenant 2 x 10⁶ UFC et 4 x 10⁶ solution bactérienne (étape 1.6) dans chaque boîte de Pétri confocale et la placer dans l’incubateur cellulaire pendant 2 h, en faisant le MOI 10 et 20, respectivement.
      2. Retirez le surnageant et lavez les cellules 3 fois avec du PBS, ajoutez 100 μg/mL de gentamycine DMEM pendant 2 h et éliminez les bactéries extracellulaires. Retirez ensuite le surnageant et lavez les cellules 2 fois avec du PBS, ajoutez du liquide de travail DIL (voir le tableau des matériaux) et incubez à 37 °C pendant 5 min dans l’obscurité.
      3. Retirer le liquide de travail DIL et laver 3 fois avec du PBS, et fixer avec une solution de paraformaldéhyde à 4 % (voir le tableau des matériaux) pendant 20 min.
      4. Retirez la solution de paraformaldéhyde et lavez-la 3 fois avec du PBS, ajoutez le colorant DAPI (voir le tableau des matériaux) et incubez pendant 5 minutes dans l’obscurité. Retirez la solution de colorant DAPI et lavez-la 5 fois avec du PBS. Utilisez CLSM pour observer les cellules (Figure 2B).
         REMARQUE : Ce travail a été utilisé MRSA252 conçu avec une protéine fluorescente verte (GFP), qui a été construite à l’aide de la méthode de recombinaison homologue²⁹.

3. Mise en place d’un modèle d’infection intracellulaire in vivo

1. Acquisition de macrophages péritonéaux chez la souris
   1. Préparez un bouillon d’amidon à 6 %. Selon le rapport massique 3:10:5 (p/p), ajoutez successivement trois types d’excipients (poudre d’extrait de bœuf, tryptone, chlorure de sodium ; voir tableau des matériaux) dans le récipient en verre. Ajoutez 1 L de ddH₂O dans un récipient en verre, remuez pour faire fondre et chauffez au micro-ondes. Ajouter l’amidon soluble (voir tableau des matériaux) dans un rapport massique de 6, remuer pour faire fondre et s’assurer de laver le récipient en verre à 121 °C pendant 30 min. Conserver au réfrigérateur à 4 °C jusqu’à ce qu’il devienne une pâte.
   2. Prélevez les macrophages péritonéaux de souris en suivant les étapes décrites ci-dessous.
      1. Choisissez deux souris Balb/c. Utilisez la main gauche pour saisir le cou de la souris et contrôler la queue. Retournez la souris et laissez la tête vers le bas et l’abdomen vers le haut (Figure 3A). Administrer une injection intrapéritonéale de bouillon d’amidon à 6 %, 3 mL par souris (figure 3B).
         REMARQUE : En raison de la gravité, les organes de la cavité abdominale tomberont vers l’arrière de la poitrine, empêchant la seringue de blesser d’autres organes.
      2. Après 72 h, anesthésez les souris avec de l’isoflurane à 3 %, puis sacrifiez-les par luxation cervicale. Désinfectez-les avec de l’alcool éthylique à 75 %. À l’aide d’un ciseau ophtalmique, ouvrez l’abdomen de la souris afin d’exposer complètement son péritoine (figure 4A-C).
      3. Injecter 10 mL de milieu DMEM dans les souris pour laver la cavité abdominale par injection intrapéritonéale (figure 4D). Après avoir injecté du DMEM dans la cavité abdominale des souris, frottez doucement l’abdomen des souris pendant environ 1 minute pour laver l’abdomen plus en profondeur. À l’aide d’une seringue, recueillir le liquide de lavage dans un tube à centrifuger de 50 ml (figure 4E).
      4. Centrifuger le liquide de lavage à 300 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
      5. Utiliser 10 ml de DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal, de la pénicilline (100 unités/mL) et de la streptomycine (100 μg/mL ; milieu complet) pour souffler et aspirer les cellules recueillies, les compter et diluer la concentration cellulaire à 2 x 10⁶/mL et déposer une planche sur des plaques à 6 puits (voir le tableau des matières), 1 mL par puits.
      6. Placez la plaque 6 puits à 37 °C dans 5 % de CO₂, incubez pendant 4 h puis retirez le surnageant. Laver les cellules 2 fois avec du PBS stérile et les faire cultiver pendant la nuit avec 1 mL de DMEM par puits à 37 °C dans 5 % de CO₂.
2. Préparation de bactéries intracellulaires
   1. Incuber les macrophages péritonéaux (étape 3.1.2) avec MRSA252 pendant 2 h. Retirez le surnageant et lavez les cellules 2 fois avec du PBS. Ajouter le milieu complet DMEM avec 100 μg/mL de gentamycine (1 mL par puits) et incuber pendant 2 h à 37 °C dans 5 % de CO₂.
   2. Retirez le surnageant et lavez les cellules 3 fois avec du PBS. À l’aide d’un grattoir cellulaire, recueillir les macrophages péritonéaux de souris dans des tubes à centrifuger de 50 mL, puis centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Les bactéries intracellulaires de MRSA252 ont été préparées avec succès dans des macrophages péritonéaux.
   3. Pour le calcul des bactéries intracellulaires, aux macrophages péritonéaux infectés par la MRSA252 intracellulaire, ajouter du lysozyme (10 μg/mL, voir tableau des matériaux) à 37 °C pendant 10 min, puis laver avec du PBS 2x. Ensuite, ajoutez 1 mL de PBS pour remettre les cellules en suspension. Lyser les cellules en ajoutant 0,1 % de Triton X-100 pendant 5 min.
   4. Diluez la lyse avec des dilutions en série et déposez-la sur une plaque TSA. Culture toute la nuit à 37 °C. Calculez les bactéries intracellulaires de MRSA252 dans les macrophages péritonéaux, qui étaient de 1,8 x 10⁶ UFC par souris, en comptant les colonies bactériennes.
      REMARQUE : Lorsque le grattoir de cellules collecte des cellules, l’action doit être douce. Les cellules sont raclées dans une direction pour éviter la rupture des cellules, ce qui pourrait affecter l’expérience ultérieure.
3. Infection bactérienne intracellulaire chez la souris
   1. Divisez au hasard 20 souris Balb/c en quatre groupes (n = 5, Figure 5A).
   2. Pour le groupe I, injecter 3 x 10⁶ UFC de MRSA252 planctonique par souris par injection intraveineuse. Pour le groupe II, injecter 3 x 10⁶ UFC de MRSA252 planctonique et de vancomycine (110 mg/kg ; voir le tableau des matériaux) par souris par injection intraveineuse. Pour le groupe III, injecter les bactéries intracellulaires (préparées à l’étape 3.2) par injection intraveineuse. Pour le groupe IV, injecter par voie intraveineuse les bactéries intracellulaires (préparées à l’étape 3.2) et la vancomycine (110 mg/kg) par souris.
   3. Placez les souris sous la lampe de physiothérapie infrarouge jusqu’à ce que les veines de leur queue se dilatent.
   4. Injecter par voie intraveineuse 3 x 10⁶ UFC de MRSA252 planctonique par souris du groupe I et du groupe II. Injecter par voie intraveineuse les bactéries intracellulaires (préparées à l’étape 3.2) par souris du groupe III et du groupe IV.
      REMARQUE : Lorsque vous utilisez une seringue pour recueillir un liquide contenant des bactéries intracellulaires, il est recommandé de mélanger d’abord doucement et uniformément le liquide avec une pipette pour assurer des niveaux d’infection constants chez toutes les souris.
   5. Après 30 min, injecter par voie intraveineuse de la vancomycine aux groupes II et IV par souris.
4. Évaluation d’un modèle d’infection intracellulaire in vivo
   1. Évaluer le modèle d’infection intracellulaire de souris en comptant la colonisation des bactéries dans les reins. Après 24 h d’injection, anesthésier les souris avec de l’isoflurane à 3 % et les sacrifier par luxation cervicale. Désinfectez-les dans de l’alcool éthylique à 75 %.
   2. Immobilisez les souris, soulevez la peau abdominale avec une pince à épiler d’une main, coupez la peau abdominale de la souris avec des ciseaux ophtalmiques de l’autre main, trouvez les reins dans la cavité abdominale et dénudez complètement les reins. Mettez-les dans PBS.
   3. Ajouter 1 ml de PBS dans le tube de broyage des tissus. Transférez les reins de chaque souris dans des tubes de broyage séparés et broyez jusqu’à ce qu’il ne reste plus de tissu solide. Versez le tissu homogénéisé dans des tubes EP individuels et étiquetez chaque tube avec l’identification correspondante de la souris.
   4. Utilisez du PBS pour diluer en série l’homogénat de tissu. Placez chaque dilution sur des plaques TSA séparées et incubez toute la nuit à 37 °C. Compter les colonies et analyser les données (figure 5B).

Résultats

Des modèles d’infection intracellulaire de S. aureus ont été établis avec succès à la fois in vitro et in vivo. En optimisant les conditions expérimentales de phagocytose et en prolongeant à la fois la concentration et la durée du traitement antibiotique, une partie de S. aureus a survécu dans les macrophages (Figure 1). Pour évaluer davantage la résistance aux antibiotiques d...

Discussion

S. aureus, en tant qu’agent pathogène intracellulaire facultatif, peut envahir et survivre dans divers types de cellules, utilisant cette capacité pour échapper aux antibiotiques et aux réponses immunitaires pendant l’infection³⁰. Cette étude a établi un modèle d’infection intracellulaire de S. aureusin vivo afin de fournir une base pour l’étude des mécanismes d’infection intracellulaire de l’agent pathogène. En explorant l?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plate	Corning Incorporated, USA	3524
4 % paraformaldehyde solutione	BBI, UK	E672002-0500
6-well plate	Corning Incorporated, USA	3516
Beef extract powder	BBI, UK	A600114-0500
Biohazard safety equipment	Heal force, China	VS-1300L-u
Cell incubator	ESCO, Singapore	CCL-170B-8
Cell scraper	Nest	710001
Centrifuge M1416R	RWD, China	M1416R
Centrifuge tube	Guanghou Labselect, China	CT-002-50A
Confocal laser scanning microscope (CLSM)	Zeiss, Germany	880
Confocal petri dish	Biosharp, China	BS-20-GJM
DAPI dye	Shanghai Beyotime, China	C1006
DIL working fluid	Shanghai Beyotime, China	C1991S
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Thermo Gibco, USA	C11995500BT
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SV30208.02
Gentamycin	Shanghai Sangon, China	B540724-0010
Incubator	Shanghai Hengzi, China	HDPF-150
Lysozyme	Beijing Solarbio, China	L9070
MRSA252	Third Military Medical University, China	null
MRSA252(GPF)	Third Military Medical University, China	null
Penicillin and Streptomycin	Shanghai Beyotime, China	C0222
Phosphate Buffer Solution	Shanghai Beyotime, China	ST476
Saline	Sichuan Kelun, China	null
Sodium chloride	Shanghai Macklin, China	S805275
Starch soluble	Shanghai Sangon, China	A500904-0500
Triton X-100	Shanghai Beyotime, China	P0096-100ml
Tryptic Soy Agar (TSA) plates	Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China	02-130
Tryptic Soy Broth (TSB) medium	Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China	02-102K
Tryptone	OXOID, UK	LP0042B
Vancomycin	Shanghai Beyotime, China	ST2807-250mg
RAW264.7 cell	USA, ATCC	null