Preparazione e mantenimento dell'esperimento in gabbia isopositiva per bioesclusione per il trapianto fecale umano in topi privi di germi

Riepilogo

Questo protocollo descrive le migliori pratiche per il trasferimento e l'alloggiamento di topi privi di germi in isolatori sperimentali a gabbia singola (isocage) mantenendo condizioni sterili. Vengono discussi i metodi per il trapianto fecale in topi privi di germi e la raccolta di batteri vitali da questi topi "umanizzati" intestinali per ulteriori applicazioni.

Abstract

I topi privi di germi sono un importante strumento di indagine per comprendere il contributo dei microrganismi nella salute e nella malattia dell'ospite, consentendo la valutazione del ruolo specifico di individui, gruppi definiti o complessi di microrganismi nella risposta dell'ospite. Tradizionalmente allevati e allevati in isolatori a film flessibile o semirigidi, l'allevamento di topi privi di germi e la manipolazione sperimentale sono costosi e richiedono un numero elevato di personale qualificato e un ampio ingombro nelle strutture di stabulazione degli animali. Il sistema di ingabbiamento IsoPositive consente la manipolazione sperimentale di topi privi di germi in gabbie isolatrici a pressione positiva (isocage) individuali, sigillate ermeticamente, riducendo i costi e consentendo una maggiore flessibilità nelle manipolazioni sperimentali.

Qui, viene descritto un protocollo per il trasferimento di topi privi di germi da isolatori di riproduzione a isogabbie e il successivo trasferimento fecale dalle feci del donatore umano ai topi per creare topi stabili e "umanizzati" intestinali a lungo termine per studi futuri. Vengono descritti i materiali e la preparazione necessari per l'utilizzo del sistema isocage, compreso l'uso di sterilizzante chimico sterilizzante al biossido di cloro per pulire gabbie, forniture, attrezzature e dispositivi di protezione individuale. Vengono discussi i metodi per confermare lo stato privo di germi dei topi trasferiti e come determinare la contaminazione nel sistema di ingabbiamento. Viene ulteriormente discussa la procedura per l'allevamento, comprese le lettiere, il cibo e l'approvvigionamento idrico. Vengono descritti il protocollo per la preparazione di liquame fecale umano e la sonda in topi privi di germi per creare topi "umanizzati" intestinali, insieme alla raccolta delle feci per monitorare la composizione della comunità microbica di questi topi. Un esperimento illustra che due settimane dopo il trapianto fecale umano consentono una colonizzazione stabile del microbiota del donatore negli ospiti murini, consentendo un successivo utilizzo sperimentale. Inoltre, viene descritta la raccolta di feci di topo umanizzate in terreni di conservazione della vitalità, che ne consentono l'uso in ulteriori esperimenti funzionali. Nel complesso, questi metodi consentono la creazione sicura ed efficace di comunità di topi umanizzati in gabbie gnotobiotiche sperimentali per ulteriori manipolazioni.

Introduzione

I topi privi di germi sono uno strumento essenziale nel repertorio dei ricercatori sul microbioma, che consente di analizzare il contributo del microbiota nella salute dell'ospite e negli stati di malattia. I topi privi di germi nascono completamente sterili e rimangono axenici per tutta la vita¹. La colonizzazione di topi privi di germi con ceppi batterici specifici consente studi causali tra questi taxa e le funzioni metaboliche, immunitarie o altre funzioni dell'ospite 2,3,4,5. Particolarmente vantaggiosa è la capacità di "umanizzare" topi germ-free a livello del microbiota trapiantando feci ottenute da donatori umani e, se alloggiati in condizioni di barriera, prevenire la contaminazione da microrganismi di origine murina¹. Questo approccio ha permesso molte importanti scoperte nel campo del microbioma, ad esempio l'effetto del microbioma intestinale umano sulla risposta all'immunoterapia del cancro ^6,7,8.

Tuttavia, mentre i topi umanizzati privi di germi sono inestimabili per gli sforzi di ricerca nel campo del microbioma, ci sono molte limitazioni che hanno inibito il più ampio adattamento di questo approccio. I topi privi di germi vengono allevati e mantenuti in grandi isolatori semirigidi o a film flessibile, ma gli esperimenti funzionali richiedono l'installazione di mini-isolatori separati, con un mini-isolatore che ospita diverse gabbie ma solo in una condizione sperimentale. Questo approccio mini-isolatore aumenta l'ingombro e i costi, limitando al contempo il numero di condizioni sperimentali che possono essere studiate in un esperimento e il numero di esperimenti che possono essere eseguiti in parallelo. Una soluzione promettente consiste nell'utilizzo di un sistema di ingabbiamento modulare e individuale chiamato ISOcage P Bioexclusion System (qui denominato sistema isocage)^9,10. Il sistema isocage consente la manipolazione sperimentale di topi privi di germi in gabbie isolatrici individuali, sigillate ermeticamente e a pressione positiva, consentendo condizioni sperimentali separate tra ciascuna gabbia piuttosto che tra ciascun mini-isolatore. Con la corretta tecnica asettica, gli animali possono essere alloggiati in isogabbie per un massimo di 12 settimane in condizioni prive di germi o umanizzati mediante trapianto fecale umano per l'uso in qualsiasi approccio sperimentale compatibile (cioè, possono essere eseguiti in condizioni asettiche). È possibile eseguire più esperimenti indipendenti in parallelo utilizzando il sistema isocage e l'ingombro e il costo sono notevolmente inferiori rispetto all'esecuzione di più esperimenti su mini-isolatori.

Lo scopo dell'allevamento di topi privi di germi in isolatori di riproduzione a film flessibile è quello di preservare attentamente lo stato axenico¹¹. Le tecniche utilizzate per monitorare lo stato privo di germi includono tamponi di routine delle superfici corporee dei topi e delle cavità orali, nonché la raccolta asettica di campioni fecali, che vengono sia coltivati che testati mediante test commerciali basati su PCR. I test batterici, sierologici e fungini di questi campioni sono tutti necessari per determinare lo stato privo di germi¹¹. Quando i topi privi di germi vengono trasferiti dagli isolatori di riproduzione alle isogabbie per l'uso sperimentale, i topi vengono sottoposti a tampone e testati per convalidare il loro stato privo di germi al momento del trasferimento. I controlli di sterilità Isocage vengono eseguiti attraverso la raccolta asettica di campioni fecali, che vengono poi coltivati per la rilevazione di contaminanti batterici, virali e fungini. Per convalidare lo stato di germ-free di questi topi è necessario raccogliere e registrare attentamente i risultati di questi controlli di sterilità dalla nascita alla fine di un protocollo sperimentale.

Il sistema di isocage è composto da gabbie individuali (Figura 1), dischi di trasferimento per il trasporto fuori dagli isolatori di allevamento (Figura 1) e la rastrelliera per isocage, che ospita le gabbie (Figura 2). Ogni isogabbia contiene un filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air) a livello di gabbia installato sulla presa d'aria di mandata e una guarnizione in silicone che crea una tenuta ermetica quando è chiusa, assicurando che nessun contaminante possa entrare nella gabbia attraverso l'aria (Figura 1A). Questo coperchio della gabbia può essere utilizzato come superficie di lavoro sterile se posizionato capovolto all'interno di una cabina di biosicurezza sterilizzata (Figura 1A). Una griglia all'interno della gabbia contiene il cibo e la bottiglia d'acqua (Figura 1B). Le pinze sterilizzate in autoclave all'interno della gabbia vengono utilizzate per tutte le manipolazioni che richiedono il contatto con le superfici interne della gabbia. La gabbia stessa è dotata di tacche per un supporto per schede di gabbia rimovibile per identificare gli animali all'esterno e di ugelli di aspirazione ed esportazione dell'aria che si agganciano al rack isocage (Figura 1C-E). I morsetti di chiusura sicuri e un blocco della linguetta sul coperchio sigillano la gabbia quando è pronta per essere riagganciata al sistema di scaffalature (Figura 1F). La lettiera suggerita è l'Alpha-dri e si raccomanda anche una capanna di arricchimento autoclavabile (Figura 1F). I dischi di trasferimento vengono utilizzati per spostare i topi privi di germi dagli isolatori di riproduzione alle isogabbie e contengono un coperchio a scomparti girevole con un'apertura triangolare per consentire la manipolazione degli animali (Figura 1G-H). I dischi sono disponibili nelle dimensioni piccola (21,6 cm di diametro) e grande (28 cm di diametro), entrambe con una capacità di otto topi. Il nastro autoclavato viene utilizzato per creare guarnizioni ermetiche sulla circonferenza e sui fori d'aria del disco, che viene eseguito prima dell'immersione con sterilizzante e del trasporto in una sacca imbevuta di sterilizzante (Figura 1I). Il sistema rack stesso dispone di uno schermo per monitorare i ventilatori d'aria, lo stato del filtro HEPA a livello di rack e l'alimentazione di emergenza della batteria per il rack, che sono tutte funzionalità incluse nel sistema (Figura 2A). Un manometro Magnehelic chiuso mostra la pressione positiva mantenuta dal sistema di gabbie e un indicatore visivo di attracco automatico mostra lo stato di attracco delle gabbie (la linguetta gialla indica che nessuna gabbia è agganciata o che il bacino non è riuscito a farlo) (Figura 2B-D). Per la manipolazione delle isogabbie è necessaria anche una cappa di biosicurezza certificata standard.

Il protocollo qui presentato descrive i metodi appropriati per il trasferimento di successo di topi privi di germi da isolatori di riproduzione in condizioni asettiche alle isogabbie mantenendo lo stato privo di germi, l'umanizzazione di topi privi di germi con liquame fecale di donatore umano e la raccolta di feci da topi ospitati nell'isogabbia per la conferma dello stato privo di germi o per la conservazione della vitalità per ulteriori studi funzionali. In questo esempio, i topi privi di germi sono umanizzati con campioni fecali aggregati da soggetti umani trattati con immunoterapia per il cancro del polmone e dicotomizzati come responder o non-responder alla terapia. In questo caso, il fenotipo di risposta alla risposta all'immunoterapia è stato trasferito dall'umanizzazione del microbiota intestinale ai topi riceventi, che hanno potuto essere ulteriormente inoculati con cellule tumorali e trattati con immunoterapia. Il protocollo del liquame fecale umano può essere facilmente adattato a qualsiasi fece di donatore umano o a qualsiasi modello preclinico di malattia che lo sperimentatore desidera. Utilizzando questo protocollo, è possibile trasferire qualsiasi microbiota fecale umano nel biopatico privo di germi, consentendo ulteriori indagini sul ruolo del microbiota nella salute e nella malattia.

Figura 1: Diagramma schematico dell'isogabbia e dei dischi di trasferimento. (A) Vista dall'alto verso il basso della parte inferiore del coperchio della gabbia, con etichette che indicano la posizione del filtro HEPA interno a livello della gabbia e della guarnizione in silicone. (B) Vista dall'alto verso il basso dell'interno della gabbia, con etichette che indicano il coperchio della barra metallica, la bottiglia d'acqua interna e il beccuccio e la posizione nella griglia per contenere il cibo autoclavabile. (C) Vista frontale della gabbia che mostra le tacche per il portacarte della gabbia. (D) Vista dall'alto verso il basso di una gabbia completa con il coperchio in alto, che mostra come il filtro HEPA è installato sull'ugello di aspirazione dell'aria. (E). Vista posteriore della gabbia che mostra gli ugelli di aspirazione e di esportazione dell'aria che si agganciano al sistema di scaffalature isocage. (F) Vista laterale di una gabbia completa con il coperchio in alto, con etichette che indicano i morsetti di chiusura sicuri in posizione aperta, con linguette bianche su ciascun morsetto che li bloccano in posizione. L'interno della gabbia mostra una lettiera Alpha-dri stratificata nella parte inferiore e una capanna di arricchimento suggerita collocata nella lettiera. (G) Vista dall'alto verso il basso dei dischi di trasferimento con coperchio in alto. (H) Vista dall'alto verso il basso dell'interno del disco di trasferimento, che mostra il coperchio del vano girevole con un'apertura triangolare per consentire la manipolazione degli animali. (I) Vista laterale del disco di trasferimento completamente assemblato che mostra il posizionamento del nastro autoclavato, che crea una chiusura ermetica durante il trasferimento dall'isolatore di riproduzione all'isogabbia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Diagramma schematico del sistema di rack isocage. (A) Rack isocage completo con gabbie agganciate e un'etichetta che indica la schermata di monitoraggio per lo stato del ventilatore d'aria, lo stato del filtro HEPA e la batteria di emergenza. Sul lato inferiore sinistro del rack si trova la fessura per il filtro HEPA a livello del rack. (B) Manometro Magnehelic allegato che mostra la pressione positiva mantenuta dalla cremagliera. (C) Un'isogabbia agganciata senza indicatore di attracco giallo visibile, che dimostri un collegamento riuscito tra il rack e gli ugelli dell'aria. (D) Una fessura vuota nel rack, con un indicatore visivo visivo visibile che indica che non è presente alcun rack in posizione e che non vi è alcun collegamento degli ugelli dell'aria con un'isogabbia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della Florida (UF) ed eseguiti presso le strutture per la cura degli animali dell'UF (IACUC Protocol #IACUC202300000005). Le colonie di specie selvatiche prive di germi (GF WT; I topi C57BL/6) sono stati allevati e mantenuti in isolatori dalla UF Animal Care Services Germ-free Division. I topi GF WT di genere misto sono stati trasferiti da isolatori di riproduzione e inseriti nel sistema di bioesclusione ISOcage P per consentire la manipolazione microbica.

I campioni fecali umani sono stati ottenuti da uno studio osservazionale prospettico che ha raccolto campioni di feci longitudinali da pazienti che hanno ricevuto il trattamento con inibitore del checkpoint immunitario (ICI)¹². Il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti dopo l'approvazione dello studio da parte di Advarra IRB (MCC#18611, Pro00017235). I soggetti hanno ricevuto e completato un kit di raccolta delle feci con mezzo di trasporto dentale liquido (LDTM) destinato a preservare la vitalità batterica per gli studi funzionali. La valutazione della risposta ha caratterizzato n=4 campioni come responder (R) e n=6 come non-responder (NR). I campioni omogeneizzati di pazienti conservati con LDTM sono stati scongelati individualmente, ciascuno posto in una camera anaerobica per non più di 90 s e raggruppati per fenotipo di risposta (R: n = 4, NR: n = 6). I campioni raggruppati sono stati quindi aliquotati e congelati a -80 °C per l'uso in questo protocollo. Per determinare la conta delle unità formanti colonie anaerobiche (CFU) delle feci del donatore, le feci di ciascun soggetto sono state diluite in serie a 1 × ^10-5 e 10 μL di ciascuna diluizione sono stati piastrati in duplicato su piastre di agar anaerobiche per infusione cardiaca cerebrale (BHI) e Luria Bertani (LB) e conta CFU per grammo di feci stimata. Le CFU uguali di ciascun soggetto sono state raggruppate in campioni di inoculo fecale per la sonda gastrica nei topi.

1. Preparazione delle gabbie e autoclave

1. Preparazione Isocage
   1. Preriempi le gabbie con ~500 ml di dieta 2018SX o qualsiasi dieta autoclavabile fortificata desiderata e stratifica il fondo con lettiera ALPHA-dri. Posizionare una capanna di arricchimento autoclavabile nel letto della gabbia. Posizionare una bottiglia d'acqua vuota e non sigillata, un ugello e una lunga pinza a punta larga sopra la griglia.
   2. Posizionare un indicatore biologico a doppia specie nel cibo all'interno di una gabbia per ciclo di autoclave. Posizionare una striscia di integratore chimico all'esterno di ogni gabbia.
   3. Autoclavare le gabbie con un ciclo di vuoto per 45 minuti a 121 °C e un minimo di 15 PSI seguito da un tempo di asciugatura di 30 minuti. Sterilizza le gabbie utilizzando un rack di decontaminazione ISO (International Organization for Standardization) che consente alle gabbie di rimanere sigillate e al vapore di passare attraverso il filtro HEPA interno, che mantiene l'ambiente sterile fino all'apertura della gabbia.
   4. Riempire le bottiglie da 1 litro con acqua potabile, sigillarle con tappi di gomma e posizionare una striscia di integratore chimico sulla superficie della bottiglia. Autoclavare a 121 °C e un minimo di 15 PSI per 45 minuti, utilizzando il programma di scarico lento per liquidi.
   5. Controllare visivamente gli integratori chimici apposti su ciascuna gabbia per verificare immediatamente i parametri appropriati dell'autoclave.
      NOTA: L'indicatore biologico deve essere rimosso alla prima apertura dell'isogabbia in condizioni sterili. Incubare l'indicatore biologico per 24 ore a 37 °C e osservare eventuali cambiamenti di colore. Un vivido cambiamento di colore dalla soluzione trasparente blu/viola originale a un liquido giallo o torbido indica la presenza di una crescita microbica. Se l'indicatore rimane chiaro e di colore blu/violaceo, allora questa è la conferma della completa sterilità dell'interno delle gabbie in quel ciclo in autoclave.

2. Preparazione sterilizzante con biossido di cloro

ATTENZIONE: Lo sterilizzante al biossido di cloro è estremamente corrosivo una volta attivato. Lo sterilizzante al biossido di cloro attivato scade 24 ore dopo la miscelazione dell'attivatore con la base. Lo sterilizzante al biossido di cloro produce fumi, che possono essere irritanti per le superfici delle mucose e causare irritazione a contatto con la pelle. Assicurarsi che la stanza per la preparazione dello sterilizzante abbia accesso a un lavandino e a un'adeguata ventilazione. Indossare occhiali di sicurezza, respiratore e guanti resistenti agli agenti chimici quando si lavora con sterilizzanti al biossido di cloro, oltre ai dispositivi di protezione individuale (DPI) necessari per la struttura di stabulazione degli animali.

1. Base di miscelazione e attivatore
   1. Per realizzare un volume standard di 6 L di sterilizzante al biossido di cloro, misurare prima 1 L di base di sterilizzante al biossido di cloro in un cilindro graduato da 1 L e versare in un serbatoio da 20 L.
   2. Utilizzando lo stesso cilindro graduato, misurare e versare 4 L di acqua del rubinetto nella vasca di immersione.
   3. Mettere da parte il cilindro graduato utilizzato per la base e l'acqua. Utilizzare un nuovo cilindro graduato per misurare 1 L di attivatore sterilizzante al biossido di cloro e versarlo nel serbatoio di immersione.
   4. Una volta aggiunto l'attivatore al serbatoio, utilizzare il cilindro graduato per miscelare il contenuto del serbatoio.
2. Attivazione
   1. Posiziona il coperchio sulla vasca delle inzuppate ed etichettalo come sterilizzante al biossido di cloro con la data e l'ora in cui è stato aggiunto l'attivatore e il nome del personale che lo ha preparato. Se lo si desidera, il cilindro graduato utilizzato per miscelare lo sterilizzante può essere utilizzato per trasferire 1 L in un flacone spray.
   2. Sposta il serbatoio delle schiacciate e i flaconi spray nella stanza di stabulazione degli animali, dove si trovano la rastrelliera e le gabbie Isocage. Lo sterilizzante al biossido di cloro attivato deve riposare per almeno 20 minuti prima dell'uso per garantire la completa attivazione.
      NOTA: Per la manipolazione di grandi quantità di gabbie (>9), è possibile preparare fino a 12 L alla volta nel serbatoio delle immersioni. Per la manipolazione di 1 gabbia o in caso di emergenza, è possibile preparare 1,2 L di sterilizzante al biossido di cloro in un contenitore più piccolo e poi trasferirlo in 2 flaconi spray da 1 L. Si raccomanda di preparare lo sterilizzante almeno 1 ora prima del trasferimento previsto di topi privi di germi.

3. Sterilizzazione

1. Don DPI
   1. Come manipolatore principale della gabbia, indossa occhiali di sicurezza, un respiratore, guanti resistenti agli agenti chimici, un camice chirurgico sterile, un bouffant, coprimaniche e copriscarpe. Indossare camici sotto i DPI poiché qualsiasi contatto del tessuto con lo sterilizzante a base di biossido di cloro provocherà macchie estese.
   2. Si consiglia un assistente al manipolatore della gabbia primario. Chiedi all'assistente di indossare gli stessi DPI del manipolatore principale della gabbia, anche se potrebbe indossare un camice chirurgico non sterile.
2. Preparazione della cabina di biosicurezza
   1. Metti 10 salviette nel serbatoio dell'immersione dello sterilizzante al biossido di cloro e assicurati che siano completamente inzuppate.
   2. Sposta le salviette imbevute nell'armadio di biosicurezza e immergi tutte le superfici dell'armadio nel seguente ordine da dietro a davanti: superficie di lavoro piana, lato sinistro, retro della cappa, lato destro e vetro interno anteriore. Eseguire l'ammollo senza contatto delle superfici non protette della cabina di biosicurezza schiacciando le salviette su queste superfici senza toccarle.
   3. Dopo un ciclo di pulizia, riposizionare le salviette nel serbatoio di immersione dello sterilizzante al biossido di cloro per immergerle.
3. Preparazione delle isogabbie
   1. Preparare un grande sacchetto di plastica riempiendolo con almeno 100 ml di sterilizzante al biossido di cloro utilizzando un cilindro graduato e agitare il sacchetto per assicurarsi che tutte le superfici interne siano bagnate. Posiziona la borsa su una superficie piana.
   2. Rimuovere una singola isogabbia dal rack e posizionarla nel serbatoio di immersione sterilizzante al biossido di cloro in modo che ogni superficie della gabbia venga a contatto con il liquido. Utilizzare le salviette imbevute nel serbatoio per strofinare ulteriormente le superfici della gabbia per garantire il completo contatto con i liquidi.
   3. Dopo aver immerso la gabbia, chiedi all'assistente di aprire il sacchetto di plastica inzuppato. Posiziona la gabbia nel sacco e chiedi all'assistente di chiudere immediatamente l'apertura. Spruzzare l'apertura del sacchetto con sterilizzante al biossido di cloro utilizzando il flacone spray. Seguire questa procedura per ogni gabbia da utilizzare; Fino a quattro gabbie possono entrare in una singola borsa da 36" 32" 48".
   4. Immergere tutte le bottiglie d'acqua sterilizzate da 1 litro necessarie (1 litro di acqua per 2 gabbie) nel serbatoio di immersione con sterilizzante al biossido di cloro, quindi metterle in un altro sacchetto di plastica imbevuto. Quando tutte le forniture sono state inserite nel sacchetto, chiudere il sacchetto e spruzzare l'apertura del sacchetto con uno sterilizzante al biossido di cloro utilizzando il flacone spray.
   5. Una volta che tutte le gabbie e le forniture sono state insaccate, immergere i guanti resistenti agli agenti chimici in uno sterilizzante al biossido di cloro (il più in alto possibile senza raggiungere l'apertura).
4. Periodo di sterilizzazione di 20 minuti
   1. La sterilizzazione completa richiede un tempo di contatto minimo di 20 minuti con il liquido. Non appena l'ultimo articolo è stato sterilizzato e il sacchetto di plastica per l'ammollo è chiuso, chiedi all'assistente di impostare un timer di 20 minuti. Assicurarsi che dopo l'avvio del timer, i guanti resistenti agli agenti chimici non tocchino alcuna superficie non imbevuta di sterilizzante al biossido di cloro.
   2. Eseguire ripetutamente il processo di sterilizzazione della cabina di biosicurezza (passaggio 3.2) fino a quando il timer indica che sono trascorsi 20 minuti.
   3. Chiedi all'assistente di scuotere frequentemente le superfici esterne del sacchetto di plastica imbevuto per garantire un contatto costante del liquido con le superfici della gabbia e della bottiglia all'interno.
   4. Dopo il periodo di 20 minuti, chiedi all'assistente di aprire il sacchetto di plastica imbevuto per rivelare le gabbie sterilizzate e le bottiglie d'acqua, facendo attenzione a toccare solo le superfici esterne del sacchetto.
   5. Utilizzando i guanti sterilizzati resistenti agli agenti chimici, spostare ogni gabbia e bottiglia nell'armadio di biosicurezza sterilizzato. Se ci sono troppe gabbie da inserire nella cabina di biosicurezza, lasciare le gabbie rimanenti nei sacchetti di plastica poiché rimarranno sterili finché l'apertura del sacchetto di plastica è chiusa e imbevuta di sterilizzante al biossido di cloro tra ogni apertura.

4. Trasferimento del mouse senza germi

1. Preparazione delle isogabbie
   1. Per aprire l'isogabbia ermeticamente sigillata, sollevare le linguette bianche sui due morsetti ai lati del coperchio e quindi estrarre ciascun morsetto lateralmente. Il coperchio deve essere libero dalla parte inferiore della gabbia per sollevare il coperchio dalla gabbia. Posiziona il coperchio capovolto a sinistra della gabbia e usalo come postazione di lavoro sterile.
      NOTA: Un'alternativa all'utilizzo dei coperchi delle gabbie o dell'interno delle borse per strumenti autoclavate come superficie di lavoro sterile consiste nell'utilizzare teli autoclavati, che forniscono una superficie più ampia e prevengono la contaminazione involontaria del coperchio della gabbia in caso di errore.
   2. Utilizzando la pinza sterile che si trova all'interno della gabbia sopra la griglia, rimuovi la bottiglia d'acqua vuota e posizionala all'interno del coperchio. Aprire la bottiglia d'acqua da 1 L rimuovendo la guarnizione in gomma e versare l'acqua nella bottiglia d'acqua per riempirla. Posizionare l'ugello sulla bottiglia d'acqua utilizzando la pinza e premere con decisione per sigillare.
   3. Utilizzare una pinza sterile per sollevare la griglia e riposizionarla indietro di diversi centimetri per consentire un'apertura sul fondo della gabbia. Appoggiare le pinze sterili sulla griglia, assicurandosi che le maniglie non entrino in contatto con le superfici della gabbia.
2. Utilizzo del disco di trasferimento
   NOTA: Il personale addestrato e privo di germi è responsabile della cura e della manutenzione degli isolatori per l'allevamento. Dati i rischi associati all'apertura degli isolatori da riproduzione, questo personale esegue la sterilizzazione del disco di trasferimento, la preparazione e il trasferimento di topi privi di germi dagli isolatori alle isogabbie. Per descrivere brevemente il processo, i dischi di trasferimento vengono preparati in un cilindro autoclavabile per consentire la sterilizzazione. Gli indicatori biologici vengono utilizzati per verificarne la sterilità. Anche il nastro per sigillare i dischi di trasferimento viene sterilizzato in autoclave all'interno del cilindro. Il cilindro sterilizzato che racchiude questi materiali viene fissato all'isolatore tramite un manicotto di trasferimento e i topi vengono spostati dalle gabbie al disco. Il coperchio viene quindi posizionato sul disco e il nastro autoclavato viene utilizzato per creare una chiusura ermetica sulla circonferenza del disco e sui fori dell'aria. Il disco sigillato viene immediatamente posizionato nella porta di uscita dell'isolatore. Il tappo della porta dell'isolatore domestico viene quindi chiuso e l'esterno del disco viene accuratamente tamponato con sterilizzante e posto in una sacca imbevuta di sterilizzante, monitorata per 20 minuti per garantire una decontaminazione completa. Il personale addetto all'allevamento privo di germi consegna quindi questi dischi al personale di studio. I mouse non possono essere conservati nel disco sigillato per più di 30 minuti dal momento in cui il disco di trasferimento è sigillato, quindi è essenziale che tutti i passaggi precedenti di questo protocollo siano stati completati con ampio anticipo rispetto all'arrivo del disco di trasferimento.
   1. Al ricevimento del disco di trasferimento, chiedere all'assistente di tenere e srotolare parzialmente il coperchio di plastica in modo che la superficie imbevuta del disco di trasferimento sia esposta ma non toccata dall'assistente.
   2. Al ricevimento del disco di trasferimento, chiedere all'assistente di tenere e srotolare parzialmente il coperchio di plastica in modo che la superficie imbevuta del disco di trasferimento sia esposta ma non toccata dall'assistente.
   3. Indossando i guanti resistenti agli agenti chimici imbevuti di sterilizzante al biossido di cloro, rimuovere il disco di trasferimento dall'involucro di plastica, facendo attenzione a non toccare alcuna superficie non imbevuta di sterilizzante. Quindi, posizionare il disco di trasferimento sulla superficie piana della cappa di biosicurezza sterilizzata.
   4. Per aprire il disco di trasferimento, staccare il nastro, sigillare la circonferenza del disco e gettarlo all'esterno della cabina di biosicurezza. Rimuovere il coperchio del disco di trasferimento e gettarlo all'esterno della cappa di biosicurezza.
   5. All'interno del disco di trasferimento è presente un coperchio girevole con un'unica apertura. Utilizzare la pinza sterile precedentemente appoggiata sulla griglia della gabbia per manipolare il coperchio di questo scomparto per spostare l'apertura verso il mouse necessaria per il trasferimento.
3. Trasferimento di topi da disco a isocage
   1. Usando la pinza, afferrare la base della coda del mouse attraverso l'apertura nel coperchio del disco di plastica, quindi sollevare e trasferire il mouse nell'isogabbia attraverso lo spazio precedentemente aperto tra la griglia e la gabbia. Ripeti per tutti i topi destinati a quella gabbia.
   2. Una volta che tutti i topi sono stati trasferiti in quell'isogabbia, sostituire la griglia utilizzando la pinza. Quindi, solleva il coperchio della gabbia e riposizionalo sopra la gabbia usando la pinza.
   3. Sollevare ogni clamp del coperchio della gabbia verso l'alto e abbassarlo con cautela sui lati della gabbia, quindi spingere verso il basso le linguette bianche per sigillare il coperchio della gabbia.
   4. Una volta sigillata la gabbia, chiedere all'assistente di spruzzare ogni ugello del sito di attracco sul rack della gabbia con uno sterilizzante al biossido di cloro. Quindi, rimuovere la gabbia dal cofano e passarla all'assistente, che può quindi agganciare la gabbia sulla rastrelliera.
   5. Ripetere questi passaggi per ogni mouse nel disco di trasferimento.
4. Pulizia della cabina di biosicurezza
   1. Al termine di tutti i trasferimenti di topi nell'isocage, svuotare il cofano da eventuali detriti e pulire completamente con salviette imbevute di sterilizzante al biossido di cloro.
   2. Pulire la cappa con alcol isopropilico per rimuovere lo sterilizzante residuo di biossido di cloro. Lo spazio sotto la superficie di lavoro della cappa raccoglie un grande volume di sterilizzante dal processo di sterilizzazione. Rimuoverlo tramite assorbimento con salviettine asciutte e strofinare con alcol isopropilico.
   3. Smaltire lo sterilizzante liquido al biossido di cloro attraverso lo scarico del lavandino 24 ore dopo l'attivazione. Smaltire i materiali solidi contaminati da sterilizzante come rifiuti regolari.
      NOTA: I topi privi di germi trasferiti in condizioni di isocage vengono lasciati per 1 settimana ad acclimatarsi al loro nuovo ambiente prima di qualsiasi intervento. Ciò riduce lo stress vissuto dagli animali, che potrebbe interferire con i risultati dello studio. Al termine di questo periodo di acclimatazione di 1 settimana, raccogliere le feci come descritto nel passaggio 6 per confermare lo stato privo di germi prima di qualsiasi intervento.

5. Sonda orale di liquame fecale umano in topi privi di germi

1. Preparazione delle forniture di sonda gastricata autoclavata
   1. Posizionare gli aghi per la sonda gastrica orale in buste di sterilizzazione autosigillanti (1 per topo) e le siringhe sterili da 1 ml in buste di sterilizzazione autosigillanti (1 per topo) 1 giorno prima della procedura di sterilizzazione orale. Inserire questi becher in polipropilene da 600 ml (1 per topo) e un paio di pinze lunghe in una sacca sicura per l'autoclave e sterilizzare in autoclave.
   2. Immediatamente dopo aver tolto il sacchetto dall'autoclave, sigillare il sacchetto con del nastro adesivo e conservarlo fino al giorno successivo.
2. Preparazione del liquame fecale umano
   1. Il giorno del gavage, trasferire le feci umane omogeneizzate e conservate in mezzi di conservazione anaerobici (in questo caso, mezzi di trasporto dentale liquidi) dal congelatore a -80 °C alla camera anaerobica. Diluire il materiale fecale omogeneizzato circa 1:10 in soluzione salina sterile e anaerobica in una provetta conica da 10 mL.
   2. Sigillare la provetta contenente l'impasto fecale umano con parafilm, omogeneizzare a vortice e quindi centrifugare a 200 g per 5 minuti per depositare il particolato.
   3. Riposizionare la provetta nella camera anaerobica e trasferire il surnatante in un'altra provetta conica da 10 mL. Sigillare la provetta contenente il surnatante fecale umano con parafilm, rimuoverla dalla camera anaerobica e posizionarla in un contenitore secondario a tenuta stagna. Trasporta il contenitore insieme al sacchetto autoclavato di provviste di sonda gastrica al luogo di stabulazione degli animali.
      NOTA: È essenziale stimare le CFU/mL totali delle feci umane destinate alla sonda gastrica ai fini della segnalazione. Non è chiaro quale sia il carico minimo di CFU per garantire un'adeguata colonizzazione, ma CFU più elevati portano a un migliore attecchimento delle feci del donatore¹³. Se il carico di CFU di materiale fecale umano si traduce in bassi tassi di attecchimento, raccogliere campioni fecali umani. L'uso di un terreno di conservazione della vitalità migliorerà il recupero delle CFU dai campioni fecali raccolti. Per determinare la conta anaerobica/aerobica delle CFU delle feci del donatore, diluire in serie il campione a 1 x ^10-5 e piastrare 10 μL di ciascuna diluizione in duplicato su piastre di agar aerobiche e anaerobiche BHI e LB. Dopo 24 ore (aerobiche) e 48 ore (anaerobiche), contare le CFU per grammo di feci.
3. Preparazione delle isogabbie
   1. Ripetere i passaggi 2 e 3, con l'unica differenza che ora ci sono topi alloggiati in queste gabbie, e si dovrebbe fare attenzione per garantire che entro 30 minuti dalla rimozione del rack, ogni isogabbia venga inserita nella cappa sterilizzata e il coperchio ventilato per consentire il flusso d'aria ai topi.
   2. Sterilizzare la sacca di materiale gastricato autoclavato e la provetta per liquame fecale umano dai passaggi 5.1 e 5.2 tramite saturazione sterilizzante con biossido di cloro in modo simile alle bottiglie d'acqua (cioè, immergerle nello sterilizzante e poi metterle in una sacca imbevuta di sterilizzante).
   3. Trasferire le isogabbie e le forniture di sonda orale nella cabina di biosicurezza dopo il completamento del periodo di sterilizzazione di 20 minuti. Forare la sacca di alimentazione autoclavata spingendo la sacca contro la lunga pinza contenuta all'interno, quindi rimuovere le forniture e gettare la sacca all'esterno del cappuccio.
4. Sonda
   1. Indossare un nuovo camice chirurgico sterile e guanti chirurgici sterili al posto dei guanti resistenti agli agenti chimici per evitare che lo sterilizzante residuo di biossido di cloro entri in contatto con i topi. Se necessario, chiedi all'assistente di aiutarti in questo processo.
   2. Preparare gli aghi per la sonda gastrica scartando ogni sacca di sterilizzazione e utilizzare l'interno della sacca come superficie di appoggio asciutta e sterile. Collegare l'ago della sonda a ciascuna siringa, aprire la provetta per liquame fecale e aspirare 200 μL di liquame fecale in ciascuna siringa.
   3. Usando una pinza, afferra la base della coda di un singolo topo nella gabbia e posizionala sulla griglia. Trattenere delicatamente il mouse strofinandolo e, tenendo il mouse in posizione verticale verticale, inserire l'ago e iniettare delicatamente il liquame fecale, seguito dalla rimozione immediata dell'ago.
   4. Posizionare il mouse direttamente in una delle tazze sterilizzate per l'osservazione. Ripeti il processo per ogni topo nella gabbia. Dopo che tutti i topi hanno ricevuto il gavage, utilizzare la pinza per riportare ciascun topo nel letto della gabbia e sigillare la gabbia come descritto nei passaggi 4.3.2-4.3.4.
      NOTA: Nei casi in cui vengono utilizzati due o più fanghi fecali separati, è necessaria la risterilizzazione completa della cabina di biosicurezza e delle gabbie e dei materiali necessari. Nei casi in cui un gruppo di topi rimane privo di germi, si raccomanda che questi topi ricevano i loro gavagaggi di controllo prima che qualsiasi altro gruppo venga trattato.
   5. Seguire la procedura al punto 4.4 per smaltire lo sterilizzante a base di biossido di cloro e i materiali imbevuti di sterilizzante. Trattare tutti i materiali contaminati da liquame fecale umano come rifiuti biomedici e smaltirli secondo le procedure di salute e sicurezza ambientale.

6. Raccolta di feci da topi umanizzati per la conservazione della vitalità

1. Preparare forniture autoclavate
   1. Posizionare le pinze corte a punta larga in buste di sterilizzazione autosigillanti (1 per topo), becher in polipropilene da 600 ml (1 per topo) e un paio di pinze lunghe in una sacca sicura per l'autoclave e sterilizzare in autoclave 1 giorno prima della procedura di raccolta delle feci.
   2. Immediatamente dopo aver tolto il sacchetto dall'autoclave, sigillare il sacchetto con del nastro adesivo e conservarlo fino al giorno successivo.
2. Preparazione delle provette dei terreni di conservazione
   1. Selezionare un terreno di conservazione anaerobico (qui è stato utilizzato Cary Blair). Aliquotare 1 mL di terreno di conservazione in provette sterili da 2 mL con tappo a vite in una cappa di biosicurezza. Per una conservazione ottimale si raccomanda un rapporto di 1:10 feci:terreno.
   2. Pre-etichettare ogni provetta con un pennarello indelebile, ma tenere presente che l'esposizione allo sterilizzante a base di biossido di cloro può rimuovere le etichette indelebili dalle superfici di plastica. Un altro metodo consiste nel lasciare le provette non etichettate e fare in modo che l'assistente etichetterà le provette immediatamente dopo la raccolta prima del congelamento.
   3. Posizionare queste provette in un rack per provette standard in polipropilene per consentire la conservazione delle provette in posizione verticale, pur consentendo la sterilizzazione a contatto con lo sterilizzante a base di biossido di cloro.
3. Gabbie di sterilizzazione e cabina di biosicurezza
   1. Ripetere i passaggi 2 e 3 per sterilizzare le isogabbie e la cabina di biosicurezza. Anche in questo caso, fare attenzione a garantire che entro 30 minuti dalla rimozione del rack, ogni isogabbia venga inserita nella cappa sterilizzata e che il coperchio sia ventilato per consentire il flusso d'aria ai topi.
   2. Inoltre, sterilizzare la sacca di alimentazione autoclavata e il rack contenente le provette preparate tramite saturazione con sterilizzante al biossido di cloro e inserirli nella sacca di plastica imbevuta contenente le gabbie. L'obiettivo è il completo contatto del liquido con tutte le superfici di ogni provetta e il rack stesso.
4. Raccolta e conservazione dei campioni fecali
   1. Trasferire le isocage, i materiali autoclavati e il rack per provette nell'armadio di biosicurezza dopo il completamento del periodo di sterilizzazione di 20 minuti. Forare la sacca di alimentazione autoclavata spingendo la sacca contro la lunga pinza contenuta all'interno, rimuovere le forniture e gettare la sacca all'esterno del cappuccio.
   2. Indossare un nuovo camice chirurgico sterile e guanti chirurgici sterili al posto dei guanti resistenti agli agenti chimici per evitare che lo sterilizzante residuo di biossido di cloro entri in contatto con i topi. Se lo si desidera, chiedere all'assistente di assistere in questo processo.
   3. Preparare la pinza a punta smussata scartando le buste e utilizzando la superficie interna della busta come area sterile. Posizionare il rack per provette sulla superficie della cappa di biosicurezza.
   4. Usando una pinza lunga, afferra la base della coda di un singolo topo nella gabbia e mettili direttamente in una delle coppette sterilizzate per l'osservazione. Ripeti questo processo per ogni topo nella gabbia.
   5. Osserva i topi fino a quando non sono stati prodotti almeno due pellet fecali appena passati.
      1. Usando la pinza a punta smussata, raccogli i pellet fecali e mettili direttamente nel tubo. Sigillare immediatamente il coperchio del tappo a vite e passarlo all'assistente.
      2. Chiedi all'assistente di etichettare il tubo e omogeneizzare immediatamente le feci tramite vortex. Una volta omogenea, congelare a scatto la provetta in azoto liquido e conservarla a lungo termine a -80 °C.
   6. Ripeti il processo di raccolta delle feci per ogni topo nella gabbia. Rimetti ogni topo nella gabbia domestica dopo la raccolta fecale e riaggancia le gabbie al loro rack. Ripetere il passaggio 4.4 per pulire la cappa e smaltire i rifiuti.

Risultati

I campioni fecali umani, raggruppati per fenotipo ICI responder e non-responder (precedentemente descritto nel protocollo), sono stati suddivisi in topi GF-WT di genere misto ospitati in 3 isogabbie per gruppo (n = 1-2 topi/gabbia, n = 6 per il responder e n = 5 per il non-responder). I topi sono stati lasciati acclimatare per 1 settimana dopo il trasferimento. Campioni fecali sono stati quindi raccolti da questi topi (condizioni prive di germi). I topi sono stati quindi sottoposti a son...

Discussione

Il protocollo qui descritto fornisce un metodo riproducibile e altamente dettagliato per l'umanizzazione di topi privi di germi alloggiati in isogabbie sperimentali. La capacità di trapiantare esclusivamente comunità fecali da soggetti umani in ospiti murini è inestimabile per la ricerca sul microbioma. Senza contaminazione da microbiota commensale specifico per il topo, è possibile studiare l'impatto dei batteri residenti nell'uomo su una varietà di stati di salute e malattia o l'i...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL BD Slip Tip Syringe sterile, single use	Fisher Scientific	309659
2.0 mL Screw Cap Tube, NonKnurl,Skirted,Natural, E-Beam Sterile tube w/ attached cap	Fisher Scientific	14-755-228
36 x 32 x 48" 3 Mil Gusseted Poly Bags	Uline	S-13455
5 gallon tank of Exspor chlorine-dioxide sterilant activator	Ecolab	6301680
5 gallon tank of Exspor chlorine-dioxide sterilant base	Ecolab	6301194
600 mL polypropylene beakers	Fisher Scientific	S01914
ALPHA-dri bedding	Shepherd Specialty Papers
Anaerobic chamber	Coy Lab Products	Type B
Biosafety cabinet class 2	Nuaire
Certified IsoCage autoclavable HEPA filter XT Extreme Temperature	Tecniplast	1245ISOFHXT
Clear Lens LPX IQuity Safety Goggles	Fastenal	922205455
DuPont Tyvek Sleeve - 18"	Uline	S-13893E
DWK Life Sciences DURAN 45 mm Push-on Natural Rubber Cap	Fisher Scientific	01-258-107	Rubber cap for 1 L autclave bottles
Dynalon Quick Mist HDPE Sprayer Bottles	Fisher Scientific	03-438-12B
Fisherbran Polypropylene Graduated Cylinders	Fisher Scientific	03-007-44
Fisherbran Dissecting Blunt-Pointed Forceps	Fisher Scientific	08-887
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches	Fisher Scientific	01-812-51
Fisherbrand Straight Broad Strong Tip General Application Forceps	Fisher Scientific	16-100-107
Fisherbrand lead Free Autoclave Tape	Fisher Scientific	15-901-110
Gavage needle, reusable stainless steel. Straight. 22 gauge needle, tip diameter 1.25 mm, length 38 mm or 1.5 inches(doz)	Braintree Scientific	N-PK 020
H-B Instrument Durac Timer	Fisher Scientific	13-202-015
IsoPositive Cages and Rack (i.e. isocages)	Tecniplast	ISO30P	30 cages (6 w x 5 h), single sided
Nitrile Chemical Resistant Gloves Size S (7), M (8) or L (9) 18” long, 22 mil, Ansell	Grainger	4T426
Nitrile Exam Gloves, Medium, Non-Sterile, Powder-Free	MedSupply Partners	KG-1101M
Olive / Magenta Bayonet Gas & Vapor Cartridges / Particulate Filter 2Ct	3M/Fastenal	50051138541878
Polycarbonate RadDisk Mini for Mice 8-75 x 4	Braintree Scientific	IRD-P M
Polypropylene Bouffant Caps - 24", Blue	Uline	S-10480BLU
Puritan Cary-Blair Medium, 5 mL	Fisher Scientific	22-029-646
S, M and L Blue Silicone Dual-Mode Head Harness Half Mask Respirator	3M/Fastenal	50051131370826
Sgpf Series Sterile Powder Free Latex Gloves, CT International, Thickness = 6.5 mm, Length = 30.5 cm (12), Glove Size = 8.5, Glove Color = White	Fisher Scientific	18-999-102F
Skid Resistant Shoe Cover	Uline	S-25639
Surgical Gown, Towel, Sterile, Large, 32/cs	Thomas Scientific	KIM 95111
Teklad Global 18% protein extruded rodent diet (sterilizable)	Inotiv	2018SX
Thermo Scientific Nalgene Heavy-Duty Rectangular LLDPE Tank with Cover (20 L volume)	Thermo Scientific	14-831-330J
VERIFY Dual Species Self Contained Biological Indicators	Steris Healthcare	S3061
WypAll L40 1⁄4 Fold Wipers	Uline	S-8490