用于人粪便移植到无菌小鼠体内的生物排斥 IsoPositive 笼实验的制备和维持

摘要

该方案描述了在保持无菌条件下将无菌小鼠转移到实验性单笼隔离器 （isocage） 并饲养在其中的最佳实践。讨论了将粪便移植到无菌小鼠体内的方法以及从这些肠道“人源化”小鼠中收集活细菌以进一步应用。

摘要

无菌小鼠是了解微生物对宿主健康和疾病影响的重要研究工具，能够评估个体、确定的或复杂的微生物群在宿主反应中的特定作用。传统上，无菌小鼠饲养和实验作在柔性薄膜或半刚性隔离器中繁殖和饲养，成本高昂，并且需要大量训练有素的工作人员和动物饲养设施的大量空间占用。IsoPositive 笼系统允许在单独的、密封的正压隔离笼 （isocage） 中对无菌小鼠进行实验作，从而降低成本并在实验作中实现更大的灵活性。

在这里，描述了一种方案，用于将无菌小鼠从繁殖隔离器转移到等笼，然后粪便从人类供体粪便转移到小鼠中，以创造稳定的长期肠道“人源化”小鼠，用于未来的研究。描述了使用 isocage 系统所需的材料和准备工作，包括使用二氧化氯灭菌剂化学消毒剂清洁笼子、用品、设备和个人防护设备。讨论了确认转移小鼠无菌状态的方法以及如何确定笼子系统中的污染。进一步讨论了饲养程序，包括床上用品、食物和水供应。描述了人粪浆制备和灌胃到无菌小鼠中以产生肠道“人源化”小鼠的方案，以及粪便收集以监测这些小鼠的微生物群落组成。一项实验表明，人类粪便移植后两周允许供体微生物群在小鼠宿主中稳定定植，从而能够进行后续实验使用。此外，还描述了在活力保存培养基中收集人源化小鼠粪便，可用于进一步的功能实验。总体而言，这些方法允许在实验性 gnotobiotic 笼中安全有效地建立人源化小鼠群落，以便进一步作。

引言

无菌小鼠是微生物组研究人员的重要工具，可以剖析微生物群对宿主健康和疾病状态的贡献。无菌小鼠出生时完全不育，一生都保持无菌^{状态 1}。无菌小鼠与特定细菌菌株的定植使得这些分类群与代谢、免疫或其他宿主功能之间的致病研究成为可能 2,3,4,5。特别有利的是，它能够通过移植从人类供体获得的粪便，在微生物群水平上使无菌小鼠“人源化”，并且当饲养在屏障条件下时，可以防止小鼠衍生微生物的污染¹。这种方法在微生物组领域取得了许多重要发现，例如，人类肠道微生物组对癌症免疫治疗反应的影响 ^6,7,8。

然而，虽然人源化无菌小鼠对于微生物组领域的研究工作非常宝贵，但存在许多限制阻碍了这种方法的更广泛适应。无菌小鼠在半刚性或柔性薄膜大型隔离器中繁殖和维持，但功能实验需要设置单独的微型隔离器，一个微型隔离器容纳多个笼子，但只能在一种实验条件下。这种微型隔离器方法增加了空间占用和成本，同时严重限制了实验中可以研究的实验条件的数量和可以并行运行的实验数量。一个很有前途的解决方案是使用一种称为 ISOcage P 生物排斥系统（此处称为 isocage 系统）^的单独模块化笼养系统^9,10。等笼系统允许在单独的、密封的正压隔离器笼中对无菌小鼠进行实验作，从而在每个笼之间而不是每个微型隔离器之间实现单独的实验条件。通过适当的无菌技术，动物可以在无菌条件下在等笼中饲养长达 12 周，或通过人类粪便移植人源化，以用于任何兼容的实验方法（即，可以在无菌条件下进行）。使用 isocage 系统可以并行运行多个独立实验，与跨微型隔离器运行多个实验相比，空间占用和成本大大减少。

在柔性薄膜育种隔离器中培育无菌小鼠的目的是小心地保持轴系状态¹¹。用于监测无菌状态的技术包括小鼠体表和口腔的常规拭子，以及粪便样本的无菌收集，这些样本都是通过基于 PCR 的商业检测进行培养和检测的。这些样本的细菌、血清学和真菌检测都是确定无菌状态所必需的¹¹。当无菌小鼠从育种隔离器转移到等笼进行实验使用时，对小鼠进行拭子检测以验证其转移时的无菌状态。Isocage 无菌检查是通过无菌收集粪便样本进行的，然后培养这些样本以检测细菌、病毒和真菌污染物。仔细收集和记录从出生到实验方案结束的这些无菌检查的结果对于验证这些小鼠的无菌状态是必要的。

等笼系统由单个笼子（图 1）、用于从繁殖隔离器中运输的转运盘（图 1）和容纳笼子的等笼架（图 2）组成。每个等笼都包含一个安装在送风口上的笼式高效微粒空气 （HEPA） 过滤器和一个硅胶垫圈，该垫圈在关闭时形成气密密封，确保没有污染物可以通过空气进入笼子（图 1A）。当该笼盖倒置放置在灭菌的生物安全柜中时，可用作无菌工作表面（图 1A）。笼内的金属架用于存放食物和水瓶（图 1B）。在笼内高压灭菌的镊子用于所有需要与笼内表面接触的作。笼子本身有用于可拆卸笼卡架的槽口，用于识别外部的动物以及对接到等笼架的进气口和出口喷嘴（图 1C-E）。当笼子准备重新对接到机架系统上时，安全的闭合夹和盖子上的卡舌锁会密封笼子（图 1F）。建议的床上用品是 Alpha-dri，还建议使用可高压灭菌的富集小屋（图 1F）。转移盘用于将无菌小鼠从繁殖隔离器移动到等笼，并包含一个带有三角形开口的可旋转隔室盖，以允许对动物进行作（图 1G-H）。椎间盘有小号（直径 21.6 厘米）和大号（直径 28 厘米）之分，两者的容量均为 8 只小鼠。高压灭菌胶带用于在圆盘的圆周和气孔上形成气密密封，这是在用灭菌剂浸泡并装在消毒剂浸泡的袋子中运输之前进行的（图 1I）。机架系统本身有一个屏幕，用于监控鼓风机、机架级 HEPA 过滤器状态和机架的应急电池电源，这些都是系统包含的功能（图 2A）。封闭的 Magnehelic 仪表显示笼系统保持的正压，自动视觉对接指示器显示笼的对接状态（黄色选项卡退出表示没有笼对接，或对接不成功）（图 2B-D）。作等笼还需要一个标准认证的生物安全柜。

这里介绍的方案描述了在无菌条件下将无菌小鼠从繁殖隔离器成功转移到等笼子，同时保持无菌状态的正确方法，用人类供体粪便浆将无菌小鼠人源化，以及从饲养在等笼中的小鼠收集粪便，以确认无菌状态或保存活力以进行进一步的功能研究。在这个例子中，无菌小鼠用来自接受肺癌免疫疗法治疗的人类受试者的混合粪便样本进行人源化，并被分为对治疗有反应或无反应的小鼠。在这种情况下，对免疫治疗反应的反应表型通过肠道微生物群人源化转移到受体小鼠，然后受体小鼠可以进一步接种肿瘤细胞并接受免疫治疗。人类粪便浆液方案可以很容易地适应任何人类供体粪便或研究者希望的任何疾病临床前模型。使用该方案，可以将任何人类粪便供体微生物群转移到无菌宿主中，从而能够进一步研究微生物群在健康和疾病中的作用。

图 1：等笼和传输盘的示意图。 （A） 笼盖底面的自上而下的视图，标签指示笼式内部 HEPA 过滤器和硅胶垫圈密封件的位置。（B） 笼子内部的自上而下的视图，标签上标明了金属丝杆盖、内部水瓶和喷口，以及金属丝架中用于存放可高压灭菌食物的位置。（C） 笼子的前视图，显示笼卡持有人的槽口。（D） 顶部盖子的装满笼子的自上而下视图，显示了 HEPA 过滤器如何安装在进气喷嘴上。笼子的后视图显示了对接到等笼架系统的进气口和出口喷嘴。（F） 顶部盖满笼的侧视图，标签指示安全闭合夹处于打开位置，每个夹子上都有白色标签将其锁定到位。笼子的内部显示底部分层的 Alpha-dri 床上用品，建议的充实小屋放置在床上用品中。（G） 顶部带盖的传输盘的自上而下视图。（H） 转移盘内部的自上而下视图，显示了带有三角形开口的可旋转隔室盖，以便对动物进行作。（I） 完全组装的转移盘的侧视图，显示高压灭菌胶带的位置，在从繁殖隔离器转移到等笼期间形成气密密封。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：等笼式机架系统示意图。 （A） 完整的等式机架，笼子对接，标签指示鼓风机状态、HEPA 过滤器状态和应急电池的监控屏幕。机架左下侧是机架级 HEPA 过滤器的插槽。（B） 随附的 Magnehelic 真空计，显示机架保持的正压。（C） 对接的等笼，没有可见的黄色对接指示灯，表明机架和空气喷嘴之间连接成功。（D） 机架上的空槽，带有可见的自动视觉对接指示器，指示没有机架就位，并且空气喷嘴没有与等笼连接。 请单击此处查看此图的较大版本。

研究方案

所有动物实验均已获得佛罗里达大学 （UF） 机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准，并在 UF 动物护理设施（IACUC 协议 #IACUC202300000005）进行。无菌野生型 （GF WT;C57BL/6） 小鼠由 UF Animal Care Services Germ-free Division 在隔离器中饲养和维持。将混合性别 GF WT 小鼠从育种隔离器中转移并放入 ISOcage P 生物排斥系统中，以允许微生物作。

人类粪便样本来自一项前瞻性观察性研究，该研究收集了接受免疫检查点抑制剂 （ICI） 治疗的患者的纵向粪便样本¹²。在 Advarra IRB （MCC#18611， Pro00017235） 批准研究后获得患者的知情同意。受试者接受并完成了液体牙科运输培养基 （LDTM） 粪便采集套件，旨在保留细菌活力以进行功能研究。反应评估将 n=4 样本表征为反应者 （R），n=6 为无反应者 （NR）。将匀浆的 LDTM 保存的患者样品单独解冻，每个样品放入厌氧室中不超过 90 秒，并按反应表型 （R： n = 4，NR： n = 6） 合并。然后将混合样品等分并在 -80 °C 下冷冻以用于本方案。为了确定供体粪便的厌氧菌落形成单位 （CFU） 计数，将每个受试者的粪便连续稀释至 1 × ^10-5， 并将每种稀释液 10 μL 接种在厌氧脑心输注 （BHI） 和 Luria Bertani （LB） 琼脂平板上，每克粪便的 CFU 计数估计。将来自每个受试者的相等 CFU 混合到粪便接种物样本中，以便强饲到小鼠中。

1. 笼子的准备和高压灭菌

1. Isocage 制备
   1. 用 ~500 mL 的 2018SX 饮食或任何所需的强化可高压灭菌饮食预填充笼子，并用 ALPHA-dri 垫料分层底部。将可高压灭菌的浓缩小屋放入笼床中。将空的、未密封的水瓶和喷嘴以及长宽尖镊子放在金属丝架的顶部。
   2. 在每个高压灭菌周期的一个笼子内将双物种生物指示剂放入食物中。将化学积分条放在每个笼子的外部。
   3. 将笼子在 121 °C 和至少 15 PSI 的真空循环中高压灭菌 45 分钟，然后干燥 30 分钟。使用国际标准化组织 （ISO） 去污架对笼子进行消毒，该架子允许笼子保持密封并让蒸汽通过内部 HEPA 过滤器，该过滤器保持无菌环境，直到笼子打开。
   4. 用饮用水填充 1 L 瓶子，用橡胶盖密封，并在瓶子表面放置化学集成条。在 121 °C 和至少 15 PSI 下高压灭菌 45 分钟，使用液体的缓慢排气程序。
   5. 目视检查贴在每个笼子上的化学积分器，以便立即验证适当的高压灭菌器参数。
      注意：在无菌条件下，首次打开等笼时必须去除生物指示剂。将生物指示剂在 37 °C 下孵育 24 小时，并观察任何颜色变化。从原来的蓝色/紫色透明溶液到黄色或浑浊液体的鲜艳颜色变化表明存在微生物生长。如果指示剂保持透明和蓝色/紫色，则确认了在该高压灭菌周期中笼子内部完全无菌。

2. 二氧化氯灭菌剂制备

注意： 二氧化氯灭菌剂一旦激活，具有极强的腐蚀性。活性二氧化氯灭菌剂在活化剂与碱混合后 24 小时过期。二氧化氯灭菌剂会产生烟雾，对粘膜表面有刺激性，与皮肤接触时会引起刺激。确保用于消毒剂制备的房间有水槽和适当的通风。使用二氧化氯消毒剂时，除了动物饲养设施所需的个人防护设备 （PPE） 外，还应佩戴护目镜、呼吸器和耐化学手套。

1. 混合碱和活化剂
   1. 要制备标准 6 L 体积的二氧化氯消毒剂，首先在 1 L 量筒中测量 1 L 二氧化氯消毒剂基质，然后倒入 20 L 容量的浸泡罐中。
   2. 使用相同的量筒测量 4 升自来水并将其倒入浸泡罐中。
   3. 将用于底座和水的量筒放在一边。使用新的量筒测量 1 L 二氧化氯消毒活化剂，然后将其倒入灌篮罐中。
   4. 将活化剂添加到罐中后，使用量筒混合罐中的内容物。
2. 激活
   1. 将盖子盖在灌篮罐上，将其标记为二氧化氯灭菌剂，并注明添加活化剂的日期和时间以及制备它的工作人员的姓名。如果需要，可以使用用于混合灭菌剂的量筒将 1 L 转移到喷雾瓶中。
   2. 将灌篮罐和喷雾瓶移至 Isocage 机架和笼子所在的动物饲养室。活性二氧化氯灭菌剂在使用前必须静置至少 20 分钟，以确保完全激活。
      注意：对于作大量笼 （>9），可以在灌篮罐中一次准备多达 12 L。为了作 1 个笼子或在紧急情况下，可以在较小的容器中制备 1.2 L 二氧化氯灭菌剂，然后转移到 2 个 1 L 喷雾瓶中。建议在预期转移无菌小鼠前至少 1 小时准备灭菌剂。

3. 灭菌

1. 唐个人防护装备
   1. 作为主要的笼子纵器，戴上安全护目镜、呼吸器、耐化学手套、无菌手术衣、蓬松器、袖套和鞋套。在 PPE 下面穿上磨砂膏，因为织物与二氧化氯消毒剂的任何接触都会导致大面积染色。
   2. 建议使用主笼机械手的助手。让助手穿戴与主要笼式纵器相同的个人防护装备，尽管他们可能穿着未消毒的手术衣。
2. 准备生物安全柜
   1. 将 10 块湿巾放入二氧化氯消毒浸泡罐中，并确保它们完全浸泡。
   2. 将浸泡过的湿巾移入生物安全柜中，并按照以下顺序从后到前浸泡柜的所有表面：平坦的工作表面、左侧、通风柜背面、右侧和前内部玻璃。通过将湿巾挤压在这些表面而不接触它们，对生物安全柜的未受保护表面进行非接触式浸泡。
   3. 一轮清洁后，将湿巾放回二氧化氯消毒浸泡罐中浸泡。
3. 准备等笼
   1. 使用量筒装满至少 100 mL 的二氧化氯消毒剂，准备一个大塑料袋，然后摇晃袋子以确保所有内表面都被浸泡。将袋子放在任何平坦的表面上。
   2. 从架子上取下一个等笼，将其放入二氧化氯消毒剂浸泡罐中，使笼子的每个表面都与液体接触。使用水箱中浸湿的湿巾进一步擦洗笼子表面，以确保液体完全接触。
   3. 浸泡笼子后，让助手打开浸湿的塑料袋。将笼子放入袋子中，并让助手立即关闭开口。使用喷雾瓶用二氧化氯消毒剂喷洒袋口。对要使用的每个笼子都遵循此程序;一个 36 英寸 32 英寸 48 英寸的袋子中最多可以装四个笼子。
   4. 根据需要将尽可能多的消毒过的 1 L 水瓶（1 L 水用于 2 个笼子）浸入二氧化氯消毒剂浸泡罐中，然后将它们放入另一个浸泡过的塑料袋中。将所有用品放入袋子中后，关闭袋子并使用喷雾瓶用二氧化氯消毒剂喷洒袋口。
   5. 将所有笼子和用品装袋后，将耐化学腐蚀的手套浸入二氧化氯消毒剂中（尽可能靠近手套，不要到达开口）。
4. 20 分钟灭菌期
   1. 完全灭菌需要至少 20 分钟的液体接触时间。最后一件物品消毒完并且塑料浸泡袋关闭后，让助手设置 20 分钟的计时器。确保在计时器启动后，耐化学腐蚀手套不要接触任何未浸泡有二氧化氯消毒剂的表面。
   2. 反复执行生物安全柜灭菌过程（步骤 3.2），直到计时器指示 20 分钟已过去。
   3. 让助手经常摇晃浸湿的塑料袋的外表面，以确保液体与笼子和内部的瓶子表面一致接触。
   4. 20 分钟后，让助手打开浸湿的塑料袋，露出消毒过的笼子和水瓶，注意只接触袋子的外表面。
   5. 使用经过灭菌的耐化学手套，将每个笼子和瓶子移至经过灭菌的生物安全柜中。如果笼子太多而无法放入生物安全柜，请将剩余的笼子留在塑料袋中，因为只要塑料袋的开口关闭并在每个开口之间浸泡二氧化氯消毒剂，它们就会保持无菌状态。

4. 无菌小鼠转移

1. 准备等笼
   1. 要打开密封的等腔，请提起盖子侧面两个夹子上的白色卡舌，然后向侧面拉出每个夹子。盖子必须离开笼子的底部，以便将盖子从笼子上提起。将盖子倒置在笼子的左侧，并将其用作无菌工作站。
      注意：使用笼盖或高压灭菌器械袋内部作为无菌工作台面的替代方法是使用高压灭菌的窗帘，这提供了更大的表面积，并防止在出错时意外污染笼盖。
   2. 使用金属丝架顶部笼内的无菌镊子，取出空水瓶并将其放在盖子内侧。取下橡胶密封圈打开 1 L 水瓶，然后将水倒入水瓶中以装满水。使用镊子将喷嘴放在水瓶上，然后用力按下以密封。
   3. 使用无菌镊子提起金属丝架并将其向后放置几英寸，以便在笼子底部留出一个开口。将无菌镊子放在金属丝架上，确保手柄不接触笼子表面。
2. 使用传输盘
   注意：训练有素的无菌工作人员负责饲养隔离器的保养和维护。考虑到与打开繁殖隔离器相关的风险，这些工作人员会进行转移盘灭菌、制备以及将无菌小鼠从隔离器转移到等笼。为了简要描述该过程，在可高压灭菌的圆筒中准备转移盘以进行灭菌。生物指示剂用于验证其无菌性。用于密封传输盘的胶带也在圆筒内高压灭菌。封闭这些材料的无菌圆筒通过传输套连接到隔离器，小鼠从笼子移动到圆盘上。然后将盖子放在圆盘上，并使用高压灭菌胶带在圆盘的圆周和气孔上形成气密密封。密封的圆盘立即放置在隔离器的出口中。然后关闭家用隔离器的端口盖，用消毒剂彻底擦拭圆盘外部，并将其放入浸泡过消毒剂的袋子中，监测 20 分钟以确保完全净化。然后，无菌饲养人员将这些圆盘交给研究人员。从转移盘密封后，小鼠不能在密封盘中保存超过 30 分钟，因此必须在转移盘到达之前有足够的时间完成本协议中的所有先前步骤。
   1. 收到传输盘后，让助手握住并部分解开塑料盖，以便暴露出传输盘的浸泡表面，但助手不会触碰。
   2. 收到传输盘后，让助手握住并部分解开塑料盖，以便暴露出传输盘的浸泡表面，但助手不会触碰。
   3. 戴上浸泡在二氧化氯消毒剂中的耐化学手套，从塑料包装中取出转移盘，注意不要触摸任何未浸泡在消毒剂中的表面。然后，将转移盘放在灭菌生物安全柜的平面上。
   4. 要打开转印盘，请撕下胶带，密封转印盘圆周，然后将其丢弃在生物安全柜外。取下转移盘的盖子，将其丢弃在生物安全柜外。
   5. 传输盘内部是一个可旋转的隔室盖，只有一个开口。使用先前放在笼子金属架上的无菌镊子作此隔室盖，将开口移动到转移所需的鼠标上。
3. 将小鼠从圆盘转移到 isocage
   1. 使用镊子，通过塑料盘盖上的开口抓住鼠标尾巴的底部，然后通过之前在金属丝架和笼子之间打开的空间将鼠标抬起并转移到等笼中。对发往该笼子的所有老鼠重复上述步骤。
   2. 将所有小鼠转移到该等笼后，使用镊子更换金属丝架。然后，提起笼盖并使用镊子将其放回笼子顶部。
   3. 向上提起笼盖的每个夹子，然后小心地降低笼子的侧面，然后向下推白色卡舌以密封笼盖。
   4. 笼子密封后，让助手用二氧化氯消毒剂喷洒笼架上对接位置的每个喷嘴。然后，从引擎盖上取下笼子并将其交给助手，然后助手可以将笼子对接在机架上。
   5. 对传输磁盘中的每个鼠标重复这些步骤。
4. 清理生物安全柜
   1. 完成所有小鼠转移到等笼后，清空通风橱中的所有碎屑，并用二氧化氯消毒剂浸泡的湿巾完全擦拭。
   2. 用异丙醇擦拭罩，去除残留的二氧化氯消毒剂。通风橱工作表面下方的空间收集了灭菌过程中的大量灭菌剂。通过吸收用干纸巾去除，然后用异丙醇擦拭。
   3. 活化后 24 小时通过水槽排水管处理液态二氧化氯消毒剂。将被消毒剂污染的固体材料作为普通废物处理。
      注意：转移至等笼条件的无菌小鼠放置 1 周以适应任何干预前的新环境。这减少了动物所承受的压力，这可能会干扰研究结果。在这 1 周的适应期结束时，按照步骤 6 中的说明收集粪便，以在进行任何干预之前确认无菌状态。

5. 将人粪浆口服灌胃到无菌小鼠中

1. 准备高压灭菌的管饲用品
   1. 在口服强饲法程序前 1 天，将口服管饲针头放入自密封灭菌袋（每只小鼠 1 个）中，将无菌 1 mL 注射器放入自密封灭菌袋（每只小鼠 1 个）中。将这些和 600 mL 聚丙烯烧杯（每只小鼠 1 个）和一对长镊子放入高压灭菌器安全袋中，并通过高压灭菌器进行消毒。
   2. 从高压灭菌器中取出袋子后，立即用包装胶带密封袋子并存放至第二天。
2. 制备人粪浆
   1. 在管饲法当天，将匀浆并储存在厌氧保存培养基（在本例中为液体牙科运输培养基）中的人类粪便从-80°C冰箱转移到厌氧室中。在 10 mL 锥形管中的无菌厌氧盐水溶液中，以约 1：10 的比例稀释均质粪便材料。
   2. 用封口膜密封含有人粪浆的试管，涡旋匀浆，然后以 200 g 离心 5 分钟以沉淀颗粒。
   3. 将试管放回厌氧室中，并将上清液转移到另一个 10 mL 锥形管中。用封口膜密封含有人粪便上清液的试管，将其从厌氧室中取出，并将其放入二级防漏容器中。将容器与高压灭菌的管饲用品袋一起运输到动物饲养处。
      注意：出于报告目的，必须估计用于管饲的人类粪便的总 CFU/mL。目前尚不清楚确保充分定植的最小 CFU 负荷是多少，但较高的 CFU 导致供体粪便更好地植入¹³。如果人类粪便物质的 CFU 负荷导致植入率低，请重新收集人类粪便标本。使用活性保存培养基将促进从收集的粪便标本中回收 CFU。为了确定供体粪便的厌氧/需氧 CFU 计数，将样品连续稀释至 1 x ^10-5 ，并将每种稀释液 10 μL 接种在需氧和厌氧 BHI 和 LB 琼脂平板上，一式两份。24 小时（需氧）和 48 小时（厌氧）后，计算每克粪便的 CFU。
3. 准备等笼
   1. 重复步骤 2 和 3，现在唯一的区别是这些笼子里饲养了老鼠，应注意确保在移除架子后 30 分钟内，将每个等笼放入消毒罩中，并打开盖子通风以允许气流流向小鼠。
   2. 通过二氧化氯消毒剂饱和对步骤 5.1 和 5.2 中高压灭菌的管饲管和人粪浆管进行消毒，其方式与水瓶类似（即，将它们浸入消毒剂中，然后将它们放入消毒剂浸泡的袋子中）。
   3. 完成 20 分钟的灭菌期后，将等笼和口服强饲法用品转移到生物安全柜中。将袋子推向里面的长镊子，刺穿高压灭菌的供应袋，然后取出供应袋并将袋子丢弃在引擎盖外。
4. 管饲法
   1. 穿上新的无菌手术衣和无菌手术手套代替耐化学手套，以防止残留的二氧化氯消毒剂与小鼠接触。如果需要，请让助手在此过程中提供帮助。
   2. 通过打开每个灭菌袋的包装来准备管饲针，并将袋子的内部用作干燥、无菌的静置表面。将管饲针连接到每个注射器上，打开粪浆管，然后将 200 μL 粪便浆液拉入每个注射器中。
   3. 使用镊子抓住笼子中一只老鼠的尾巴底部，并将其放在金属架上。通过擦伤轻轻地束缚鼠标，在将鼠标保持在直立垂直位置的同时，插入针头并轻轻注入粪便浆液，然后立即取出针头。
   4. 将鼠标直接放入其中一个消毒杯中进行观察。对笼子里的每只老鼠重复这个过程。在所有小鼠接受管饲法后，使用镊子将每只小鼠移回笼床并按照步骤 4.3.2-4.3.4 中的说明密封笼子。
      注意：如果使用两个或多个单独的粪便浆，则需要对生物安全柜和所需的笼子和材料进行完全重新灭菌。在一组小鼠保持无菌的情况下，建议这些小鼠在治疗任何其他组之前接受对照管饲法。
   5. 按照步骤 4.4 中的程序处理二氧化氯灭菌剂和消毒剂浸泡的材料。将任何被人类粪便浆液污染的材料作为生物医学废物处理，并根据环境健康和安全程序进行处理。

6. 从人源化小鼠收集粪便以保持活力

1. 准备高压灭菌备件
   1. 将短宽尖镊子放入自密封灭菌袋（每只小鼠 1 个）、600 mL 聚丙烯烧杯（每只小鼠 1 个）和一对长镊子中，放入高压灭菌器安全袋中，并在粪便收集程序前 1 天通过高压灭菌器进行消毒。
   2. 从高压灭菌器中取出袋子后，立即用包装胶带密封袋子并存放至第二天。
2. 保存培养基管制备
   1. 选择厌氧活力保存培养基（此处使用 Cary Blair）。将 1 mL 保存培养基分装到生物安全柜中的 2 mL 无菌螺旋盖试管中。建议使用 1：10 粪便：培养基的比例以实现最佳保存。
   2. 用永久性标记物预先标记每根试管，但请注意，暴露于二氧化氯灭菌剂会去除塑料表面的永久性标记物标签。另一种方法是不标记试管，并在冷冻前立即在采集后立即让辅助标记试管。
   3. 将这些试管放在标准聚丙烯试管架中，以便试管直立存放，同时仍可通过接触二氧化氯灭菌剂进行灭菌。
3. 消毒笼和生物安全柜
   1. 重复步骤 2 和 3 对等笼和生物安全柜进行消毒。同样，注意确保在移除机架后 30 分钟内，将每个等笼放入消毒罩中，并放空盖子以允许气流流向小鼠。
   2. 此外，通过二氧化氯灭菌剂饱和对装有准备好的试管的高压灭菌供应袋和架子进行消毒，并将它们放入装有笼子的浸泡塑料袋中。目标是与每根试管的所有表面和试管架本身完全接触液体。
4. 粪便样本采集和储存
   1. 完成 20 分钟的灭菌期后，将等笼、高压灭菌的用品和试管架转移到生物安全柜中。将袋子推向里面的长镊子，刺穿高压灭菌的供应袋，取出供应袋并将袋子丢弃在引擎盖外。
   2. 穿上新的无菌手术衣和无菌手术手套代替耐化学手套，以防止残留的二氧化氯消毒剂与小鼠接触。如果需要，请让助手协助此过程。
   3. 通过解开袋子并将袋子内部表面用作无菌区域来准备钝头镊子。将试管架放在生物安全罩的表面。
   4. 使用长镊子抓住笼子中一只老鼠的尾巴根部，然后将它们直接放入其中一个消毒杯中进行观察。对笼子里的每只老鼠重复这个过程。
   5. 观察小鼠，直到产生至少两个新鲜排出的粪便颗粒。
      1. 使用钝头镊子，吸取粪便颗粒并将其直接放入管中。立即密封螺帽盖并将其交给助手。
      2. 让助手标记试管并立即通过涡旋使粪便均质化。均质后，在液氮中快速冷冻试管，并在 -80 °C 下长期储存。
   6. 对笼子中的每只老鼠重复粪便收集过程。收集粪便后，将每只鼠标放回家笼中，然后将笼子重新插接在它们的机架上。重复步骤 4.4 清洁引擎盖并处理废物。

结果

将按 ICI 反应者和非反应者表型 （先前在方案中描述） 合并的人类粪便样本灌胃到每组 3 个等笼中的混合性别 GF-WT 小鼠中 （n = 1-2 只小鼠/笼，n = 6 为反应者，n = 5 为无反应者）。小鼠在转移后适应 1 周。然后从这些小鼠中收集粪便样本（无菌条件）。然后用 1 × 10⁷ CFU 的反应者或无反应者混合的人类粪便管饲小鼠。然后在灌胃后 1 、 2 和 4 周收集粪便。粪便样?...

讨论

此处描述的协议为饲养在实验等笼中的无菌小鼠的人源化提供了一种可重复的、高度详细的方法。将人类受试者的粪便群落专门移植到小鼠宿主中的能力对于微生物组研究非常宝贵。如果没有小鼠特异性共生微生物群的污染，可以研究人类驻留细菌对各种健康和疾病状态的影响，或者饮食或药物管理等干预措施对人类微生物群的影响 16,17,18。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL BD Slip Tip Syringe sterile, single use	Fisher Scientific	309659
2.0 mL Screw Cap Tube, NonKnurl,Skirted,Natural, E-Beam Sterile tube w/ attached cap	Fisher Scientific	14-755-228
36 x 32 x 48" 3 Mil Gusseted Poly Bags	Uline	S-13455
5 gallon tank of Exspor chlorine-dioxide sterilant activator	Ecolab	6301680
5 gallon tank of Exspor chlorine-dioxide sterilant base	Ecolab	6301194
600 mL polypropylene beakers	Fisher Scientific	S01914
ALPHA-dri bedding	Shepherd Specialty Papers
Anaerobic chamber	Coy Lab Products	Type B
Biosafety cabinet class 2	Nuaire
Certified IsoCage autoclavable HEPA filter XT Extreme Temperature	Tecniplast	1245ISOFHXT
Clear Lens LPX IQuity Safety Goggles	Fastenal	922205455
DuPont Tyvek Sleeve - 18"	Uline	S-13893E
DWK Life Sciences DURAN 45 mm Push-on Natural Rubber Cap	Fisher Scientific	01-258-107	Rubber cap for 1 L autclave bottles
Dynalon Quick Mist HDPE Sprayer Bottles	Fisher Scientific	03-438-12B
Fisherbran Polypropylene Graduated Cylinders	Fisher Scientific	03-007-44
Fisherbran Dissecting Blunt-Pointed Forceps	Fisher Scientific	08-887
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches	Fisher Scientific	01-812-51
Fisherbrand Straight Broad Strong Tip General Application Forceps	Fisher Scientific	16-100-107
Fisherbrand lead Free Autoclave Tape	Fisher Scientific	15-901-110
Gavage needle, reusable stainless steel. Straight. 22 gauge needle, tip diameter 1.25 mm, length 38 mm or 1.5 inches(doz)	Braintree Scientific	N-PK 020
H-B Instrument Durac Timer	Fisher Scientific	13-202-015
IsoPositive Cages and Rack (i.e. isocages)	Tecniplast	ISO30P	30 cages (6 w x 5 h), single sided
Nitrile Chemical Resistant Gloves Size S (7), M (8) or L (9) 18” long, 22 mil, Ansell	Grainger	4T426
Nitrile Exam Gloves, Medium, Non-Sterile, Powder-Free	MedSupply Partners	KG-1101M
Olive / Magenta Bayonet Gas & Vapor Cartridges / Particulate Filter 2Ct	3M/Fastenal	50051138541878
Polycarbonate RadDisk Mini for Mice 8-75 x 4	Braintree Scientific	IRD-P M
Polypropylene Bouffant Caps - 24", Blue	Uline	S-10480BLU
Puritan Cary-Blair Medium, 5 mL	Fisher Scientific	22-029-646
S, M and L Blue Silicone Dual-Mode Head Harness Half Mask Respirator	3M/Fastenal	50051131370826
Sgpf Series Sterile Powder Free Latex Gloves, CT International, Thickness = 6.5 mm, Length = 30.5 cm (12), Glove Size = 8.5, Glove Color = White	Fisher Scientific	18-999-102F
Skid Resistant Shoe Cover	Uline	S-25639
Surgical Gown, Towel, Sterile, Large, 32/cs	Thomas Scientific	KIM 95111
Teklad Global 18% protein extruded rodent diet (sterilizable)	Inotiv	2018SX
Thermo Scientific Nalgene Heavy-Duty Rectangular LLDPE Tank with Cover (20 L volume)	Thermo Scientific	14-831-330J
VERIFY Dual Species Self Contained Biological Indicators	Steris Healthcare	S3061
WypAll L40 1⁄4 Fold Wipers	Uline	S-8490