無菌マウスへのヒト糞便移植のためのBioexclusion IsoPositive Cage実験の調製と維持

要約

このプロトコルは、無菌状態を維持しながら、実験用シングルケージアイソレーター(isocages)に無菌マウスを移し、収容するためのベストプラクティスを説明しています。無菌マウスへの糞便移植の方法と、これらの腸内「ヒト化」マウスからの生存可能な細菌の収集について、さらなる応用のために説明します。

要約

無菌マウスは、宿主の健康と疾患における微生物の寄与を理解するための重要な調査ツールであり、宿主応答における微生物の個人、定義された、または複雑なグループの特定の役割の評価を可能にします。従来、軟質フィルムまたは半硬質のアイソレーターで飼育されてきた無菌マウスの飼育と実験的な操作には費用がかかり、多数の訓練を受けたスタッフと動物飼育施設の広いスペースフットプリントが必要です。IsoPositiveケージシステムは、個々の密閉された陽圧アイソレーターケージ(isocages)で無菌マウスの実験的操作を可能にし、コストを削減し、実験操作の柔軟性を高めることができます。

ここでは、無菌マウスを繁殖アイソレーターからアイソケージに移し、その後、ヒトドナー便からマウスに糞便を移して、将来の研究のために安定した長期腸の「ヒト化」マウスを作成するためのプロトコルについて説明します。イソケージシステムの利用に必要な材料と準備が説明されており、ケージ、消耗品、機器、および個人用保護具を洗浄するための二酸化塩素滅菌剤化学滅菌剤の使用が含まれます。移植したマウスの無菌状態を確認する方法と、ケージシステム内の汚染を判断する方法について説明します。寝具、食料、給水などの飼育手順についてさらに説明します。ヒトの糞便スラリーの調製と無菌マウスへの強制経口投与による腸内「ヒト化」マウスの作成、およびこれらのマウスの微生物群集組成を監視するための糞便収集のプロトコルについて説明します。ある実験では、ヒト糞便移植後2週間で、マウス宿主におけるドナー微生物叢の安定したコロニー形成が可能になり、その後の実験利用が可能になることが示されている。さらに、生存率保存培地中のヒト化マウス糞便の収集が記載されており、さらなる機能実験での使用が可能になる。全体として、これらの方法は、さらなる操作のために、実験的なノトバイオティクスケージにヒト化マウスコミュニティを安全かつ効果的に確立することを可能にします。

概要

無菌マウスは、マイクロバイオーム研究者のレパートリーに欠かせないツールであり、宿主の健康状態や疾患状態における微生物叢の寄与を分析することができます。無菌マウスは完全に無菌で生まれ、生涯にわたって無菌のままです¹.無菌マウスに特定の細菌株をコロニー形成することで、これらの分類群と代謝、免疫、またはその他の宿主機能との間の原因研究が可能になります2,3,4,5。特に有利なのは、ヒトのドナーから得られた糞便を移植することにより、無菌マウスを微生物叢のレベルで「ヒト化」する能力であり、バリア条件で飼育すると、マウス由来の微生物からの汚染を防ぐことができる^1。このアプローチにより、マイクロバイオームの分野で多くの重要な発見、例えば、ヒトの腸内細菌叢ががん免疫^{療法の反応}に及ぼす影響など、多くの重要な発見が可能になりました^6,7,8。

しかし、ヒト化無菌マウスはマイクロバイオーム分野の研究努力にとって非常に貴重ですが、このアプローチの広範な適応を阻害する多くの制限があります。無菌マウスは、セミリジッドまたはフレキシブルフィルムの大型アイソレーターで飼育および維持されますが、機能実験では、1つのミニアイソレーターに複数のケージを収容する個別のミニアイソレーターをセットアップする必要がありますが、これは1つの実験条件下でのみ可能です。このミニアイソレータアプローチは、スペースフットプリントとコストを増加させると同時に、実験で調査できる実験条件の数と並行して実行できる実験の数を大幅に制限します。有望な解決策は、ISOcage P Bioexclusion System(ここではisocageシステムと呼ぶ)^9,10と呼ばれる個別のモジュール式ケージシステムを使用することです。アイソケージシステムは、個々の密閉された陽圧アイソレーターケージ内で無菌マウスの実験的操作を可能にし、各ミニアイソレーター間ではなく、各ケージ間で別々の実験条件を可能にします。適切な無菌技術により、動物を無菌条件下で最大12週間アイソケージに収容したり、ヒト糞便移植によってヒト化して、互換性のある実験的アプローチ(つまり、無菌条件下で実施可能)で使用することができる。アイソケージシステムを使用して複数の独立した実験を並行して実行でき、ミニアイソレータ間で複数の実験を実行するよりもスペースフットプリントとコストが大幅に削減されます。

無菌マウスをフレキシブルフィルム育種アイソレータで繁殖させる目的は、無菌状態を注意深く保存すること^である11。無菌状態のモニタリングに使用される技術には、マウスの体表面と口腔の定期的な綿棒、および糞便サンプルの無菌収集が含まれ、これらはPCRベースの商用アッセイによって培養およびテストされます。これらのサンプルの細菌学的、血清学的、および真菌学的検査はすべて、無菌状態を決定するために必要です¹¹。無菌マウスを繁殖アイソレーターからアイソケージに移して実験用に使用する場合、マウスは綿棒で拭き取り、移植時に無菌状態を確認するために試験されます。イソケージの無菌性チェックは、糞便サンプルの無菌収集を通じて実施され、その後、細菌、ウイルス、および真菌の汚染物質を検出するために培養されます。これらのマウスの無菌状態を検証するには、出生から実験プロトコルの終了まで、これらの無菌チェックの結果を注意深く収集して記録する必要があります。

アイソケージシステムは、個々のケージ(図1)、繁殖アイソレーターから輸送するためのトランスファーディスク(図1)、およびケージを収容するアイソケージラック(図2)で構成されています。各アイソケージには、給気口に取り付けられたケージレベルの高効率微粒子空気(HEPA)フィルターと、閉じたときに気密シールを作るシリコンガスケットが含まれており、汚染物質が空気を介してケージに侵入しないようにします(図1A)。このケージの蓋は、滅菌されたバイオセーフティキャビネット内に逆さまに置くと、滅菌作業面として使用できます(図1A)。ケージ内のワイヤーラックには、フードボトルとウォーターボトルが収納されています(図1B)。ケージ内でオートクレーブ滅菌された鉗子は、ケージ内部の表面との接触を必要とするすべての操作に使用されます。ケージ自体には、外側の動物を識別するための取り外し可能なケージカードホルダー用のノッチと、アイソケージラックにドッキングする吸気ノズルとエクスポートノズルがあります(図1C-E)。安全な閉鎖クランプと蓋のタブロックにより、ラックシステムに再度ドッキングする準備ができたときにケージが密閉されます(図1F)。推奨される寝具はAlpha-driであり、オートクレーブ可能な濃縮小屋も推奨されます(図1F)。トランスファーディスクは、無菌マウスを繁殖アイソレーターからアイソケージに移動するために使用され、動物の操作を可能にするために三角形の開口部を備えた回転可能なコンパートメント蓋が含まれています(図1G-H)。ディスクには、小さいサイズ(直径21.6cm)と大きいサイズ(直径28cm)があり、どちらもマウス8匹の容量があります。オートクレーブテープは、ディスクの円周と空気穴に気密シールを作成するために使用され、滅菌剤を浸して滅菌剤を浸した袋で輸送する前に行われます(図1I)。ラックシステム自体には、エアブロワ、ラックレベルのHEPAフィルタステータス、およびラックの非常用バッテリ電源を監視する画面があり、これらはすべてシステムに含まれています(図2A)。密閉されたマグネヘリックゲージは、ケージシステムによって維持される正圧を表示し、自動視覚的なドッキングインジケータはケージのドッキングステータスを示します(黄色のタブアウトは、ケージがドッキングされていないか、ドッキングが失敗したことを意味します)(図2B-D)。また、イソケージの操作には、標準認定のバイオセーフティキャビネットが必要です。

ここで提示するプロトコルは、無菌状態を維持しながら、無菌状態下で無菌マウスを繁殖アイソレーターからアイソケージに成功裏に移送するための適切な方法、ヒトドナー糞便スラリーによる無菌マウスのヒト化、および無菌状態の確認またはさらなる機能研究のための生存能力保存のためのアイソケージに収容されたマウスからの糞便の収集を説明しています。この例では、無菌マウスを、肺がんの免疫療法で治療したヒト被験者のプールされた糞便検体でヒト化し、治療に対するレスポンダーまたはノンレスポンダーとして二分化します。この例では、免疫療法反応に対する反応表現型は、腸内細菌叢のヒト化によってレシピエントマウスに移され、その後、レシピエントマウスに腫瘍細胞をさらに接種して免疫療法で治療することができました。人間の糞便スラリーのプロトコルは、研究者が望む任意のヒトドナーの糞便または任意の疾患の前臨床モデルに容易に適応することができます。このプロトコルを使用すると、任意のヒト糞便ドナー微生物叢を無菌宿主に移植することが可能であり、健康と疾患における微生物叢の役割をさらに調査することができます。

図1:アイソケージディスクとトランスファーディスクの概略図(A)ケージ蓋の下面の上面図、内部ケージレベルのHEPAフィルターとシリコンガスケットシールの位置を示すラベル。(B)ケージの内部を上から見た図で、ワイヤーバーの蓋、内部のウォーターボトル、注ぎ口、およびオートクレーブ可能なチャウを保持するためのワイヤーラック内の位置を示すラベルが付いています。(C)ケージカードホルダーのノッチを示すケージの正面図。(D)蓋が上にあるフルケージの上から見た図で、HEPAフィルターがエアインテークノズルにどのように取り付けられているかを示しています。(E). アイソケージラックシステムにドッキングする吸気ノズルとエクスポートノズルを示すケージの背面図。(F)蓋が上にあるフルケージの側面図で、開いた位置にある安全なクロージャークランプを示すラベルがあり、各クランプに白いタブがそれらを所定の位置にロックします。ケージの内部には、底にAlpha-driの寝具が重ねられており、寝具の中に置かれたエンリッチメント小屋が示唆されています。(G)上部に蓋をしたトランスファーディスクの上から見た図。(H)トランスファーディスクの内部を上から見た図で、動物の操作を可能にする三角形の開口部を備えた回転可能なコンパートメント蓋を示しています。(I)完全に組み立てられたトランスファーディスクの側面図は、繁殖アイソレーターからアイソケージへのトランスファー中に気密シールを作成するオートクレーブテープの配置を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:アイソケージラックシステムの概略図(A)ケージがドッキングされ、エアブロワーの状態、HEPAフィルターの状態、および非常用バッテリーの監視画面を示すラベルを備えた完全なアイソケージラック。ラックの左下には、ラックレベルの HEPA フィルター用のスロットがあります。(B)ラックによって維持される正圧を示す同封のマグネヘリックゲージ。(C)目に見える黄色のドッキングインジケータがないドッキングされたアイソケージで、ラックとエアノズルの間の接続が成功したことを示しています。(D)ラック内の空のスロットで、ラックが所定の位置になく、エアノズルがアイソケージに接続されていないことを示す目に見える自動視覚的なドッキングインジケーターがあります。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

すべての動物実験は、フロリダ大学(UF)の動物施設管理および使用委員会(IACUC)によって承認され、UF動物管理施設(IACUCプロトコル #IACUC202300000005)で実施されました。無菌野生型(GF WT;C57BL/6)マウスは、UF Animal Care Services Germ-free Divisionによってアイソレーターで飼育および維持されました。雌雄混合のGF WTマウスを繁殖アイソレーターから移し、ISOcage Pバイオエクスクルージョンシステムに配置して、微生物の操作を可能にしました。

ヒトの糞便サンプルは、免疫チェックポイント阻害剤(ICI)治療を受けた患者から縦方向の便サンプルを採取した前向き観察研究から得られた¹²。インフォームドコンセントは、Advarra IRB による研究承認後に患者から得られました (MCC#18611、Pro00017235)。被験者は、機能研究のための細菌の生存率を維持することを目的とした液体歯科輸送培地(LDTM)便収集キットを受け取り、完成させました。応答評価では、n=4 サンプルをレスポンダー (R) と、n=6 をノンレスポンダー (NR) として特徴付けました。均質化されたLDTMで保存された患者サンプルを個別に解凍し、それぞれを嫌気性チャンバーに90秒以内で入れ、応答表現型(R:n = 4、NR:n = 6)ごとにプールしました。次に、プールしたサンプルを分注し、このプロトコールで使用するために-80°Cで凍結しました。ドナー糞便の嫌気性コロニー形成単位(CFU)数を決定するために、各被験者の糞便を1 × ^10-5 に段階希釈し、各希釈液の10μLを嫌気性脳心臓注入(BHI)およびルリアベルタニ(LB)寒天プレートに二重に播種し、便1グラムあたりのCFU数を推定しました。各被験者からの等しいCFUを糞便接種サンプルにプールして、マウスに強制しました。

1. ケージとオートクレーブの準備

1. アイソケージの準備
   1. ケージに~500mLの2018SXダイエットまたは任意の強化オートクレーブダイエットをプレフィルし、底にALPHA-dri寝具を重ねます。オートクレーブ可能なエンリッチメントハットをケージベッドに置きます。空の密封されていないウォーターボトルとノズル、および長い幅広の先端の鉗子をワイヤーラックの上に置きます。
   2. オートクレーブサイクルごとに1つのケージ内にデュアルスピーシーズ生物学的インジケーターを食品に入れます。各ケージの外側にケミカルインテグレーターストリップを置きます。
   3. ケージを真空サイクルで121°C、最低15PSIで45分間オートクレーブし、その後30分間乾燥させます。国際標準化機構(ISO)の除染ラックを使用してケージを滅菌し、ケージを密閉し、蒸気を内部のHEPAフィルターに通すことで、ケージが開くまで無菌環境を維持します。
   4. 1 Lのボトルに飲料水を入れ、ゴム製のキャップで密封し、ボトルの表面にケミカルインテグレーターストリップを置きます。121°C、最低15PSIで45分間オートクレーブ処理し、液体用の低速排気プログラムを使用します。
   5. 各ケージに取り付けられたケミカルインテグレーターを目視で確認し、適切なオートクレーブパラメータをすぐに確認することができます。
      注:生物学的インジケーターは、無菌条件下でイソケージを最初に開いたときに取り外す必要があります。生物学的インジケーターを37°Cで24時間インキュベートし、色の変化を観察します。元の青/紫の透明な溶液から黄色または濁った液体への鮮やかな色の変化は、微生物の増殖が存在することを示しています。インジケーターが透明で青/紫色のままであれば、これはそのオートクレーブサイクルにおけるケージ内部の完全な無菌性の確認です。

2.二酸化塩素滅菌剤製剤

注意:二酸化塩素滅菌剤は、一度活性化すると非常に腐食性があります。活性塩素 - 二酸化物滅菌剤は、活性剤と塩基との混合から24時間で期限切れになります。二酸化塩素滅菌剤は煙を発生させ、粘膜表面を刺激し、皮膚と接触すると刺激を引き起こす可能性があります。滅菌剤調製用の部屋がシンクと適切な換気にアクセスできることを確認してください。二酸化塩素滅菌剤を使用するときは、安全ゴーグル、人工呼吸器、耐薬品性手袋を着用し、動物収容施設に必要な個人用保護具(PPE)を着用してください。

1. ミキシングベースとアクティベーター
   1. 標準的な6 Lの容量の二酸化塩素滅菌剤を作るには、まず1 Lのメスシリンダーで1 Lの二酸化塩素滅菌剤ベースを測定し、20 Lの容量のダンクタンクに注ぎます。
   2. 同じメスシリンダーを使用して、4Lの水道水を測定し、ダンクタンクに注ぎます。
   3. ベースと水に使用したメスシリンダーを取っておきます。新しいメスシリンダーを使用して、1 Lの二酸化塩素滅菌活性剤を測定し、ダンクタンクに注ぎます。
   4. アクティベーターをタンクに追加したら、メスシリンダーを使用してタンクの内容物を混合します。
2. アクティベーション
   1. 蓋をダンクタンクに置き、アクティベーターが追加された日時とそれを準備したスタッフの名前を添えて、二酸化塩素滅菌剤としてラベルを付けます。必要に応じて、滅菌剤を混合するために使用されるメスシリンダーを使用して、1Lをスプレーボトルに移すことができます。
   2. ダンクタンクとスプレーボトルをイソケージラックとケージがある動物飼育室に移動します。活性塩素二酸化物滅菌剤は、完全な活性化を確実にするために、使用前に少なくとも20分間放置する必要があります。
      注:大量のケージ(>9)を操作する場合、ダンクタンクに一度に最大12Lを準備できます。1ケージを操作するため、または緊急時には、1.2Lの二酸化塩素滅菌剤を小さな容器に調製し、2つの1Lスプレーボトルに移すことができます。滅菌剤は、無菌マウスの予想される移植の少なくとも1時間前に調製することをお勧めします。.

3.滅菌

1. ドンPPE
   1. 主要なケージマニピュレーターとして、安全ゴーグル、人工呼吸器、耐薬品性手袋、滅菌手術用ガウン、ブーファント、スリーブカバー、シューズカバーを着用してください。PPEの下にスクラブを着用すると、生地が二酸化塩素滅菌剤と接触すると、広範囲にわたる汚れが発生します。
   2. プライマリケージマニピュレータのアシスタントをお勧めします。アシスタントにプライマリケージマニピュレーターと同じPPEを着用してもらいますが、非滅菌の手術用ガウンを着用する場合もあります。
2. バイオセーフティキャビネットの準備
   1. 10枚のワイプを二酸化塩素滅菌ダンクタンクに入れ、完全に浸されていることを確認します。
   2. 浸したワイプをバイオセーフティキャビネットに移動し、キャビネットのすべての表面を後ろから前に向かって、平らな作業面、左側、フードの背面、右側、前面の内部ガラスの順に浸します。バイオセーフティキャビネットの保護されていない表面に触れずにワイプを絞ることにより、これらの表面を非接触で浸漬します。
   3. 1回のクリーニングの後、ワイプを二酸化塩素滅菌ダンクタンクに戻し、浸します。
3. アイソケージの準備
   1. メスシリンダーを使用して少なくとも100mLの二酸化塩素滅菌剤を充填して大きなビニール袋を準備し、バッグを振ってすべての内部表面が浸されていることを確認します。バッグを平らな面に置きます。
   2. ラックから1つのアイソケージを取り外し、二酸化塩素滅菌ダンクタンクに入れて、ケージのすべての表面が液体と接触するようにします。タンクに浸したワイプを使用してケージの表面をさらにこすり洗いし、液体が完全に接触するようにします。
   3. ケージを浸した後、アシスタントに濡れたビニール袋を開けてもらいます。ケージを袋に入れ、すぐにアシスタントに開口部を閉めてもらいます。スプレーボトルを使用して、バッグの開口部に二酸化塩素滅菌剤をスプレーします。使用するすべてのケージについて、次の手順に従います。最大4つのケージを1つの36インチ32インチ48インチバッグに収めることができます。
   4. 必要な数の滅菌済み1Lウォーターボトル(1ケージに2Lの水)を二酸化塩素滅菌ダンクタンクに浸し、それらを別の浸したビニール袋に入れます。すべての消耗品がバッグに入れられたら、バッグを閉じ、スプレーボトルを使用してバッグの開口部に二酸化塩素滅菌剤をスプレーします。
   5. すべてのケージと消耗品が袋詰めされたら、耐薬品性手袋を二酸化塩素滅菌剤に浸します(手袋の開口部に届かないようにできるだけ上まで)。
4. 20分の滅菌期間
   1. 完全な滅菌には、最低20分の液体接触時間が必要です。最後のアイテムが滅菌され、プラスチックの浸漬バッグが閉じられたらすぐに、アシスタントに20分のタイマーを設定してもらいます。タイマーの開始後、耐薬品性手袋が二酸化塩素滅菌剤に浸されていない表面に触れないようにしてください。
   2. バイオセーフティキャビネットの滅菌プロセス(ステップ3.2)を繰り返し実行し、タイマーが20分が経過したことを示します。
   3. アシスタントに、浸したビニール袋の外面を頻繁に振って、ケージとボトルの表面に液体が一貫して接触するようにします。
   4. 20分経過後、アシスタントに濡れたビニール袋を開けてもらい、袋の外面だけに触れるように注意しながら、滅菌されたケージと水筒を見せます。
   5. 滅菌された耐薬品性手袋を使用して、各ケージとボトルを滅菌されたバイオセーフティキャビネットに移動します。バイオセーフティキャビネットに収まらないケージが多すぎる場合は、ビニール袋の開口部を閉じ、各開口部の間に二酸化塩素滅菌剤を浸している限り、残りのケージは無菌状態のままであるため、ビニール袋に入れたままにしてください。

4.無菌マウス移植

1. アイソケージの準備
   1. 密閉されたアイソケージを開くには、蓋の側面にある2つのクランプの白いタブを持ち上げてから、各クランプを横に引き出します。蓋をケージから持ち上げるためには、蓋がケージの底部から離れている必要があります。蓋を逆さまにしてケージの左側に置き、これを滅菌ワークステーションとして使用します。
      注:ケージの蓋やオートクレーブ滅菌された器具バッグの内部を滅菌作業面として使用する代わりに、オートクレーブ滅菌されたドレープを利用することで、表面積が広くなり、エラーが発生した場合にケージの蓋が意図せずに汚染されるのを防ぐことができます。
   2. ワイヤーラック上部のケージ内にある滅菌鉗子を使用して、空のウォーターボトルを取り外し、蓋の内側にセットします。ゴムパッキンを取り外して1Lのウォーターボトルを開け、ウォーターボトルに水を注いで満たします。鉗子を使用してノズルをウォーターボトルに置き、しっかりと押し下げてシールします。
   3. 滅菌鉗子を使用してワイヤーラックを持ち上げ、ケージの底に開口部を空けるために数インチ戻します。滅菌鉗子をワイヤーラックに置き、ハンドルがケージの表面に接触しないようにします。
2. 転送ディスクの使用
   注:訓練を受けた無菌スタッフが、繁殖アイソレーターのケアとメンテナンスを担当しています。繁殖アイソレーターの開設に伴うリスクを考慮して、これらのスタッフは、アイソレーターからアイソケージへの無菌マウスのトランスファーディスク滅菌、調製、および移し替えを行います。プロセスを簡単に説明すると、トランスファーディスクはオートクレーブ可能なシリンダーに準備され、滅菌が可能になります。生物学的指標は、それらの無菌性を検証するために使用されます。トランスファーディスクをシールするためのテープもシリンダー内でオートクレーブ滅菌されています。これらの材料を封入した滅菌シリンダーをトランスファースリーブを介してアイソレーターに取り付け、マウスをケージからディスクに移動します。次に、蓋をディスクに置き、オートクレーブテープを使用してディスクの周囲と空気穴に気密シールを作成します。密閉されたディスクは、すぐにアイソレータの出口ポートに配置されます。次に、家庭用アイソレータのポートキャップを閉じ、ディスクの外側を滅菌剤で完全に綿棒で拭き取り、滅菌剤を浸したバッグに入れ、完全な除染を確保するために20分間監視します。その後、無菌育種スタッフがこれらのディスクを研究スタッフに届けます。マウスは、転写ディスクが密閉されてから30分を超えて密封されたディスクに保持することができないため、このプロトコルのすべての前のステップが、転送ディスクが到着する前に十分な時間で完了していることが不可欠です。
   1. トランスファーディスクを受け取ったら、アシスタントにプラスチックカバーを持って部分的に広げてもらい、トランスファーディスクの浸漬面が露出し、アシスタントが触れないようにします。
   2. トランスファーディスクを受け取ったら、アシスタントにプラスチックカバーを持って部分的に広げてもらい、トランスファーディスクの浸漬面が露出し、アシスタントが触れないようにします。
   3. 二酸化塩素滅菌剤に浸した耐薬品性手袋を着用し、滅菌剤に浸していない表面に触れないように注意しながら、プラスチック包装から転写ディスクを取り出します。次に、滅菌したバイオセーフティキャビネットの平らな面にトランスファーディスクを置きます。
   4. 転写ディスクを開くには、テープをはがし、ディスクの周囲を密封し、バイオセーフティキャビネットの外に廃棄します。トランスファーディスクの蓋を取り外し、バイオセーフティキャビネットの外に捨てます。
   5. トランスファーディスクの内側には、開口部が1つしかない回転式コンパートメントの蓋があります。ケージのワイヤーラックにあらかじめ置かれていた滅菌鉗子を使用して、このコンパートメントの蓋を操作し、移動に必要なマウスへの開口部を移動します。
3. ディスクからアイソケージへのマウスの転送
   1. 鉗子を使用して、プラスチック製のディスクカバーの開口部からマウスの尾の付け根をつかみ、ワイヤーラックとケージの間に前に開いたスペースからマウスを持ち上げてアイソケージに移します。そのケージに向けられたすべてのマウスについて繰り返します。
   2. すべてのマウスをそのアイソケージに移したら、鉗子を使用してワイヤーラックを交換します。次に、ケージの蓋を持ち上げ、鉗子を使用してケージの上部に戻します。
   3. ケージの蓋の各クランプを持ち上げ、ケージの側面を慎重に下げてから、白いタブを押し下げてケージの蓋を密閉します。
   4. ケージが密閉されたら、アシスタントにケージラックのドッキングサイトの各ノズルに二酸化塩素滅菌剤をスプレーしてもらいます。次に、ケージをフードから取り外してアシスタントに渡すと、アシスタントがケージをラックにドッキングできます。
   5. 転送ディスク内の各マウスについて、これらの手順を繰り返します。
4. バイオセーフティキャビネットの清掃
   1. すべてのマウスのアイソケージへの移動が完了したら、フードから破片を空にし、二酸化塩素滅菌剤を染み込ませたワイプで完全に拭き取ります。
   2. フードをイソプロピルアルコールで拭いて、残留二酸化塩素滅菌剤を取り除きます。フードの作業面の下のスペースには、滅菌プロセスから大量の滅菌剤が集められます。ドライワイプで吸収してこれを取り除き、イソプロピルアルコールで拭きます。.
   3. 液体二酸化塩素滅菌剤は、活性化後24時間後にシンクドレンを介して廃棄します。.滅菌剤で汚染された固形物は、通常の廃棄物として廃棄してください。
      注:アイソケージ条件に移された無菌マウスは、介入の前に新しい環境に順応するために1週間放置されます。これにより、研究結果に支障をきたす可能性のある動物が経験するストレスが軽減されます。この1週間の順応期間の終わりに、ステップ6で説明されているように糞便を収集し、介入の前に無菌状態を確認します。.

5. ヒト糞便スラリーの無菌マウスへの経口強制経口投与

1. オートクレーブ強制品の準備
   1. 経口強制経口投与針をセルフシール滅菌ポーチ(マウス1匹につき1本)に入れ、滅菌1mLシリンジをセルフシール滅菌ポーチ(マウス1匹につき1枚)に入れます。これらと600mLのポリプロピレンビーカー(マウス1匹につき1つ)と長い鉗子のペアをオートクレーブセーフバッグに入れ、オートクレーブで滅菌します。
   2. オートクレーブから袋を取り出した直後は、包装用テープで密封し、翌日まで保管してください。
2. 人間の糞便スラリーの調製
   1. 強制経口投与の日に、均質化して嫌気性保存培地(この場合は液体歯科用輸送培地)に保存したヒトの糞便を-80°C冷凍庫から嫌気性チャンバーに移します。均質化された糞便材料を、10mLの円錐管内の滅菌嫌気性生理食塩水で約1:10に希釈します。
   2. ヒトの糞便スラリーを含むチューブをパラフィルムで密封し、ボルテックスで均質化した後、200gで5分間遠心分離して微粒子を沈殿させます。
   3. チューブを嫌気性チャンバーに戻し、上清を別の10mL円錐チューブに移します。.ヒトの糞便上清を含むチューブをパラフィルムで密封し、嫌気性チャンバーから取り出し、二次漏れ防止容器に入れます。コンテナをオートクレーブ処理した強制品の袋と一緒に動物の飼育場所に運びます。
      注:報告目的では、強制経口投与を目的としたヒト糞便の総CFU/mLを推定することが不可欠です。適切なコロニー形成を確保するための最小CFU負荷がどの程度であるかは不明ですが、CFUが高いほど、ドナー便¹³の生着が改善されます。ヒトの糞便のCFU負荷により生着率が低くなる場合は、ヒトの糞便検体を回収してください。生存率保持培地を使用すると、収集された糞便検体からのCFU回収が向上します。ドナー糞便の嫌気性/好気性CFU数を決定するには、好気性および嫌気性BHIおよびLB寒天プレート上で、サンプルを1 x ^10-5 および各希釈のプレート10 μLに連続希釈します。24時間(有酸素性)と48時間(無酸素性)の後、便のグラムあたりCFUを数えます。
3. アイソケージの準備
   1. ステップ2と3を繰り返しますが、唯一の違いは、これらのケージにマウスが収容されていることであり、ラックの取り外しから30分以内に、各アイソケージが滅菌されたフードに配置され、マウスへの空気の流れを可能にするために蓋が通気されるように注意する必要があります。
   2. ステップ5.1および5.2のオートクレーブ滅菌材料バッグとヒト糞便スラリーチューブを、水ボトルと同様の方法で二酸化塩素滅菌剤飽和を介して滅菌します(つまり、滅菌剤に沈めてから滅菌剤に浸したバッグに入れます)。
   3. 20分間の滅菌期間終了後、アイソケージと経口強制経口供給をバイオセーフティキャビネットに移します。オートクレーブ滅菌された供給バッグを中に含まれる長い鉗子に押し付けて穴を開け、供給品を取り外してバッグをフードの外側に廃棄します。
4. 強制品
   1. 残留二酸化塩素滅菌剤がマウスと接触するのを防ぐために、耐薬品性手袋の代わりに新しい滅菌手術用ガウンと滅菌手術用手袋を着用してください。必要に応じて、このプロセスでアシスタントに助けてもらいます。
   2. 各滅菌ポーチを開梱して強制針を準備し、ポーチの内部を乾燥した滅菌済みの休息面として使用します。強制針を各シリンジに接続し、糞便スラリーチューブを開き、200μLの糞便スラリーを各シリンジに引き上げます。
   3. 鉗子を使用して、ケージ内の1匹のマウスの尾の付け根をつかみ、ワイヤーラックに置きます。マウスを擦り傷で優しく拘束し、マウスを直立した垂直位置に保持しながら針を挿入し、糞便スラリーを静かに注入した後、すぐに針を取り外してください。
   4. マウスを滅菌したカップの1つに直接入れて観察します。ケージ内のすべてのマウスについてこのプロセスを繰り返します。すべてのマウスが強制品を受け取った後、鉗子を使用して各マウスをケージベッドに戻し、ステップ4.3.2-4.3.4で説明されているようにケージをシールします。
      注:2つ以上の別々の糞便スラリーが使用されている場合は、バイオセーフティキャビネットと必要なケージと材料の完全な再滅菌が必要です。マウスのグループが無菌のままである場合、これらのマウスは、他のグループが治療される前に、制御強制猶予を受けることをお勧めします。
   5. 手順4.4の手順に従って、二酸化塩素滅菌剤および滅菌剤を浸した材料を廃棄します。人間の糞便スラリーで汚染された材料は生物医学廃棄物として処理し、環境衛生および安全手順に従って廃棄します。

6. 生存率維持のためのヒト化マウスからの便採取

1. オートクレーブ滅菌済み消耗品の準備
   1. 短いブロードチップ鉗子をセルフシール滅菌ポーチ(マウス1匹につき1個)、600mLポリプロピレンビーカー(マウス1匹につき1個)、および長い鉗子のペアをオートクレーブ対応バッグに入れ、便採取手順の1日前にオートクレーブで滅菌します。
   2. オートクレーブから袋を取り出した直後は、包装用テープで密封し、翌日まで保管してください。
2. 保存培地チューブ調製
   1. 嫌気性生存率保存培地を選択します(ここではCary Blairを使用しました)。1 mLの保存培地を滅菌済みに分注し、バイオセーフティキャビネット内のスクリューキャップ2 mLチューブに入れます。最適な保存のためには、糞便:培地の比率を1:10にすることをお勧めします。
   2. 各チューブには油性マーカーを事前にラベル付けしますが、二酸化塩素滅菌剤にさらされると、プラスチック表面から永久マーカーラベルが剥がれる可能性があることに注意してください。別の方法は、チューブにラベルを付けないままにし、収集後すぐに凍結する前にアシスタントにチューブにラベルを付けることです。
   3. これらのチューブを標準的なポリプロピレン製チューブラックにセットして、チューブを直立させて保管しながら、二酸化塩素滅菌剤との接触による滅菌を可能にします。
3. 滅菌ケージとバイオセーフティキャビネット
   1. 手順2と3を繰り返して、アイソケージとバイオセーフティキャビネットを滅菌します。繰り返しになりますが、ラックを取り外してから30分以内に、各アイソケージを滅菌フードに入れ、マウスへの空気の流れを可能にするために蓋を通気するように注意してください。
   2. さらに、オートクレーブ滅菌された供給バッグと準備されたチューブを含むラックを塩素-二酸化物滅菌剤飽和によって滅菌し、ケージが入った浸漬ビニール袋に入れます。目標は、各チューブのすべての表面とラック自体との完全な液体接触です。
4. 糞便サンプルの収集と保管
   1. 20分間の滅菌期間終了後、アイソケージ、オートクレーブ滅菌済み消耗品、チューブラックをバイオセーフティキャビネットに移します。オートクレーブ滅菌された供給バッグを中に含まれる長い鉗子に押し付けて穴を開け、供給品を取り外してバッグをフードの外側に廃棄します。
   2. 残留二酸化塩素滅菌剤がマウスと接触するのを防ぐために、耐薬品性手袋の代わりに新しい滅菌手術用ガウンと滅菌手術用手袋を着用してください。必要に応じて、アシスタントにこのプロセスを手伝ってもらいます。
   3. 鈍い先端の鉗子は、ポーチを開梱し、ポーチの内側の表面を無菌エリアとして使用して準備します。チューブラックをバイオセーフティフードの表面に置きます。
   4. 長い鉗子を使用して、ケージ内の1匹のマウスの尾の付け根をつかみ、それらを滅菌したカップの1つに直接置いて観察します。ケージ内のすべてのマウスについてこのプロセスを繰り返します。
   5. 少なくとも2つの新しく通過した糞便ペレットが生成されるまでマウスを観察します。
      1. 鈍い先端の鉗子を使用して、糞便ペレットを拾い上げ、チューブに直接入れます。すぐにスクリューキャップの蓋を密封し、アシスタントに渡します。
      2. アシスタントにチューブにラベルを付けてもらい、ボルテックスによってスツールをすぐに均質化します。均質になったら、チューブを液体窒素でスナップ凍結し、-80°Cで長期間保存します。
   6. ケージ内の各マウスについて、便収集プロセスを繰り返します。糞便収集後、各マウスをホームケージに交換し、ケージをラックに再度ドッキングします。手順4.4を繰り返して、フードを清掃し、廃棄物を処分します。

結果

ICIレスポンダーおよびノンレスポンダー表現型(プロトコルで以前に記載)によってプールされたヒト糞便サンプルを、グループごとに3つのアイソケージ(n = 1-2マウス/ケージ、レスポンダーのn = 6、ノンレスポンダーのn = 5)に飼育された男女混合GF-WTマウスに強制経口投与しました。マウスは、移植後1週間順応させられました。次に、これらのマウスから糞便サンプル?...

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、実験的なアイソケージに収容された無菌マウスのヒト化のための再現性のある非常に詳細な方法を提供します。ヒトを対象とする糞便群集をマウス宿主に排他的に移植する能力は、マイクロバイオーム研究にとって非常に貴重です。マウス特異的な共生微生物叢による汚染がなければ、ヒトに常在する細菌がさまざまな健康状態や疾患...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL BD Slip Tip Syringe sterile, single use	Fisher Scientific	309659
2.0 mL Screw Cap Tube, NonKnurl,Skirted,Natural, E-Beam Sterile tube w/ attached cap	Fisher Scientific	14-755-228
36 x 32 x 48" 3 Mil Gusseted Poly Bags	Uline	S-13455
5 gallon tank of Exspor chlorine-dioxide sterilant activator	Ecolab	6301680
5 gallon tank of Exspor chlorine-dioxide sterilant base	Ecolab	6301194
600 mL polypropylene beakers	Fisher Scientific	S01914
ALPHA-dri bedding	Shepherd Specialty Papers
Anaerobic chamber	Coy Lab Products	Type B
Biosafety cabinet class 2	Nuaire
Certified IsoCage autoclavable HEPA filter XT Extreme Temperature	Tecniplast	1245ISOFHXT
Clear Lens LPX IQuity Safety Goggles	Fastenal	922205455
DuPont Tyvek Sleeve - 18"	Uline	S-13893E
DWK Life Sciences DURAN 45 mm Push-on Natural Rubber Cap	Fisher Scientific	01-258-107	Rubber cap for 1 L autclave bottles
Dynalon Quick Mist HDPE Sprayer Bottles	Fisher Scientific	03-438-12B
Fisherbran Polypropylene Graduated Cylinders	Fisher Scientific	03-007-44
Fisherbran Dissecting Blunt-Pointed Forceps	Fisher Scientific	08-887
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches	Fisher Scientific	01-812-51
Fisherbrand Straight Broad Strong Tip General Application Forceps	Fisher Scientific	16-100-107
Fisherbrand lead Free Autoclave Tape	Fisher Scientific	15-901-110
Gavage needle, reusable stainless steel. Straight. 22 gauge needle, tip diameter 1.25 mm, length 38 mm or 1.5 inches(doz)	Braintree Scientific	N-PK 020
H-B Instrument Durac Timer	Fisher Scientific	13-202-015
IsoPositive Cages and Rack (i.e. isocages)	Tecniplast	ISO30P	30 cages (6 w x 5 h), single sided
Nitrile Chemical Resistant Gloves Size S (7), M (8) or L (9) 18” long, 22 mil, Ansell	Grainger	4T426
Nitrile Exam Gloves, Medium, Non-Sterile, Powder-Free	MedSupply Partners	KG-1101M
Olive / Magenta Bayonet Gas & Vapor Cartridges / Particulate Filter 2Ct	3M/Fastenal	50051138541878
Polycarbonate RadDisk Mini for Mice 8-75 x 4	Braintree Scientific	IRD-P M
Polypropylene Bouffant Caps - 24", Blue	Uline	S-10480BLU
Puritan Cary-Blair Medium, 5 mL	Fisher Scientific	22-029-646
S, M and L Blue Silicone Dual-Mode Head Harness Half Mask Respirator	3M/Fastenal	50051131370826
Sgpf Series Sterile Powder Free Latex Gloves, CT International, Thickness = 6.5 mm, Length = 30.5 cm (12), Glove Size = 8.5, Glove Color = White	Fisher Scientific	18-999-102F
Skid Resistant Shoe Cover	Uline	S-25639
Surgical Gown, Towel, Sterile, Large, 32/cs	Thomas Scientific	KIM 95111
Teklad Global 18% protein extruded rodent diet (sterilizable)	Inotiv	2018SX
Thermo Scientific Nalgene Heavy-Duty Rectangular LLDPE Tank with Cover (20 L volume)	Thermo Scientific	14-831-330J
VERIFY Dual Species Self Contained Biological Indicators	Steris Healthcare	S3061
WypAll L40 1⁄4 Fold Wipers	Uline	S-8490