Preparação e Manutenção do Experimento de Gaiola IsoPositivo de Bioexclusão para Transplante Fecal Humano em Camundongos Livres de Germes

Resumo

Este protocolo descreve as melhores práticas para transferência e alojamento de camundongos livres de germes em isoladores experimentais de gaiola única (isocages), mantendo condições estéreis. Métodos para transplante fecal em camundongos livres de germes e a coleta de bactérias viáveis desses camundongos "humanizados" intestinais para outras aplicações são discutidos.

Resumo

Camundongos livres de germes são uma importante ferramenta de investigação para entender a contribuição dos microrganismos na saúde e doença do hospedeiro, permitindo avaliar o papel específico de indivíduos, grupos definidos ou complexos de microrganismos na resposta do hospedeiro. Tradicionalmente criados e criados em isoladores de filme flexível ou semirrígidos, a criação de camundongos livres de germes e a manipulação experimental são caras e exigem vários funcionários treinados e uma grande área ocupada em instalações de alojamento de animais. O sistema de gaiola IsoPositive permite a manipulação experimental de camundongos livres de germes em gaiolas isoladas individuais, hermeticamente fechadas e de pressão positiva (isocages), reduzindo custos e permitindo maior flexibilidade nas manipulações experimentais.

Aqui, um protocolo é descrito para transferir camundongos livres de germes de isoladores reprodutores para isogaiolas e subsequente transferência fecal de fezes de doadores humanos para camundongos para criar camundongos "humanizados" intestinais estáveis de longo prazo para estudos futuros. Os materiais e a preparação necessários para a utilização do sistema de isocário são descritos, incluindo o uso de esterilizante químico esterilizante de dióxido de cloro para limpar gaiolas, suprimentos, equipamentos e equipamentos de proteção individual. Os métodos para confirmar o status livre de germes de camundongos transferidos e como determinar a contaminação no sistema de gaiola são discutidos. O procedimento para a criação, incluindo cama, comida e abastecimento de água, é discutido mais adiante. O protocolo para preparação de chorume fecal humano e gavagem em camundongos livres de germes para criar camundongos "humanizados" intestinais, juntamente com a coleta de fezes para monitorar a composição da comunidade microbiana desses camundongos, são descritos. Um experimento ilustra que duas semanas após o transplante fecal humano permite a colonização estável da microbiota do doador nos hospedeiros murinos, permitindo o uso experimental subsequente. Além disso, a coleta de fezes de camundongos humanizadas em meios de preservação de viabilidade, permitindo o uso em outros experimentos funcionais, é descrita. No geral, esses métodos permitem o estabelecimento seguro e eficaz de comunidades de camundongos humanizados em gaiolas gnotobióticas experimentais para posterior manipulação.

Introdução

Camundongos livres de germes são uma ferramenta essencial no repertório de pesquisadores de microbioma, permitindo dissecar a contribuição da microbiota na saúde do hospedeiro e nos estados de doença. Camundongos livres de germes nascem completamente estéreis e permanecem axênicos por toda a vida¹. A colonização de camundongos livres de germes com cepas bacterianas específicas permite estudos causais entre esses táxons e funções metabólicas, imunológicas ou outras funções do hospedeiro 2,3,4,5. Particularmente vantajosa é a capacidade de "humanizar" camundongos livres de germes no nível da microbiota transplantando fezes obtidas de doadores humanos e, quando alojados em condições de barreira, evitar a contaminação por microrganismos derivados de murinos¹. Essa abordagem permitiu muitas descobertas importantes no campo do microbioma, por exemplo, o efeito do microbioma intestinal humano na resposta à imunoterapia contra o câncer ^6,7,8.

No entanto, embora camundongos humanizados livres de germes sejam inestimáveis para os esforços de pesquisa no campo do microbioma, existem muitas limitações que inibiram a adaptação mais ampla dessa abordagem. Camundongos livres de germes são criados e mantidos em grandes isoladores semirrígidos ou de filme flexível, mas experimentos funcionais requerem a configuração de mini-isoladores separados, com um mini-isolador abrigando várias gaiolas, mas apenas sob uma condição experimental. Essa abordagem de mini-isolador aumenta a pegada espacial e o custo, limitando severamente o número de condições experimentais que podem ser investigadas em um experimento e o número de experimentos que podem ser executados em paralelo. Uma solução promissora é o uso de um sistema de gaiola modular individual chamado Sistema de Bioexclusão ISOcage P (aqui referido como sistema de isocage) ^{9 , 10} . O sistema de isocáge permite a manipulação experimental de camundongos livres de germes em gaiolas isoladas individuais, hermeticamente fechadas e de pressão positiva, permitindo condições experimentais separadas entre cada gaiola em vez de entre cada mini-isolador. Com a técnica asséptica adequada, os animais podem ser alojados em isocages por até 12 semanas em condições livres de germes ou humanizados por transplante fecal humano para uso em qualquer abordagem experimental compatível (ou seja, pode ser realizado em condições assépticas). Vários experimentos independentes podem ser executados em paralelo usando o sistema de isocagem, e o espaço ocupado e o custo são drasticamente menores do que a execução de vários experimentos em mini-isoladores.

O objetivo da criação de camundongos livres de germes em isoladores de reprodução de filme flexível é preservar cuidadosamente o status axênico¹¹. As técnicas usadas para monitorar o status livre de germes incluem swabs de rotina de superfícies corporais de camundongos e cavidades orais, bem como a coleta asséptica de amostras fecais, que são cultivadas e testadas por ensaios comerciais baseados em PCR. Testes bacterianos, sorológicos e fúngicos dessas amostras são necessários para determinar o status livre de germes¹¹. Quando camundongos livres de germes são transferidos de isoladores reprodutores para isocages para uso experimental, os camundongos são esfregados e testados para validar seu status livre de germes após a transferência. As verificações de esterilidade do Isocángo são realizadas por meio da coleta asséptica de amostras fecais, que são então cultivadas para detecção de contaminantes bacterianos, virais e fúngicos. É necessário coletar e registrar cuidadosamente os resultados dessas verificações de esterilidade desde o nascimento até o final de um protocolo experimental para validar o status livre de germes desses camundongos.

O sistema de isogaiola é composto por gaiolas individuais (Figura 1), discos de transferência para transporte para fora dos isoladores de reprodução (Figura 1) e o rack de isocas, que abriga as gaiolas (Figura 2). Cada isocage contém um filtro de ar particulado de alta eficiência (HEPA) no nível da gaiola instalado na entrada de ar de alimentação e uma junta de silicone que faz uma vedação hermética quando fechada, garantindo que nenhum contaminante possa entrar na gaiola através do ar (Figura 1A). Esta tampa de gaiola pode ser usada como uma superfície de trabalho estéril quando colocada de cabeça para baixo dentro de um gabinete de biossegurança esterilizado (Figura 1A). Uma grade dentro da gaiola contém a garrafa de comida e água (Figura 1B). As pinças autoclavadas dentro da gaiola são usadas para todas as manipulações que requerem contato com as superfícies internas da gaiola. A gaiola em si tem entalhes para um porta-cartões de gaiola removível para identificar animais do lado de fora e bicos de entrada e exportação de ar que se encaixam no rack de isocage (Figura 1C-E). Fechamento seguro clamps e uma trava de aba na tampa vedam a gaiola quando ela estiver pronta para ser reencaixada no sistema de rack (Figura 1F). A roupa de cama sugerida é Alpha-dri, e uma cabana de enriquecimento autoclavável também é recomendada (Figura 1F). Os discos de transferência são usados para mover camundongos livres de germes dos isoladores reprodutores para as isócages e contêm uma tampa de compartimento giratório com uma abertura triangular para permitir a manipulação de animais (Figura 1G-H). Os discos vêm em tamanhos pequenos (21,6 cm de diâmetro) e grandes (28 cm de diâmetro), ambos com capacidade para oito ratos. A fita autoclavada é usada para criar vedações herméticas na circunferência e nos orifícios de ar do disco, o que é realizado antes da imersão com esterilizante e transporte em um saco embebido em esterilizante (Figura 1I). O próprio sistema de rack possui uma tela para monitorar os sopradores de ar, o status do filtro HEPA no nível do rack e a energia da bateria de emergência para o rack, que são recursos incluídos no sistema (Figura 2A). Um medidor Magnehelic fechado exibe a pressão positiva mantida pelo sistema de gaiola e um indicador visual automático de acoplamento mostra o status de acoplamento das gaiolas (a aba amarela significa que nenhuma gaiola está acoplada ou que o encaixe não foi bem-sucedido) (Figura 2B-D). Também é necessário para a manipulação de isocages um gabinete de biossegurança certificado padrão.

O protocolo aqui apresentado descreve os métodos adequados para a transferência bem-sucedida de camundongos livres de germes de isoladores reprodutores sob condições assépticas para as isocas, mantendo o status livre de germes, a humanização de camundongos livres de germes com chorume fecal de doadores humanos e a coleta de fezes de camundongos alojados na isocage para confirmação do status livre de germes ou preservação da viabilidade para estudos funcionais adicionais. Neste exemplo, camundongos livres de germes são humanizados com amostras fecais agrupadas de seres humanos tratados com imunoterapia para câncer de pulmão e dicotomizados como respondedores ou não respondedores à terapia. Nesse caso, o fenótipo de resposta à resposta à imunoterapia foi transferido pela humanização da microbiota intestinal para os camundongos receptores, que poderiam então ser inoculados com células tumorais e tratados com imunoterapia. O protocolo de chorume fecal humano pode ser prontamente adaptado a qualquer fezes de doador humano ou a qualquer modelo pré-clínico de doença que o investigador desejar. Usando este protocolo, é possível transferir qualquer microbiota de doador fecal humano para o hospedeiro livre de germes, permitindo uma investigação mais aprofundada sobre o papel da microbiota na saúde e na doença.

Figura 1: Diagrama esquemático dos discos de isociação e transferência. (A) Vista de cima para baixo da parte inferior da tampa da gaiola, com etiquetas indicando a localização do filtro HEPA interno no nível da gaiola e a vedação da junta de silicone. (B) Vista de cima para baixo do interior da gaiola, com etiquetas indicando a tampa da barra de arame, a garrafa de água interna e o bico, e a localização na grelha para armazenar ração autoclavável. (C) Vista frontal da gaiola mostrando entalhes para o titular do cartão da gaiola. (D) Vista de cima para baixo de uma gaiola completa com a tampa na parte superior, mostrando como o filtro HEPA está instalado no bocal de entrada de ar. (E). Vista traseira da gaiola mostrando a entrada de ar e os bicos de exportação que se encaixam no sistema de rack de isocage. (F) Vista lateral de uma gaiola completa com a tampa no topo, com etiquetas indicando os grampos de fechamento seguro na posição aberta, com abas brancas em cada grampo que os travam no lugar. O interior da gaiola mostra roupas de cama Alpha-dri em camadas na parte inferior e uma cabana de enriquecimento sugerida colocada na cama. (G) Vista de cima para baixo dos discos de transferência com a tampa na parte superior. (H) Vista de cima para baixo do interior do disco de transferência, mostrando a tampa do compartimento giratório com uma abertura triangular para permitir a manipulação de animais. (I) Vista lateral do disco de transferência totalmente montado mostrando a colocação de fita autoclavada, que cria uma vedação hermética durante a transferência do isolador de reprodução para o isocage. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Diagrama esquemático do sistema de rack de isocage. (A) Rack de isocage completo com gaiolas acopladas e uma etiqueta indicando a tela de monitoramento do status do soprador de ar, status do filtro HEPA e bateria de emergência. No lado inferior esquerdo do rack está o slot para o filtro HEPA no nível do rack. (B) Medidor Magnehelic fechado mostrando a pressão positiva mantida pelo rack. (C) Uma instalação acoplada sem indicador de encaixe amarelo visível, demonstrando uma conexão bem-sucedida entre o rack e os bicos de ar. (D) Uma ranhura vazia no rack, com um indicador visual de encaixe automático visível indicando que nenhum rack está no lugar e não há conexão dos bicos de ar com um isocage. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Flórida (UF) e realizados nas Instalações de Cuidados com Animais da UF (Protocolo IACUC #IACUC202300000005). Colônias de espécies selvagens livres de germes (GF WT; C57BL/6) foram criados e mantidos em isoladores pela Divisão Livre de Germes da UF Animal Care Services. Camundongos GF WT de gênero misto foram transferidos de isoladores de reprodução e colocados no sistema de bioexclusão ISOcage P para permitir a manipulação microbiana.

Amostras fecais humanas foram obtidas de um estudo observacional prospectivo que coletou amostras longitudinais de fezes de pacientes que receberam tratamento com inibidor de checkpoint imunológico (ICI)¹². O consentimento informado foi obtido dos pacientes após a aprovação do estudo pelo Advarra IRB (MCC#18611, Pro00017235). Os indivíduos receberam e completaram um kit de coleta de fezes de meio de transporte dentário líquido (LDTM) destinado a preservar a viabilidade bacteriana para estudos funcionais. A avaliação da resposta caracterizou n=4 amostras como respondedoras (R) e n=6 como não respondedoras (NR). As amostras homogeneizadas de pacientes preservadas com LDTM foram descongeladas individualmente, cada uma colocada em uma câmara anaeróbica por não mais de 90 s e agrupadas por fenótipo de resposta (R: n = 4, NR: n = 6). As amostras agrupadas foram então aliquotadas e congeladas a -80 °C para uso neste protocolo. Para determinar as contagens de unidades formadoras de colônias anaeróbias (UFC) das fezes do doador, as fezes de cada indivíduo foram diluídas em série para 1 × ^10-5, e 10 μL de cada diluição foram semeados em duplicata em placas anaeróbicas de infusão cerebral cardíaca (BHI) e Luria Bertani (LB) e contagens de UFC por grama de fezes estimadas. UFC igual de cada indivíduo foi agrupada em amostras de inóculo fecal para gavagem em camundongos.

1. Preparação de gaiolas e autoclavagem

1. Preparação de isocário
   1. Encha previamente as gaiolas com ~ 500 mL de dieta 2018SX ou qualquer dieta autoclavável fortificada desejada e cubra o fundo com roupa de cama ALPHA-dri. Coloque uma cabana de enriquecimento autoclavável na cama da gaiola. Coloque uma garrafa de água vazia e não lacrada e um bico e uma pinça longa de ponta larga em cima da gradinha.
   2. Coloque um indicador biológico de duas espécies no alimento dentro de uma gaiola por ciclo de autoclave. Coloque uma tira integradora química na parte externa de cada gaiola.
   3. Autoclave as gaiolas em um ciclo de vácuo por 45 min a 121 °C e um mínimo de 15 PSI seguido de 30 min de tempo de secagem. Esterilize as gaiolas usando um rack de descontaminação da organização internacional de padronização (ISO) que permite que as gaiolas permaneçam seladas e o vapor passe pelo filtro HEPA interno, que mantém o ambiente estéril até que a gaiola seja aberta.
   4. Encha garrafas de 1 L com água potável, feche com tampas de borracha e coloque uma tira integradora química na superfície da garrafa. Autoclave a 121 °C e um mínimo de 15 PSI por 45 min, usando o programa de exaustão lenta para líquidos.
   5. Verifique visualmente os integradores químicos afixados em cada gaiola para verificação imediata dos parâmetros apropriados da autoclave.
      NOTA: O indicador biológico deve ser removido na primeira abertura do isocage em condições estéreis. Incubar o indicador biológico durante 24 h a 37 °C e observar quaisquer alterações de cor. Uma mudança de cor vívida da solução transparente azul/roxa original para um líquido amarelo ou turvo indica que o crescimento microbiano está presente. Se o indicador permanecer claro e de cor azul/púrpura, isso é a confirmação da esterilidade completa do interior das gaiolas nesse ciclo de autoclave.

2. Preparação esterilizante de dióxido de cloro

CUIDADO: O esterilizante de dióxido de cloro é extremamente corrosivo uma vez ativado. O esterilizante de dióxido de cloro ativado expira 24 h a partir da mistura do ativador com a base. O esterilizante de dióxido de cloro produz vapores, que podem ser irritantes para as superfícies mucosas e causar irritação em contato com a pele. Certifique-se de que a sala para preparação do esterilizante tenha acesso a uma pia e ventilação adequada. Use óculos de segurança, respirador e luvas resistentes a produtos químicos ao trabalhar com esterilizante de dióxido de cloro, além do equipamento de proteção individual (EPI) necessário para a instalação de alojamento de animais.

1. Base de mistura e ativador
   1. Para fazer um volume padrão de 6 L de esterilizante de dióxido de cloro, primeiro meça 1 L de base esterilizante de dióxido de cloro em um cilindro graduado de 1 L e despeje em um tanque de imersão de volume de 20 L.
   2. Usando o mesmo cilindro graduado, meça e despeje 4 L de água da torneira no tanque de imersão.
   3. Separe o cilindro graduado usado para a base e a água. Use um novo cilindro graduado para medir 1 L de ativador esterilizante de dióxido de cloro e despeje-o no tanque de imersão.
   4. Uma vez que o ativador tenha sido adicionado ao tanque, use o cilindro graduado para misturar o conteúdo do tanque.
2. Ativação
   1. Coloque a tampa no tanque de imersão e rotule-o como esterilizante de dióxido de cloro com a data e hora em que o ativador foi adicionado e o nome da equipe que o preparou. Se desejado, o cilindro graduado usado para misturar o esterilizante pode ser usado para transferir 1 L para um borrifador.
   2. Mova o tanque de imersão e os frascos de spray para a sala de alojamento dos animais, onde o rack e as gaiolas do Isocage estão localizados. O esterilizante de dióxido de cloro ativado deve permanecer por pelo menos 20 minutos antes do uso para garantir a ativação completa.
      NOTA: Para manipular grandes quantidades de gaiolas (>9), até 12 L podem ser preparados de uma só vez no tanque de imersão. Para manipular 1 gaiola ou em caso de emergência, 1,2 L de esterilizante de dióxido de cloro pode ser preparado em um recipiente menor e depois transferido para 2 frascos de spray de 1 L. Recomenda-se que o esterilizante seja preparado pelo menos 1 h antes da transferência prevista de camundongos livres de germes.

3. Esterilização

1. Use EPI
   1. Como manipulador primário da gaiola, use óculos de segurança, respirador, luvas resistentes a produtos químicos, avental cirúrgico estéril, bufante, capas de manga e capas de sapato. Use esfregões embaixo do EPI, pois qualquer contato do tecido com esterilizante de dióxido de cloro resultará em manchas extensas.
   2. Recomenda-se um assistente para o manipulador primário da gaiola. Faça com que o assistente use o mesmo EPI que o manipulador primário da gaiola, embora possa usar um avental cirúrgico não estéril.
2. Preparando o gabinete de biossegurança
   1. Coloque 10 lenços no tanque de imersão de esterilizante de dióxido de cloro e certifique-se de que estejam completamente encharcados.
   2. Mova os lenços embebidos para o gabinete de biossegurança e molhe todas as superfícies do gabinete na seguinte ordem de trás para frente: superfície de trabalho plana, lado esquerdo, parte de trás do capô, lado direito e vidro interno frontal. Realize a imersão sem contato das superfícies não protegidas do gabinete de biossegurança, espremendo os lenços sobre essas superfícies sem tocá-las.
   3. Após uma rodada de limpeza, coloque os lenços de volta no tanque de imersão do esterilizante de dióxido de cloro para mergulhar.
3. Preparando as isocages
   1. Prepare um saco plástico grande enchendo-o com pelo menos 100 mL de esterilizante de dióxido de cloro usando um cilindro graduado e agite o saco para garantir que todas as superfícies internas estejam encharcadas. Coloque o saco em qualquer superfície plana.
   2. Remova um único isocage do rack e coloque-o no tanque de imersão de esterilizante de dióxido de cloro para que todas as superfícies da gaiola entrem em contato com o líquido. Use os lenços embebidos no tanque para esfregar ainda mais as superfícies da gaiola para garantir o contato completo com o líquido.
   3. Depois de molhar a gaiola, peça ao assistente que abra o saco plástico encharcado. Coloque a gaiola no saco e peça ao assistente que feche imediatamente a abertura. Pulverize a abertura do saco com esterilizante de dióxido de cloro usando o borrifador. Siga este procedimento para cada gaiola a ser usada; Até quatro gaiolas podem caber em um único saco de 36" 32" 48".
   4. Mergulhe quantas garrafas de água esterilizadas de 1 L forem necessárias (1 L de água para 2 gaiolas) no tanque de imersão de esterilizante de dióxido de cloro e coloque-as em outro saco plástico embebido. Quando todos os suprimentos tiverem sido colocados no saco, feche o saco e borrife a abertura do saco com esterilizante de dióxido de cloro usando o borrifador.
   5. Depois que todas as gaiolas e suprimentos estiverem ensacados, mergulhe as luvas resistentes a produtos químicos em esterilizante de dióxido de cloro (o mais alto possível nas luvas sem atingir a abertura).
4. Período de esterilização de 20 minutos
   1. A esterilização completa requer um mínimo de 20 minutos de tempo de contato com o líquido. Assim que o último item for esterilizado e o saco plástico de imersão estiver fechado, peça ao assistente que defina um cronômetro de 20 minutos. Certifique-se de que, após o início do cronômetro, as luvas resistentes a produtos químicos não toquem em nenhuma superfície não embebida em esterilizante de dióxido de cloro.
   2. Execute o processo de esterilização do gabinete de biossegurança (etapa 3.2) repetidamente até que o cronômetro indique que 20 minutos se passaram.
   3. Peça ao assistente que agite frequentemente as superfícies externas do saco plástico embebido para garantir um contato consistente do líquido com as superfícies internas da gaiola e da garrafa.
   4. Após o período de 20 minutos, peça ao assistente que abra o saco plástico encharcado para revelar as gaiolas e garrafas de água esterilizadas, tomando cuidado para tocar apenas nas superfícies externas do saco.
   5. Usando as luvas esterilizadas resistentes a produtos químicos, mova cada gaiola e garrafa para o gabinete de biossegurança esterilizado. Se houver muitas gaiolas para caber no gabinete de biossegurança, deixe as gaiolas restantes nos sacos plásticos, pois elas permanecerão estéreis enquanto a abertura do saco plástico estiver fechada e embebida em esterilizante de dióxido de cloro entre cada abertura.

4. Transferência de mouse livre de germes

1. Preparando as isocages
   1. Para abrir a isocagem hermeticamente fechada, levante as abas brancas nos dois grampos nas laterais da tampa e, em seguida, puxe cada grampo para os lados. A tampa deve estar livre da parte inferior da gaiola para levantar a tampa da gaiola. Coloque a tampa de cabeça para baixo à esquerda da gaiola e use-a como uma estação de trabalho estéril.
      NOTA: Uma alternativa ao uso de tampas de gaiola ou o interior de bolsas de instrumentos autoclavadas como superfície de trabalho estéril é utilizar cortinas autoclavadas, que fornecem uma área de superfície maior e evitam a contaminação não intencional da tampa da gaiola se um erro for cometido.
   2. Usando a pinça estéril encontrada dentro da gaiola em cima da gradinha, remova a garrafa de água vazia e coloque-a na parte interna da tampa. Abra a garrafa de água de 1 L removendo a vedação de borracha e despeje a água na garrafa de água para enchê-la. Coloque o bico na garrafa de água usando a pinça e pressione firmemente para selar.
   3. Use uma pinça estéril para levantar a gradinha e recue-a vários centímetros para permitir uma abertura no fundo da gaiola. Coloque a pinça estéril na grelha, certificando-se de que as alças não entrem em contato com as superfícies da gaiola.
2. Uso do disco de transferência
   NOTA: Pessoal treinado e livre de germes é responsável pelo cuidado e manutenção dos isoladores de reprodução. Dados os riscos associados à abertura de isoladores de reprodução, esses funcionários realizam a esterilização do disco de transferência, preparação e transferência de camundongos livres de germes de isoladores para isócages. Para descrever brevemente o processo, os discos de transferência são preparados em um cilindro autoclavável para permitir a esterilização. Indicadores biológicos são usados para verificar sua esterilidade. A fita para selar os discos de transferência também é autoclavada dentro do cilindro. O cilindro esterilizado que envolve esses materiais é preso por meio de uma luva de transferência ao isolador e os camundongos são movidos das gaiolas para o disco. A tampa é então colocada no disco e a fita autoclavada é usada para criar uma vedação hermética na circunferência do disco e nos orifícios de ar. O disco selado é imediatamente colocado na porta de saída do isolador. A tampa da porta do isolador doméstico é então fechada e a parte externa do disco é completamente esfregada com esterilizante e colocada em um saco embebido em esterilizante, monitorado por 20 min para garantir a descontaminação completa. A equipe de reprodução livre de germes entrega esses discos à equipe de estudo. Os mouses não podem ser mantidos no disco selado por mais de 30 minutos a partir do momento em que o disco de transferência é selado, por isso é essencial que todas as etapas anteriores deste protocolo tenham sido concluídas com bastante antecedência antes da chegada do disco de transferência.
   1. Após o recebimento do disco de transferência, peça ao assistente que segure e desembrulhe parcialmente a tampa plástica para que a superfície encharcada do disco de transferência fique exposta, mas não tocada pelo assistente.
   2. Após o recebimento do disco de transferência, peça ao assistente que segure e desembrulhe parcialmente a tampa plástica para que a superfície encharcada do disco de transferência fique exposta, mas não tocada pelo assistente.
   3. Usando luvas resistentes a produtos químicos embebidas em esterilizante de dióxido de cloro, remova o disco de transferência da embalagem plástica, tomando cuidado para não tocar em nenhuma superfície não embebida em esterilizante. Em seguida, coloque o disco de transferência na superfície plana do gabinete de biossegurança esterilizado.
   4. Para abrir o disco de transferência, retire a fita, sele a circunferência do disco e descarte-a fora do gabinete de biossegurança. Remova a tampa do disco de transferência e descarte-o fora do gabinete de biossegurança.
   5. Dentro do disco de transferência há uma tampa de compartimento giratória com uma única abertura. Use a pinça estéril previamente apoiada na grade da gaiola para manipular a tampa deste compartimento para mover a abertura para o mouse necessário para a transferência.
3. Transferência de mouses do disco para o isocage
   1. Usando a pinça, segure a base da cauda do mouse através da abertura na tampa do disco de plástico e levante e transfira o mouse para a isocage através do espaço aberto anteriormente entre a grade e a gaiola. Repita para todos os ratos destinados a essa gaiola.
   2. Depois que todos os camundongos forem transferidos para essa isocagem, substitua a grade usando a pinça. Em seguida, levante a tampa da gaiola e coloque-a de volta em cima da gaiola usando a pinça.
   3. Levante cada grampo da tampa da gaiola e abaixe cuidadosamente as laterais da gaiola, seguido de empurrar para baixo as abas brancas para selar a tampa da gaiola.
   4. Depois que a gaiola estiver selada, peça ao assistente que borrife cada bico do local de encaixe no rack da gaiola com esterilizante de dióxido de cloro. Em seguida, remova a gaiola do capô e passe-a para o assistente, que pode encaixar a gaiola no rack.
   5. Repita essas etapas para cada mouse no disco de transferência.
4. Limpeza do gabinete de biossegurança
   1. Após a conclusão de todas as transferências de camundongos para o isocage, esvazie o capô de quaisquer detritos e limpe completamente com lenços umedecidos em esterilizante de dióxido de cloro.
   2. Limpe o capô com álcool isopropílico para remover o esterilizante de dióxido de cloro residual. O espaço sob a superfície de trabalho do exaustor coleta um grande volume de esterilizante do processo de esterilização. Remova isso por absorção com lenços secos e limpe com álcool isopropílico.
   3. Descarte o esterilizante de dióxido de cloro líquido através do ralo da pia 24 h após a ativação. Descarte materiais sólidos contaminados com esterilizante como lixo comum.
      NOTA: Camundongos livres de germes transferidos para condições de isocage são deixados por 1 semana para se aclimatar ao novo ambiente antes de qualquer intervenção. Isso reduz o estresse experimentado pelos animais, o que pode interferir nos resultados do estudo. No final deste período de aclimatação de 1 semana, colete as fezes conforme descrito na etapa 6 para confirmar o status livre de germes antes de qualquer intervenção.

5. Gavagem oral de pasta fecal humana em camundongos livres de germes

1. Preparação de suprimentos de gavagem autoclavada
   1. Coloque as agulhas de gavagem oral em bolsas de esterilização autovedantes (1 por camundongo) e seringas estéreis de 1 mL em bolsas de esterilização autovedantes (1 por camundongo) 1 dia antes do procedimento de gavagem oral. Coloque estes e 600 mL de béqueres de polipropileno (1 por mouse) e um par de pinças longas em um saco seguro para autoclave e esterilize em autoclave.
   2. Imediatamente após a remoção do saco da autoclave, feche o saco com fita adesiva e guarde-o até o dia seguinte.
2. Preparando a pasta fecal humana
   1. No dia da gavagem, transfira as fezes humanas homogeneizadas e armazenadas em meios de preservação anaeróbicos (neste caso, meios de transporte dentário líquidos) do freezer a -80 ° C para a câmara anaeróbica. Diluir o material fecal homogeneizado aproximadamente 1:10 em solução salina anaeróbica estéril em um tubo cônico de 10 mL.
   2. Selar o tubo que contém a pasta fecal humana com parafilme, homogeneizar por vórtice e, em seguida, centrifugar a 200 g durante 5 min para sedimentar as partículas.
   3. Coloque o tubo de volta na câmara anaeróbica e transfira o sobrenadante para outro tubo cônico de 10 mL. Sele o tubo que contém o sobrenadante fecal humano com parafilme, remova-o da câmara anaeróbica e coloque-o em um recipiente secundário à prova de vazamentos. Transporte o contêiner junto com o saco autoclavado de suprimentos de gavagem para o local de alojamento dos animais.
      NOTA: É essencial estimar o total de UFC/mL das fezes humanas destinadas à gavagem para fins de relatório. Não está claro qual é a carga mínima de UFC para garantir a colonização adequada, mas UFCs mais altas levam a um melhor enxerto de fezes do doador¹³. Se a carga de UFC de material fecal humano resultar em baixas taxas de enxerto, lembre-se de amostras fecais humanas. O uso de um meio de preservação de viabilidade aumentará a recuperação de UFC de espécimes fecais coletados. Para determinar as contagens anaeróbicas/aeróbicas de UFC das fezes do doador, diluir serialmente a amostra para 1 x ^10-5 e colocar 10 μL de cada diluição em duplicata em placas aeróbicas e anaeróbias de ágar BHI e LB. Após 24 h (aeróbico) e 48 h (anaeróbico), contar o UFC por grama de fezes.
3. Preparando as isocages
   1. Repita as etapas 2 e 3, com a única diferença agora sendo que há ratos alojados nessas gaiolas, e deve-se tomar cuidado para garantir que, dentro de 30 minutos após a remoção do rack, cada isocage seja colocado no capô esterilizado e a tampa ventilada para permitir o fluxo de ar para os ratos.
   2. Esterilize o saco de material de gavagem autoclavado e o tubo de lama fecal humana das etapas 5.1 e 5.2 por meio da saturação de esterilizante de dióxido de cloro de maneira semelhante às garrafas de água (ou seja, mergulhe-os em esterilizante e coloque-os em um saco embebido em esterilizante).
   3. Transfira as isocagens e os suprimentos de gavagem oral para o gabinete de biossegurança após a conclusão do período de esterilização de 20 minutos. Perfure o saco de suprimentos autoclavado empurrando o saco contra a pinça longa contida nele e, em seguida, remova os suprimentos e descarte o saco fora do capô.
4. Gavage
   1. Coloque um novo avental cirúrgico estéril e luvas cirúrgicas estéreis no lugar das luvas resistentes a produtos químicos para evitar que o esterilizante de dióxido de cloro residual entre em contato com camundongos. Peça ajuda ao assistente nesse processo, se necessário.
   2. Prepare as agulhas de gavagem desembrulhando cada bolsa de esterilização e use o interior da bolsa como uma superfície de descanso seca e estéril. Conecte a agulha de gavagem a cada seringa, abra o tubo de pasta fecal e puxe 200 μL de pasta fecal para cada seringa.
   3. Usando uma pinça, segure a base da cauda de um único rato na gaiola e coloque-a na gradinha. Contenha suavemente o mouse raspando e, enquanto segura o mouse na posição vertical vertical, insira a agulha e injete suavemente a pasta fecal, seguida pela remoção imediata da agulha.
   4. Coloque o mouse diretamente em um dos copos esterilizados para observação. Repita o processo para cada rato na gaiola. Depois que todos os camundongos tiverem recebido a gavagem, use a pinça para mover cada camundongo de volta para o leito da gaiola e selar a gaiola conforme descrito nas etapas 4.3.2 a 4.3.4.
      NOTA: Nos casos em que duas ou mais pastas fecais separadas estão sendo usadas, é necessária a reesterilização completa do gabinete de biossegurança e das gaiolas e materiais necessários. Nos casos em que um grupo de camundongos permanece livre de germes, recomenda-se que esses camundongos recebam suas gavagens de controle antes que qualquer outro grupo seja tratado.
   5. Siga o procedimento na etapa 4.4 para descartar o esterilizante de dióxido de cloro e os materiais embebidos em esterilizante. Trate quaisquer materiais contaminados com chorume fecal humano como resíduos biomédicos e descarte-os de acordo com os procedimentos de saúde e segurança ambiental.

6. Coleta de fezes de camundongos humanizados para preservação da viabilidade

1. Prepare suprimentos autoclavados
   1. Coloque pinças curtas de ponta larga em bolsas de esterilização autovedantes (1 por mouse), béqueres de polipropileno de 600 mL (1 por mouse) e um par de pinças longas em uma bolsa segura para autoclave e esterilize via autoclave 1 dia antes do procedimento de coleta de fezes.
   2. Imediatamente após a remoção do saco da autoclave, feche o saco com fita adesiva e guarde-o até o dia seguinte.
2. Preparação do tubo de mídia de preservação
   1. Selecione um meio de preservação de viabilidade anaeróbica (aqui Cary Blair foi usado). Alicote 1 mL de meio de preservação em tubos estéreis com tampa de rosca de 2 mL em um gabinete de biossegurança. Recomenda-se uma proporção de 1:10 fezes:meio para uma preservação ideal.
   2. Pré-rotule cada tubo com um marcador permanente, mas esteja ciente de que a exposição ao esterilizante de dióxido de cloro pode remover etiquetas de marcadores permanentes das superfícies plásticas. Outro método é deixar os tubos sem rótulo e fazer com que o assistente rotule os tubos imediatamente após a coleta antes do congelamento.
   3. Coloque esses tubos em um rack de tubos de polipropileno padrão para permitir que os tubos sejam armazenados na vertical enquanto ainda permite a esterilização por contato com o esterilizante de dióxido de cloro.
3. Gaiolas esterilizantes e armário de biossegurança
   1. Repita as etapas 2 e 3 para esterilizar as isocagens e o gabinete de biossegurança. Novamente, tome cuidado para garantir que, dentro de 30 minutos após a remoção do rack, cada isocage seja colocado no capô esterilizado e a tampa seja ventilada para permitir o fluxo de ar para os ratos.
   2. Além disso, esterilize o saco de suprimentos autoclavado e o rack contendo tubos preparados por meio de saturação de esterilizante de dióxido de cloro e coloque-os no saco plástico embebido contendo as gaiolas. O objetivo é o contato líquido completo com todas as superfícies de cada tubo e com o próprio rack.
4. Coleta e armazenamento de amostras fecais
   1. Transfira as isocagens, suprimentos autoclavados e rack de tubos para o gabinete de biossegurança após a conclusão do período de esterilização de 20 minutos. Perfure o saco de suprimentos autoclavado empurrando-o contra a pinça longa contida nele, remova os suprimentos e descarte o saco fora do capô.
   2. Coloque um novo avental cirúrgico estéril e luvas cirúrgicas estéreis no lugar das luvas resistentes a produtos químicos para evitar que o esterilizante de dióxido de cloro residual entre em contato com camundongos. Peça ao assistente para ajudar neste processo, se desejar.
   3. Prepare a pinça de ponta romba desembrulhando as bolsas e usando a superfície interna da bolsa como uma área estéril. Coloque o suporte para tubos na superfície da tampa de biossegurança.
   4. Usando uma pinça longa, segure a base da cauda de um único camundongo na gaiola e coloque-o diretamente em um dos copos esterilizados para observação. Repita esse processo para todos os ratos na gaiola.
   5. Observe os camundongos até que pelo menos duas pelotas fecais recém-eliminadas tenham sido produzidas.
      1. Usando a pinça de ponta romba, pegue os pellets fecais e coloque-os diretamente no tubo. Feche imediatamente a tampa de rosca e passe-a para o assistente.
      2. Peça ao assistente que rotule o tubo e homogeneize imediatamente as fezes por meio de vórtice. Uma vez homogêneo, congele o tubo em nitrogênio líquido e armazene a longo prazo a -80 °C.
   6. Repita o processo de coleta de fezes para cada rato na gaiola. Substitua cada rato na gaiola doméstica após a coleta fecal e recoloque as gaiolas em seu rack. Repita a etapa 4.4 para limpar o exaustor e descartar os resíduos.

Resultados

Amostras fecais humanas, agrupadas por fenótipo ICI respondedor e não respondedor (descrito anteriormente no protocolo), foram gavagadas em camundongos GF-WT de gênero misto alojados em 3 isócrias por grupo (n = 1-2 camundongos / gaiola, n = 6 para respondedor e n = 5 para não respondedor). Os camundongos foram autorizados a se aclimatar por 1 semana após a transferência. Amostras fecais foram então coletadas desses camundongos (condições livres de germes). Os camundongos foram...

Discussão

O protocolo descrito aqui fornece um método reprodutível e altamente detalhado para a humanização de camundongos livres de germes alojados em isocages experimentais. A capacidade de transplantar exclusivamente comunidades fecais de seres humanos para hospedeiros murinos é inestimável para a pesquisa do microbioma. Sem a contaminação da microbiota comensal específica do camundongo, pode-se estudar o impacto das bactérias residentes em humanos em uma variedade de estados de saúd...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL BD Slip Tip Syringe sterile, single use	Fisher Scientific	309659
2.0 mL Screw Cap Tube, NonKnurl,Skirted,Natural, E-Beam Sterile tube w/ attached cap	Fisher Scientific	14-755-228
36 x 32 x 48" 3 Mil Gusseted Poly Bags	Uline	S-13455
5 gallon tank of Exspor chlorine-dioxide sterilant activator	Ecolab	6301680
5 gallon tank of Exspor chlorine-dioxide sterilant base	Ecolab	6301194
600 mL polypropylene beakers	Fisher Scientific	S01914
ALPHA-dri bedding	Shepherd Specialty Papers
Anaerobic chamber	Coy Lab Products	Type B
Biosafety cabinet class 2	Nuaire
Certified IsoCage autoclavable HEPA filter XT Extreme Temperature	Tecniplast	1245ISOFHXT
Clear Lens LPX IQuity Safety Goggles	Fastenal	922205455
DuPont Tyvek Sleeve - 18"	Uline	S-13893E
DWK Life Sciences DURAN 45 mm Push-on Natural Rubber Cap	Fisher Scientific	01-258-107	Rubber cap for 1 L autclave bottles
Dynalon Quick Mist HDPE Sprayer Bottles	Fisher Scientific	03-438-12B
Fisherbran Polypropylene Graduated Cylinders	Fisher Scientific	03-007-44
Fisherbran Dissecting Blunt-Pointed Forceps	Fisher Scientific	08-887
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches	Fisher Scientific	01-812-51
Fisherbrand Straight Broad Strong Tip General Application Forceps	Fisher Scientific	16-100-107
Fisherbrand lead Free Autoclave Tape	Fisher Scientific	15-901-110
Gavage needle, reusable stainless steel. Straight. 22 gauge needle, tip diameter 1.25 mm, length 38 mm or 1.5 inches(doz)	Braintree Scientific	N-PK 020
H-B Instrument Durac Timer	Fisher Scientific	13-202-015
IsoPositive Cages and Rack (i.e. isocages)	Tecniplast	ISO30P	30 cages (6 w x 5 h), single sided
Nitrile Chemical Resistant Gloves Size S (7), M (8) or L (9) 18” long, 22 mil, Ansell	Grainger	4T426
Nitrile Exam Gloves, Medium, Non-Sterile, Powder-Free	MedSupply Partners	KG-1101M
Olive / Magenta Bayonet Gas & Vapor Cartridges / Particulate Filter 2Ct	3M/Fastenal	50051138541878
Polycarbonate RadDisk Mini for Mice 8-75 x 4	Braintree Scientific	IRD-P M
Polypropylene Bouffant Caps - 24", Blue	Uline	S-10480BLU
Puritan Cary-Blair Medium, 5 mL	Fisher Scientific	22-029-646
S, M and L Blue Silicone Dual-Mode Head Harness Half Mask Respirator	3M/Fastenal	50051131370826
Sgpf Series Sterile Powder Free Latex Gloves, CT International, Thickness = 6.5 mm, Length = 30.5 cm (12), Glove Size = 8.5, Glove Color = White	Fisher Scientific	18-999-102F
Skid Resistant Shoe Cover	Uline	S-25639
Surgical Gown, Towel, Sterile, Large, 32/cs	Thomas Scientific	KIM 95111
Teklad Global 18% protein extruded rodent diet (sterilizable)	Inotiv	2018SX
Thermo Scientific Nalgene Heavy-Duty Rectangular LLDPE Tank with Cover (20 L volume)	Thermo Scientific	14-831-330J
VERIFY Dual Species Self Contained Biological Indicators	Steris Healthcare	S3061
WypAll L40 1⁄4 Fold Wipers	Uline	S-8490