הכנה ותחזוקה של ניסוי כלוב איזופוזיטיבי להדרה ביולוגית להשתלת צואה אנושית בעכברים נטולי חיידקים

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השיטות המומלצות להעברת עכברים ללא חיידקים למבודדים ניסיוניים בכלוב יחיד (איזוקאז'ים) תוך שמירה על תנאים סטריליים. נדונות שיטות להשתלת צואה בעכברים נטולי חיידקים ואיסוף חיידקים ברי קיימא מעכברים "אנושיים" אלה ליישומים נוספים.

Abstract

עכברים נטולי חיידקים הם כלי מחקר חשוב להבנת תרומתם של מיקרואורגניזמים לבריאות המארח ולמחלות, המאפשר הערכה של התפקיד הספציפי של פרטים, קבוצות מוגדרות או מורכבות של מיקרואורגניזמים בתגובת המארח. גידול עכברים ללא חיידקים ומניפולציה ניסיונית הם יקרים ודורשים צוות מיומן רב וטביעת רגל גדולה במתקני דיור לבעלי חיים. מערכת הכלוב IsoPositive מאפשרת מניפולציה ניסיונית של עכברים נטולי חיידקים בכלובי מבודדים בודדים, אטומים הרמטית, בלחץ חיובי (איזוקאז'ים), מה שמפחית את העלות ומאפשר גמישות רבה יותר במניפולציות ניסיוניות.

כאן, מתואר פרוטוקול להעברת עכברים נטולי חיידקים ממבודדי רבייה לאיזוקאז'ים והעברת צואה לאחר מכן מצואה מתורם אנושי לעכברים כדי ליצור עכברים יציבים לטווח ארוך "אנושיים" במעיים למחקרים עתידיים. מתוארים החומרים וההכנות הדרושים לניצול מערכת האיזוקאז', כולל שימוש בחומר מעקר כימי מעקר כלור-דו חמצני לניקוי כלובים, אספקה, ציוד וציוד מגן אישי. נדונות השיטות לאישור הסטטוס נטול החיידקים של עכברים שהועברו וכיצד לקבוע זיהום במערכת הכלוב. נוהל הגידול, כולל מצעים, מזון ואספקת מים, נדון בהמשך. מתוארים הפרוטוקול להכנת תמיסת צואה אנושית והכנסה לעכברים נטולי חיידקים ליצירת עכברים "אנושיים" במעיים, יחד עם איסוף צואה לניטור הרכב הקהילה המיקרוביאלית של עכברים אלה. ניסוי ממחיש כי שבועיים לאחר השתלת צואה אנושית מאפשרת קולוניזציה יציבה של המיקרוביוטה של התורם במארחי העכברים, מה שמאפשר שימוש ניסיוני לאחר מכן. יתר על כן, מתואר איסוף צואת עכברים אנושית באמצעי שימור כדאיות, המאפשר שימוש בניסויים פונקציונליים נוספים. בסך הכל, שיטות אלו מאפשרות הקמה בטוחה ויעילה של קהילות עכברים אנושיות בכלובי גנוטוביוטיקה ניסיוניים למניפולציה נוספת.

Introduction

עכברים נטולי חיידקים הם כלי חיוני ברפרטואר של חוקרי המיקרוביום, המאפשר לנתח את תרומת המיקרוביוטה במצבי בריאות ומחלות של המארח. עכברים נטולי חיידקים נולדים סטריליים לחלוטין ונשארים אקסניים במשך כל חייהם¹. קולוניזציה של עכברים נטולי חיידקים עם זני חיידקים ספציפיים מאפשרת מחקרים סיבתיים בין טקסונים אלה לבין תפקודים מטבוליים, חיסוניים או פונקציות מארח אחרות 2,3,4,5. יתרון מיוחד הוא היכולת "להאניש" עכברים נטולי חיידקים ברמת המיקרוביוטה על ידי השתלת צואה המתקבלת מתורמים אנושיים, וכאשר הם שוכנים בתנאי מחסום, למנוע זיהום ממיקרואורגניזמים שמקורם במורין. גישה זו אפשרה תגליות חשובות רבות בתחום המיקרוביום, למשל, השפעת המיקרוביום של המעי האנושי על התגובה האימונותרפית לסרטן ^6,7,8.

עם זאת, בעוד שעכברים אנושיים ללא חיידקים הם בעלי ערך רב למאמצי המחקר בתחום המיקרוביום, ישנן מגבלות רבות שעיכבו את ההסתגלות הרחבה יותר של גישה זו. עכברים נטולי חיידקים מגודלים ומתוחזקים במבודדים גדולים קשיחים למחצה או גמישים, אך ניסויים פונקציונליים דורשים התקנה של מיני מבודדים נפרדים, כאשר מיני מבודד אחד מכיל מספר כלובים אך רק בתנאי ניסוי אחד. גישת מיני-מבודד זו מגדילה את טביעת הרגל והעלות של החלל תוך הגבלה חמורה של מספר תנאי הניסוי שניתן לחקור בניסוי ומספר הניסויים שניתן להריץ במקביל. פתרון מבטיח הוא שימוש במערכת כלוב אינדיבידואלית ומודולרית הנקראת ISOcage P Bioexclusion System (המכונה כאן מערכת איזוקאז')^9,10. מערכת האיזוקאז' מאפשרת מניפולציה ניסיונית של עכברים נטולי חיידקים בכלובי מבודדים בודדים, אטומים הרמטית, בלחץ חיובי, ומאפשרת תנאי ניסוי נפרדים בין כל כלוב ולא בין כל מיני מבודד. עם הטכניקה האספטית המתאימה, ניתן לשכן בעלי חיים באיזוקאז'ים עד 12 שבועות בתנאים נטולי חיידקים או להאניש על ידי השתלת צואה אנושית לשימוש בכל גישה ניסויית תואמת (כלומר, ניתן לבצע בתנאים אספטיים). ניתן להריץ מספר ניסויים עצמאיים במקביל באמצעות מערכת האיזוקאז', וטביעת הרגל והעלות של החלל נמוכות באופן דרמטי מהפעלת ניסויים מרובים על פני מיני-מבודדים.

מטרת גידול עכברים נטולי חיידקים במבודדי גידול סרטים גמישים היא לשמר בזהירות את הסטטוס האקסני¹¹. טכניקות המשמשות לניטור מצב נקי מחיידקים כוללות ספוגיות שגרתיות של משטחי גוף עכברים וחללי הפה, כמו גם איסוף אספטי של דגימות צואה, שגם מתורבות וגם נבדקות על ידי בדיקות מסחריות מבוססות PCR. בדיקות חיידקיות, סרולוגיות ופטרייתיות של דגימות אלה נדרשות כולן כדי לקבוע מצב נקי מחיידקים¹¹. כאשר עכברים נטולי חיידקים מועברים ממבודדי רבייה לאיזוקאז'ים לשימוש ניסיוני, העכברים נלקחים ונבדקים כדי לאמת את מצבם ללא חיידקים בעת ההעברה. בדיקות סטריליות איזוקאז' מבוצעות באמצעות איסוף אספטי של דגימות צואה, אשר לאחר מכן מתורבות לאיתור מזהמים חיידקיים, נגיפיים ופטרייתיים. איסוף ורישום קפדני של תוצאות בדיקות הסטריליות הללו מלידה ועד סוף פרוטוקול ניסוי הכרחי כדי לאמת את הסטטוס נטול החיידקים של עכברים אלה.

מערכת האיזוקאז' מורכבת מכלובים בודדים (איור 1), דיסקיות העברה להובלה ממבודדי רבייה (איור 1), ומתלה איזוקאז', שמאכלס את הכלובים (איור 2). כל איזוקאז' מכיל מסנן חלקיקי אוויר עם נצילות גבוהה (HEPA) ברמת הכלוב המותקן על כניסת אוויר האספקה ואטם סיליקון היוצר אטימה אטומה כאשר הוא סגור, ומבטיח שלא יוכלו מזהמים להיכנס לכלוב דרך האוויר (איור 1A). מכסה כלוב זה יכול לשמש כמשטח עבודה סטרילי כאשר הוא מונח הפוך בתוך ארון בטיחות ביולוגית מעוקר (איור 1A). מתלה בתוך הכלוב מכיל את בקבוק המזון והמים (איור 1B). מלקחיים שעברו חיטוי בתוך הכלוב משמשים לכל המניפולציות הדורשות מגע עם משטחי כלוב פנימיים. לכלוב עצמו יש חריצים עבור מחזיק כרטיס כלוב נשלף לזיהוי בעלי חיים מבחוץ וחרירי יניקת אוויר וייצוא העוגנים לתוך מתלה האיזוקאז' (איור 1C-E). סגירה בטוחה clamps ומנעול לשונית על המכסה אוטמים את הכלוב כאשר הוא מוכן לעגינה מחדש על מערכת המתלים (איור 1F). המצע המוצע הוא אלפא-דרי, ומומלץ גם בקתת העשרה ניתנת לחיטוי (איור 1F). דיסקי העברה משמשים להעברת עכברים נטולי חיידקים ממבודדי רבייה לאיזוקאז'ים, והם מכילים מכסה תא מסתובב עם פתח משולש כדי לאפשר מניפולציה של חיות (איור 1G-H). הדיסקים מגיעים בגדלים קטנים (קוטר 21.6 ס"מ) וגדולים (קוטר 28 ס"מ), שניהם בעלי קיבולת של שמונה עכברים. סרט חיטוי משמש ליצירת אטמים אטומים על ההיקף וחורי האוויר של הדיסק, אשר מבוצעים לפני השרייה בחומר סטרילנטי והובלה בשקית ספוגה בסטרילנט (איור 1I). למערכת ארון התקשורת עצמה יש מסך לניטור מפוחי האוויר, מצב מסנן HEPA ברמת ארון התקשורת וכוח סוללת חירום עבור ארון התקשורת, שהם כולם מאפיינים כלולים של המערכת (איור 2A). מד Magnehelic סגור מציג את הלחץ החיובי שנשמר על ידי מערכת הכלובים, ומחוון עגינה חזותי אוטומטי מראה את מצב העגינה של הכלובים (לשונית צהובה החוצה פירושה שאין כלוב מעוגן, או שהרציף לא הצליח) (איור 2B-D). כמו כן, הכרחי למניפולציה של איזוקאז'ים הוא ארון בטיחות ביולוגית מוסמך סטנדרטי.

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את השיטות המתאימות להעברה מוצלחת של עכברים נטולי חיידקים ממבודדי רבייה בתנאים אספטיים לאיזוקאז'ים תוך שמירה על סטטוס נקי מחיידקים, האנשה של עכברים נטולי חיידקים עם תרחיץ צואה מתורם אנושי, ואיסוף צואה מעכברים השוכנים באיזוקאז' לאישור מצב נקי מחיידקים או שימור כדאיות למחקרים פונקציונליים נוספים. בדוגמה זו, עכברים נטולי חיידקים עוברים האנשה עם דגימות צואה מאוגדות מנבדקים אנושיים שטופלו באימונותרפיה לסרטן ריאות ודיכוטומיים כמגיבים או לא מגיבים לטיפול. במקרה זה, פנוטיפ התגובה לתגובה האימונותרפית הועבר על ידי האנשה של מיקרוביוטת המעיים לעכברים המקבלים, שלאחר מכן ניתן היה לחסן אותם עוד בתאי גידול ולטפל בהם באימונותרפיה. ניתן להתאים בקלות את פרוטוקול התרחיץ הצואתי האנושי לכל צואה של תורם אנושי או לכל מודל פרה-קליני של מחלה שהחוקר רוצה. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן להעביר כל מיקרוביוטה של תורם צואה אנושי למארח נטול חיידקים, מה שמאפשר חקירה נוספת של תפקיד המיקרוביוטה בבריאות ובמחלות.

איור 1: דיאגרמה סכמטית של דיסקות איזוקאז' והעברה. (A) מבט מלמעלה למטה של הצד התחתון של מכסה הכלוב, עם תוויות המציינות את המיקום של מסנן HEPA הפנימי ברמת הכלוב ואטם אטם הסיליקון. (ב) מבט מלמעלה למטה על פנים הכלוב, עם תוויות המציינות את מכסה מוט התיל, בקבוק המים הפנימי והזרבובית, ואת המיקום במתלה להחזקת חמין הניתן לחיטוי. (ג) מבט קדמי של הכלוב המציג חריצים למחזיק כרטיס הכלוב. (ד) מלמעלה למטה view של כלוב מלא עם המכסה למעלה, המראה כיצד מסנן HEPA מותקן על פיית כניסת האוויר. (ה). מבט אחורי של הכלוב המציג חרירי יניקת וייצוא אוויר העוגנים למערכת מתלה האיזוקאז'. (F) מבט רוחבי של כלוב מלא עם מכסה למעלה, עם תוויות המציינות את מהדקי הסגירה הבטוחים במצב פתוח, עם לשוניות לבנות על כל מהדק שנועלות אותם במקומם. פנים הכלוב מראה תשתית אלפא-דרי בשכבות בתחתית, ובקתת העשרה מוצעת שהונחה בתשתית. (G) מבט מלמעלה למטה על דיסקי העברה עם מכסה למעלה. (H) מבט מלמעלה למטה על החלק הפנימי של דיסק ההעברה, שמראה את מכסה התא המסתובב עם פתח משולש שמאפשר מניפולציה של חיות. (I) מבט רוחבי של דיסק העברה מורכב במלואו המראה מיקום של סרט אוטוקלאב, היוצר אטימה אטומה במהלך ההעברה ממבודד רבייה לאיזוקאז'. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: דיאגרמה סכמטית של מערכת ארונות התקשורת של איזוקאז'. (A) ארון תקשורת שלם עם כלובים מעוגנים ותווית המציינת את מסך הניטור עבור מצב מפוח אוויר, מצב מסנן HEPA וסוללת חירום. בצד השמאלי התחתון של המתלה נמצא החריץ למסנן HEPA ברמת המתלה. (ב) מד מגנהלי מצורף המראה את הלחץ החיובי הנשמר על ידי המתלה. (ג) איזוקאז' מעוגן ללא מחוון עגינה צהוב נראה לעין, המדגים חיבור מוצלח בין המתלה לחרירי האוויר. (ד) חריץ ריק בארון התקשורת, עם מחוון עגינה חזותי אוטומטי גלוי לעין המציין שאין מתלה במקומו ואין חיבור של חרירי האוויר לאיזוקאז'. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת פלורידה (UF) ובוצעו במתקני טיפול בבעלי חיים של UF (פרוטוקול IACUC #IACUC202300000005). מושבות מסוג בר נטול חיידקים (GF WT; עכברי C57BL/6) גודלו והוחזקו במבודדים על ידי החטיבה ללא חיידקים של UF Animal Care Services. עכברי GF WT מעורבים הועברו ממבודדי רבייה והוכנסו למערכת ISOcage P Bioexclusion כדי לאפשר מניפולציה מיקרוביאלית.

דגימות צואה אנושיות התקבלו ממחקר תצפיתי פרוספקטיבי שאסף דגימות צואה אורכיות מחולים שקיבלו טיפול במעכב מחסום חיסוני (ICI)¹². הסכמה מדעת התקבלה מהמטופלים לאחר אישור המחקר על ידי Advarra IRB (MCC#18611, Pro00017235). הנבדקים קיבלו והשלימו ערכת איסוף צואה של מדיום הובלה דנטלי נוזלי (LDTM) שנועדה לשמר את כדאיות החיידקים למחקרים פונקציונליים. הערכת התגובה אפיינה n=4 דגימות כמגיבים (R) ו-n=6 כלא מגיבים (NR). דגימות המטופלים ההומוגניות שהשתמרו ב-LDTM הופשרו בנפרד, כל אחת הוכנסה לתא אנאירובי למשך לא יותר מ-90 שניות ונאספה על ידי פנוטיפ תגובה (R: n = 4, NR: n = 6). הדגימות שנאספו לאחר מכן הוקפאו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימוש בפרוטוקול זה. כדי לקבוע את ספירת היחידות היוצרות מושבה אנאירובית (CFU) של צואת התורם, הצואה של כל נבדק דוללה באופן סדרתי ל-1 × ^10-5, ו-10 מיקרוליטר מכל דילול צופו בשכפול על צלחות אגר של עירוי לב מוח אנאירובי (BHI) ו-Luria Bertani (LB) וספירת CFU לגרם צואה מוערכת. CFU שווה מכל נבדק נאסף לדגימות חיסון צואה עבור גבאז' לעכברים.

1. הכנת כלובים וחיטוי

1. הכנת איזוקאז'
   1. מלאו מראש כלובים עם ~500 מ"ל של דיאטת 2018SX או כל דיאטה מועשרת רצויה לחיטוי ושכבו את החלק התחתון במצעי ALPHA-dri. הניחו בקתת העשרה הניתנת לחיטוי לתוך מיטת הכלוב. הנח בקבוק מים וזרבובית ריקים ולא אטומים ומלקחיים ארוכים בעלי קצה רחב על גבי מתלה החוט.
   2. הנח אינדיקטור ביולוגי דו-מיני לתוך המזון בתוך כלוב אחד בכל מחזור חיטוי. הנח רצועת אינטגרטור כימי על החלק החיצוני של כל כלוב.
   3. חיטוי הכלובים במחזור ואקום למשך 45 דקות ב-121 מעלות צלזיוס ומינימום של 15 PSI ואחריו זמן ייבוש של 30 דקות. עקרו את הכלובים באמצעות מתלה טיהור של ארגון התקינה הבינלאומי (ISO) המאפשר לכלובים להישאר אטומים ולעבור קיטור דרך מסנן HEPA הפנימי, השומר על הסביבה הסטרילית עד לפתיחת הכלוב.
   4. מלאו בקבוקי 1 ליטר במי שתייה, אטמו במכסי גומי והניחו פס אינטגרטור כימי על פני הבקבוק. חיטוי ב-121 מעלות צלזיוס ומינימום של 15 PSI למשך 45 דקות, תוך שימוש בתוכנית הפליטה האיטית של נוזלים.
   5. בדוק ויזואלית את האינטגרטורים הכימיים המוצמדים לכל כלוב לאימות מיידי של פרמטרי החיטוי המתאימים.
      הערה: יש להסיר את האינדיקטור הביולוגי עם הפתיחה הראשונה של האיזוקאז' בתנאים סטריליים. דגרו את האינדיקטור הביולוגי למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והתבוננו בשינויי צבע. שינוי צבע חי מהתמיסה השקופה המקורית בכחול/סגול לנוזל צהוב או עכור מצביע על צמיחה מיקרוביאלית. אם המחוון נשאר ברור ובצבע כחול/סגול, זהו אישור לסטריליות המלאה של פנים הכלובים באותו מחזור חיטוי.

2. תכשיר מעקר כלור-דו חמצני

זהירות: חומר מעקר כלור-דו חמצני הוא מאכל ביותר לאחר הפעלתו. מעקר כלור-דו חמצני מופעל פג 24 שעות מערבוב המפעיל עם הבסיס. חומר מעקר כלור-דו חמצני מייצר אדים, שעלולים לגרות את הריריות ויגרמו לגירוי במגע עם העור. ודא שלחדר להכנת חיטוי יש גישה לכיור ואוורור מתאים. לבש משקפי מגן, מכונת הנשמה וכפפות עמידות בפני כימיקלים בעת עבודה עם חומר מעקר כלור-דו חמצני בנוסף לציוד המגן האישי הנדרש (PPE) למתקן הדיור לבעלי חיים.

1. בסיס ערבוב ומפעיל
   1. כדי ליצור נפח סטנדרטי של 6 ליטר של מעקר כלור-דו חמצני, יש למדוד תחילה 1 ליטר של בסיס מעקר כלור-דו חמצני בצילינדר מדורג של 1 ליטר ולשפוך למיכל טבילה בנפח 20 ליטר.
   2. בעזרת אותו גליל מדורג, מודדים ושופכים 4 ליטר מי ברז למיכל הטבילה.
   3. הניחו בצד את הגליל המדורג המשמש לבסיס ולמים. השתמש בצילינדר מדורג חדש כדי למדוד 1 ליטר של מפעיל מעקר כלור-דו חמצני ולשפוך אותו למיכל הטבילה.
   4. לאחר הוספת המפעיל למיכל, השתמש בצילינדר המדורג כדי לערבב את תכולת המיכל.
2. ההפעלה
   1. הנח את המכסה על מיכל הטבילה ותייג אותו כמעקר כלור-דו חמצני עם התאריך והשעה שבהם נוסף המפעיל ושם הצוות שהכין אותו. אם תרצה, ניתן להשתמש בגליל המדורג המשמש לערבוב הסטרילנט להעברת 1 ליטר לבקבוק ריסוס.
   2. העבר את מיכל הטבילה ובקבוקי הריסוס לחדר המגורים לבעלי חיים, שם נמצאים מתלה ה-Isocage והכלובים. החומר המעקר כלור-דו חמצני המופעל חייב לשבת לפחות 20 דקות לפני השימוש על מנת להבטיח הפעלה מלאה.
      הערה: למניפולציה של כמויות גדולות של כלובים (>9), ניתן להכין עד 12 ליטר בבת אחת במיכל הטבילה. למניפולציה של כלוב אחד או במקרה חירום, ניתן להכין 1.2 ליטר של חומר מעקר כלור-דו חמצני במיכל קטן יותר ולאחר מכן להעביר לבקבוקי ריסוס של 2 1 ליטר. מומלץ להכין את הסטרילנט לפחות שעה אחת לפני ההעברה הצפויה של עכברים נטולי חיידקים.

3. עיקור

1. דון PPE
   1. כמניפולטור הכלוב העיקרי, חבשו משקפי מגן, מכונת הנשמה, כפפות עמידות לכימיקלים, חלוק כירורגי סטרילי, בופנט, כיסויי שרוולים וכיסויי נעליים. ללבוש קרצוף מתחת ל-PPE מכיוון שכל מגע של בד עם חומר מעקר כלור-דו חמצני יגרום להכתמה נרחבת.
   2. מומלץ עוזר למניפולטור הכלוב הראשי. בקש מהעוזר ללבוש את אותו PPE כמו המניפולטור הראשי בכלוב, אם כי הוא עשוי ללבוש חלוק כירורגי לא סטרילי.
2. הכנת ארון הבטיחות הביולוגית
   1. מניחים 10 מגבונים לתוך מיכל הטבילה המעקר כלור-דו חמצני ומוודאים שהם ספוגים לחלוטין.
   2. העבירו את המגבונים הספוגים לארון הבטיחות הביולוגית והשרו את כל משטחי הארון בסדר הבא מאחור לחזית: משטח עבודה שטוח, צד שמאל, גב מכסה המנוע, צד ימין וזכוכית פנימית קדמית. בצע השרייה ללא מגע של המשטחים הלא מוגנים של ארון הבטיחות הביולוגית על ידי סחיטת המגבונים על משטחים אלה מבלי לגעת בהם.
   3. לאחר סבב ניקוי אחד, החזירו את המגבונים למיכל הטבילה הסטרילנטי כלור-דו חמצני להשרות.
3. הכנת האיזוקאג'ים
   1. הכן שקית ניילון גדולה על ידי מילויה בלפחות 100 מ"ל של חומר מעקר כלור-דו חמצני באמצעות גליל מדורג ונער את השקית כדי להבטיח שכל המשטחים הפנימיים ספוגים. הנח את השקית על כל משטח ישר.
   2. הסר איזוקאז' בודד מהמתלה והנח אותו במיכל הטבילה המעקר כלור-דו חמצני כך שכל משטח בכלוב יבוא במגע עם הנוזל. השתמש במגבונים הספוגים במיכל כדי לשפשף עוד יותר את משטחי הכלוב כדי להבטיח מגע מלא עם נוזלים.
   3. לאחר השריית הכלוב, בקש מהעוזר לפתוח את שקית הניילון הספוגה. הכניסו את הכלוב לתיק, ובקשו מהעוזר לסגור מיד את הפתח. רססו את פתח השקית בחומר מעקר כלור-דו חמצני באמצעות בקבוק הריסוס. בצע הליך זה עבור כל כלוב שיש להשתמש בו; עד ארבעה כלובים יכולים להיכנס לתיק יחיד בגודל 36 אינץ' 32 אינץ' 48 אינץ'.
   4. טבלו כמה בקבוקי מים מעוקרים בנפח 1 ליטר לפי הצורך (1 ליטר מים ל-2 כלובים) במיכל הטבילה הסטרילנטי כלור-דו חמצני, ולאחר מכן הניחו אותם בשקית ניילון ספוגה נוספת. לאחר שכל האספקה הוכנסה לשקית, סגור את השקית ורסס את פתח השקית בחומר מעקר כלור-דו חמצני באמצעות בקבוק הריסוס.
   5. לאחר שכל הכלובים והאספקה ארוזים, טבלו את הכפפות העמידות לכימיקלים בחומר חיטוי כלור-דו חמצני (כמה שיותר רחוק מהכפפות מבלי להגיע לפתח).
4. תקופת עיקור של 20 דקות
   1. עיקור מלא דורש מינימום של 20 דקות של זמן מגע עם נוזלים. ברגע שהפריט האחרון עוקר ושקית ההשריה מפלסטיק נסגרת, בקש מהעוזר להגדיר טיימר של 20 דקות. ודא שלאחר הפעלת הטיימר, הכפפות העמידות לכימיקלים אינן נוגעות בשום משטח שאינו ספוג במעקר כלור-דו חמצני.
   2. בצע את תהליך העיקור של ארון הבטיחות הביולוגית (שלב 3.2) שוב ושוב עד שהטיימר מציין שחלפו 20 דקות.
   3. בקש מהעוזר לנער לעתים קרובות את המשטחים החיצוניים של שקית הניילון הספוגה כדי להבטיח מגע נוזלי עקבי עם משטחי הכלוב והבקבוק שבתוכה.
   4. לאחר פרק הזמן של 20 דקות, בקש מהעוזר לפתוח את שקית הניילון הספוגה כדי לחשוף את הכלובים ובקבוקי המים המעוקרים, תוך הקפדה לגעת רק במשטחים החיצוניים של השקית.
   5. בעזרת הכפפות המעוקרות העמידות לכימיקלים, העבירו כל כלוב ובקבוק לארון הבטיחות הביולוגית המעוקר. אם יש יותר מדי כלובים מכדי להיכנס לארון הבטיחות הביולוגית, השאירו את הכלובים הנותרים בשקיות הניילון מכיוון שהם יישארו סטריליים כל עוד פתח שקית הניילון סגור וספוג בחומר מעקר כלור-דו חמצני בין כל פתח.

4. העברת עכבר ללא חיידקים

1. הכנת האיזוקאג'ים
   1. כדי לפתוח את האיזוקאז' האטום הרמטית, הרם את הלשוניות הלבנות בשני המהדקים בצידי המכסה ולאחר מכן משוך החוצה כל מהדק הצידה. המכסה חייב להיות נקי מהחלק התחתון של הכלוב על מנת להרים את המכסה מהכלוב. הנח את המכסה הפוך משמאל לכלוב והשתמש בו כתחנת עבודה סטרילית.
      הערה: חלופה לשימוש במכסי כלוב או בחלק הפנימי של שקיות מכשירים חיטוי כמשטח עבודה סטרילי היא שימוש בווילונות חיטוי, המספקים שטח פנים גדול יותר ומונעים זיהום לא מכוון של מכסה הכלוב אם נעשית שגיאה.
   2. בעזרת המלקחיים הסטריליים שנמצאים בתוך הכלוב על גבי מתלה החוט, הסר את בקבוק המים הריק והנח אותו בחלק הפנימי של המכסה. פתח את בקבוק המים בנפח 1 ליטר על ידי הסרת אטם הגומי, ושפך את המים לבקבוק המים כדי למלא אותו. הנח את הזרבובית על בקבוק המים באמצעות המלקחיים ולחץ כלפי מטה בחוזקה כדי לאטום.
   3. השתמש במלקחיים סטריליים כדי להרים את מתלה החוט ולהחזיר אותו כמה סנטימטרים לאחור כדי לאפשר פתח לתחתית הכלוב. הנח את המלקחיים הסטריליים על מתלה החוט, וודא שהידיות לא יבואו במגע עם משטחי הכלוב.
2. שימוש בדיסק העברה
   הערה: צוות מיומן ללא חיידקים אחראי על הטיפול והתחזוקה של מבודדי הרבייה. בהתחשב בסיכונים הכרוכים בפתיחת מבודדי רבייה, צוות זה מבצע את עיקור דיסק ההעברה, הכנה והעברה של עכברים נטולי חיידקים ממבודדים לאיזוקאז'ים. כדי לתאר בקצרה את התהליך, מכינים דיסקי העברה בצילינדר הניתן לחיטוי כדי לאפשר עיקור. אינדיקטורים ביולוגיים משמשים לאימות עקרותם. סרט לאיטום דיסקי ההעברה עובר חיטוי גם בתוך הגליל. הגליל המעוקר התוחם את החומרים הללו מחובר דרך שרוול העברה למבודד, ועכברים מועברים מהכלובים לדיסק. לאחר מכן מניחים את המכסה על הדיסק, ומשתמשים בסרט חיטוי ליצירת אטימה אטומה על היקף הדיסק וחורי האוויר. הדיסק האטום ממוקם מיד ביציאת היציאה של המבודד. לאחר מכן סוגרים את מכסה היציאה של המבודד הביתי, והחלק החיצוני של הדיסק נסגר ביסודיות בחומר סטרילנטי ומכניס אותו לשקית ספוגה בסטרילנט, מנוטרת במשך 20 דקות כדי להבטיח טיהור מלא. צוות גידול ללא חיידקים מעביר את הדיסקים הללו לצוות המחקר. לא ניתן לשמור עכברים בדיסק האטום יותר מ-30 דקות מרגע איטום דיסק ההעברה, ולכן חיוני שכל השלבים הקודמים בפרוטוקול זה הושלמו מספיק זמן לפני הגעת דיסק ההעברה.
   1. עם קבלת דיסק ההעברה, בקש מהעוזר להחזיק ולפרוק חלקית את מכסה הפלסטיק כך שהמשטח הספוג של דיסק ההעברה ייחשף אך לא ייגע בו.
   2. עם קבלת דיסק ההעברה, בקש מהעוזר להחזיק ולפרוק חלקית את מכסה הפלסטיק כך שהמשטח הספוג של דיסק ההעברה ייחשף אך לא ייגע בו.
   3. לבישת הכפפות העמידות לכימיקלים הספוגות בסטרילנט כלור-דו חמצני, הסר את דיסק ההעברה מעטיפת הפלסטיק, הקפד לא לגעת בשום משטח שאינו ספוג בסטרילנט. לאחר מכן, הנח את דיסק ההעברה על המשטח השטוח של ארון הבטיחות הביולוגית המעוקר.
   4. כדי לפתוח את דיסק ההעברה, קלף את הסרט, אטום את היקף הדיסק והשליך אותו מחוץ לארון הבטיחות הביולוגית. הסר את המכסה של דיסק ההעברה והשליך אותו מחוץ לארון הבטיחות הביולוגית.
   5. בתוך דיסק ההעברה יש מכסה תא מסתובב עם פתח יחיד. השתמש במלקחיים הסטריליים שהונחו קודם לכן על מתלה התיל של הכלוב כדי לתפעל את מכסה התא הזה כדי להזיז את הפתח לעכבר הדרוש להעברה.
3. העברת עכברים מדיסק לאיזוקאז'
   1. בעזרת המלקחיים, אחוז בבסיס זנב העכבר דרך הפתח במכסה הדיסק מפלסטיק, והרם והעביר את העכבר לתוך האיזוקאז' דרך החלל שנפתח קודם לכן בין מתלה התיל לכלוב. חזור על הפעולה עבור כל העכברים המיועדים לכלוב זה.
   2. לאחר שכל העכברים הועברו לאותו איזוקאז', החלף את מתלה החוט באמצעות המלקחיים. לאחר מכן, הרם את מכסה הכלוב והנח אותו בחזרה על גבי הכלוב באמצעות המלקחיים.
   3. הרם כל מהדק של מכסה הכלוב כלפי מעלה והורד בזהירות מעל דפנות הכלוב, ולאחר מכן דחף כלפי מטה את הלשוניות הלבנות כדי לאטום את מכסה הכלוב.
   4. לאחר איטום הכלוב, בקש מהעוזר לרסס כל זרבובית של אתר העגינה על מתלה הכלוב בחומר חיטוי כלור דו חמצני. לאחר מכן, הסר את הכלוב ממכסה המנוע והעביר אותו לעוזר, שיוכל לעגן את הכלוב על המתלה.
   5. חזור על שלבים אלה עבור כל עכבר בדיסק ההעברה.
4. ניקוי ארון הבטיחות הביולוגית
   1. עם השלמת כל העברות העכבר לאיזוקאז', רוקנו את מכסה המנוע מכל פסולת ונגבו לחלוטין עם מגבונים ספוגים בסטרילנט כלור דו חמצני.
   2. נגב את מכסה המנוע באלכוהול איזופרופיל כדי להסיר שאריות של כלור-דו חמצני. החלל שמתחת למשטח העבודה של מכסה המנוע אוסף נפח גדול של חומר עיקור מתהליך העיקור. הסר זאת באמצעות ספיגה עם מגבונים יבשים ונגב באלכוהול איזופרופיל.
   3. השלך חומר מעקר כלור-דו חמצני נוזלי דרך ניקוז הכיור 24 שעות לאחר ההפעלה. השלך חומרים מוצקים מזוהמים בסטרילנט כפסולת רגילה.
      הערה: עכברים נטולי חיידקים המועברים לתנאי איזוקאז' נותרים למשך שבוע להתאקלם בסביבתם החדשה לפני כל התערבות. זה מפחית את הלחץ שחווים בעלי החיים, מה שעלול להפריע לתוצאות המחקר. בתום תקופת ההסתגלות הזו של שבוע אחד, אספו צואה כמתואר בשלב 6 כדי לאשר את הסטטוס נקי מחיידקים לפני כל התערבות.

5. החדרה אוראלית של תמיסת צואה אנושית לעכברים נטולי חיידקים

1. הכנת ציוד חיטוי
   1. הנח מחטי גבאז' דרך הפה בשקיות עיקור אטומות עצמיות (1 לכל עכבר) ומזרקים סטריליים של 1 מ"ל בשקיות עיקור אטומות עצמיות (1 לכל עכבר) יום אחד לפני הליך העיקור דרך הפה. הכניסו את כוסות הפוליפרופילן הללו ו-600 מ"ל (1 לכל עכבר) וזוג מלקחיים ארוכים לתוך שקית בטוחה לחיטוי ועיקרו באמצעות חיטוי.
   2. מיד עם הוצאת השקית מהחיטוי, אטמו את השקית בנייר דבק ואחסנו אותה עד למחרת.
2. הכנת תרחיץ צואה אנושי
   1. ביום הגוואג', העבירו צואה אנושית הומוגנית ומאוחסנת באמצעי שימור אנאירוביים (במקרה זה, אמצעי הובלה דנטלי נוזלי) מהמקפיא של -80 מעלות צלזיוס לתא האנאירובי. לדלל חומר צואה הומוגני כ-1:10 בתמיסת מלח סטרילית ואנאירובית בצינור חרוטי של 10 מ"ל.
   2. אטום את הצינור המכיל את תרחיץ הצואה האנושי עם פרפילם, הומוגניזציה על ידי מערבולת, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-200 גרם למשך 5 דקות כדי ליישב חלקיקים.
   3. החזר את הצינור לתא האנאירובי והעביר את הסופרנטנט לצינור חרוטי נוסף של 10 מ"ל. אטמו את הצינור המכיל את הסופרנטנט הצואתי האנושי עם פרפילם, הוציאו אותו מהתא האנאירובי והניחו אותו במיכל משני חסין דליפות. העבירו את המכולה יחד עם שקית החיטוי של ציוד הגאווג' למקום המגורים לבעלי החיים.
      הערה: חיוני להעריך את סך ה-CFU/מ"ל של הצואה האנושית המיועדת לגזע למטרות דיווח. לא ברור מהו עומס ה-CFU המינימלי כדי להבטיח קולוניזציה מספקת, אך CFU גבוה יותר מוביל להשתלה טובה יותר של צואה^{תורם 13}. אם עומס ה-CFU של חומר צואה אנושי מביא לשיעורי חריטה נמוכים, זכור דגימות צואה אנושיות. השימוש באמצעי שימור כדאיות ישפר את התאוששות ה-CFU מדגימות צואה שנאספו. כדי לקבוע את ספירת ה-CFU האנאירובית/אירובית של צואת התורם, יש לדלל את הדגימה באופן סדרתי ^{ל-1 x 10-5} ולצלחת 10 מיקרוליטר מכל דילול בשכפול על צלחות אגר BHI ו-LB אירוביות ואנאירוביות. לאחר 24 שעות (אירובי) ו-48 שעות (אנאירובי), ספרו את ה-CFU לגרם צואה.
3. הכנת האיזוקאג'ים
   1. חזור על שלבים 2 ו-3, כאשר ההבדל היחיד כעת הוא שיש עכברים השוכנים בכלובים אלה, ויש להקפיד שתוך 30 דקות מהסרת המתלה, כל איזוקאז' יוכנס למכסה המנוע המעוקר והמכסה מאוורר כדי לאפשר זרימת אוויר לעכברים.
   2. עקר את שקית חומר הגאווג' החיטוי ואת צינור התרחיץ הצואתי האנושי משלבים 5.1 ו-5.2 באמצעות רוויה מעקרת כלור-דו חמצני באופן דומה לבקבוקי המים (כלומר, טבלו אותם בחומר סטרילנטי ולאחר מכן הניחו אותם בשקית ספוגה בסטרילנט).
   3. העבירו את האיזוקאז'ים ואספקת הגוואג' דרך הפה לארון הבטיחות הביולוגית לאחר השלמת תקופת העיקור של 20 דקות. נקב את שקית האספקה שעברה חיטוי על ידי דחיפת השקית כנגד המלקחיים הארוכים הכלולים בפנים, ולאחר מכן הסר את האספקה והשליך את השקית מחוץ למכסה המנוע.
4. גבאג'
   1. לבשו חלוק כירורגי סטרילי חדש וכפפות כירורגיות סטריליות במקום הכפפות העמידות לכימיקלים על מנת למנוע מגע של שאריות כלור-דו חמצני עם עכברים. בקש מהעוזר לעזור בתהליך זה במידת הצורך.
   2. הכן את מחטי הגוואג' על ידי פתיחת כל שקית עיקור והשתמש בחלק הפנימי של השקית כמשטח מנוחה יבש וסטרילי. חבר את מחט הגאווג' לכל מזרק, פתח את צינור התרחיץ הצואתי ומשוך 200 מיקרוליטר של תרחיץ צואה לכל מזרק.
   3. בעזרת מלקחיים, אחוז בבסיס הזנב של עכבר בודד בכלוב והנח אותו על מתלה החוט. רסנו בעדינות את העכבר על ידי שפשוף, ותוך כדי החזקת העכבר במצב אנכי זקוף, הכניסו את המחט והזריקו בעדינות את תרחיץ הצואה, ולאחר מכן הסרה מיידית של המחט.
   4. הנח את העכבר ישירות לתוך אחת הכוסות המעוקרות להשגחה. חזור על התהליך עבור כל עכבר בכלוב. לאחר שכל העכברים קיבלו את הגוואג', השתמשו במלקחיים כדי להזיז כל עכבר בחזרה למיטת הכלוב ולאטום את הכלוב כמתואר בשלבים 4.3.2-4.3.4.
      הערה: במקרים בהם נעשה שימוש בשתי תמיסות צואה נפרדות או יותר, נדרש עיקור מחדש מלא של ארון הבטיחות הביולוגית והכלובים והחומרים הנדרשים. במקרים בהם קבוצת עכברים נשארת נקייה מחיידקים, מומלץ שעכברים אלה יקבלו את הביקורת שלהם לפני כל קבוצה אחרת.
   5. בצע את ההליך בשלב 4.4 כדי להיפטר מחומרים מעקרים ומעקרים כלור-דו חמצני. התייחס לכל החומרים המזוהמים בתמיסת צואה אנושית כפסולת ביו-רפואית והשליך אותם בהתאם לנהלי הבריאות והבטיחות הסביבתיים.

6. איסוף צואה מעכברים מואנשים לשימור כדאיות

1. הכנת ציוד חיטוי
   1. יש להניח מלקחיים קצרים בעלי קצה רחב בשקיות עיקור אטומות עצמיות (1 לכל עכבר), כוסות פוליפרופילן בנפח 600 מ"ל (1 לכל עכבר) וזוג מלקחיים ארוכים לתוך שקית בטוחה לחיטוי ולעקר באמצעות חיטוי יום אחד לפני הליך איסוף הצואה.
   2. מיד עם הוצאת השקית מהחיטוי, אטמו את השקית בנייר דבק ואחסנו אותה עד למחרת.
2. הכנת צינור מדיה לשימור
   1. בחר אמצעי שימור כדאיות אנאירובית (כאן נעשה שימוש בקארי בלייר). יש להכניס 1 מ"ל של אמצעי שימור לצינורות סטריליים עם מכסה בורג של 2 מ"ל בארון בטיחות ביולוגית. יחס של 1:10 צואה:מדיה מומלץ לשימור אופטימלי.
   2. סמן מראש כל צינור בטוש קבוע, אך שים לב שחשיפה למעקר כלור-דו חמצני עלולה להסיר תוויות סמן קבועות ממשטחי פלסטיק. שיטה נוספת היא להשאיר את הצינורות ללא תווית ולבקש מהעוזר לתייג שפופרות מיד לאחר האיסוף לפני ההקפאה.
   3. הנח את הצינורות הללו במתלה צינור פוליפרופילן רגיל כדי לאפשר לאחסן את הצינורות זקופים תוך מתן אפשרות לעיקור על ידי מגע עם מעקר כלור-דו חמצני.
3. כלובי עיקור וארון בטיחות ביולוגית
   1. חזור על שלבים 2 ו-3 כדי לעקר איזוקאג'ים וארון הבטיחות הביולוגית. שוב, הקפד לוודא שתוך 30 דקות מהסרת המתלה, כל איזוקאז' מונח לתוך מכסה המנוע המעוקר, והמכסה מאוורר כדי לאפשר זרימת אוויר לעכברים.
   2. בנוסף, יש לעקר את שקית האספקה והמתלה המכילים צינורות מוכנים באמצעות רוויה מעקרת כלור-דו חמצני ולהניח אותם בשקית הניילון הספוגה המכילה את הכלובים. המטרה היא מגע נוזלי מלא עם כל המשטחים של כל צינור והמתלה עצמו.
4. איסוף ואחסון דגימות צואה
   1. העבר את האיזוקאז'ים, האספקה החיטוי ומתלה הצינורות לארון הבטיחות הביולוגית לאחר השלמת תקופת העיקור של 20 דקות. נקב את שקית האספקה שעברה חיטוי על ידי דחיפת השקית כנגד המלקחיים הארוכים הכלולים בפנים, הסר את החומרים המתכלים והשליך את השקית מחוץ למכסה המנוע.
   2. לבשו חלוק כירורגי סטרילי חדש וכפפות כירורגיות סטריליות במקום הכפפות העמידות לכימיקלים על מנת למנוע מגע של שאריות כלור-דו חמצני עם עכברים. בקש מהעוזר לסייע בתהליך זה אם תרצה.
   3. הכן את מלקחיים עם קצה קהה על ידי פתיחת השקיות ושימוש במשטח השקית הפנימי כאזור סטרילי. הנח את מתלה הצינור על פני מכסה המנוע.
   4. בעזרת מלקחיים ארוכים, תפסו את בסיס הזנב של עכבר בודד בכלוב והניחו אותם ישירות לתוך אחת הכוסות המעוקרות לתצפית. חזור על תהליך זה עבור כל עכבר בכלוב.
   5. התבונן בעכברים עד שנוצרו לפחות שני כדורי צואה טריים.
      1. בעזרת מלקחיים עם קצה קהה, הרם את כדורי הצואה והנח אותם ישירות לתוך הצינור. אטום מיד את מכסה מכסה הבורג והעביר אותו לעוזר.
      2. בקש מהעוזר לתייג את הצינור ומיד להומוגניזציה של הצואה באמצעות מערבולת. לאחר ההומוגניות, הקפיאו את הצינור בחנקן נוזלי ואחסנו לטווח ארוך בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
   6. חזור על תהליך איסוף הצואה עבור כל עכבר בכלוב. החלף כל עכבר בכלוב הביתי לאחר איסוף הצואה, ועגן מחדש את הכלובים על המתלה שלהם. חזור על שלב 4.4 כדי לנקות את מכסה המנוע ולהשליך פסולת.

תוצאות

דגימות צואה אנושיות, שנאספו על ידי פנוטיפ מגיב ICI ופנוטיפ שאינו מגיב (שתואר קודם לכן בפרוטוקול), חולקו לעכברי GF-WT מעורבים ששוכנו ב-3 איזוקאז'ים לקבוצה (n = 1-2 עכברים לכלוב, n = 6 למגיב ו-n = 5 ללא-מגיבים). עכברים הורשו להתאקלם במשך שבוע לאחר ההעברה. לאחר מכן נאספו דגימות צואה מהעכבר...

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה ניתנת לשחזור ומפורטת ביותר להאנשה של עכברים נטולי חיידקים השוכנים באיזוקאז'ים ניסיוניים. היכולת להשתיל באופן בלעדי קהילות צואה מנבדקים אנושיים למארחי עכברים היא בעלת ערך רב לחקר המיקרוביום. ללא זיהום ממיקרוביוטה קומנסלית ספציפית לעכבר, ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL BD Slip Tip Syringe sterile, single use	Fisher Scientific	309659
2.0 mL Screw Cap Tube, NonKnurl,Skirted,Natural, E-Beam Sterile tube w/ attached cap	Fisher Scientific	14-755-228
36 x 32 x 48" 3 Mil Gusseted Poly Bags	Uline	S-13455
5 gallon tank of Exspor chlorine-dioxide sterilant activator	Ecolab	6301680
5 gallon tank of Exspor chlorine-dioxide sterilant base	Ecolab	6301194
600 mL polypropylene beakers	Fisher Scientific	S01914
ALPHA-dri bedding	Shepherd Specialty Papers
Anaerobic chamber	Coy Lab Products	Type B
Biosafety cabinet class 2	Nuaire
Certified IsoCage autoclavable HEPA filter XT Extreme Temperature	Tecniplast	1245ISOFHXT
Clear Lens LPX IQuity Safety Goggles	Fastenal	922205455
DuPont Tyvek Sleeve - 18"	Uline	S-13893E
DWK Life Sciences DURAN 45 mm Push-on Natural Rubber Cap	Fisher Scientific	01-258-107	Rubber cap for 1 L autclave bottles
Dynalon Quick Mist HDPE Sprayer Bottles	Fisher Scientific	03-438-12B
Fisherbran Polypropylene Graduated Cylinders	Fisher Scientific	03-007-44
Fisherbran Dissecting Blunt-Pointed Forceps	Fisher Scientific	08-887
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches	Fisher Scientific	01-812-51
Fisherbrand Straight Broad Strong Tip General Application Forceps	Fisher Scientific	16-100-107
Fisherbrand lead Free Autoclave Tape	Fisher Scientific	15-901-110
Gavage needle, reusable stainless steel. Straight. 22 gauge needle, tip diameter 1.25 mm, length 38 mm or 1.5 inches(doz)	Braintree Scientific	N-PK 020
H-B Instrument Durac Timer	Fisher Scientific	13-202-015
IsoPositive Cages and Rack (i.e. isocages)	Tecniplast	ISO30P	30 cages (6 w x 5 h), single sided
Nitrile Chemical Resistant Gloves Size S (7), M (8) or L (9) 18” long, 22 mil, Ansell	Grainger	4T426
Nitrile Exam Gloves, Medium, Non-Sterile, Powder-Free	MedSupply Partners	KG-1101M
Olive / Magenta Bayonet Gas & Vapor Cartridges / Particulate Filter 2Ct	3M/Fastenal	50051138541878
Polycarbonate RadDisk Mini for Mice 8-75 x 4	Braintree Scientific	IRD-P M
Polypropylene Bouffant Caps - 24", Blue	Uline	S-10480BLU
Puritan Cary-Blair Medium, 5 mL	Fisher Scientific	22-029-646
S, M and L Blue Silicone Dual-Mode Head Harness Half Mask Respirator	3M/Fastenal	50051131370826
Sgpf Series Sterile Powder Free Latex Gloves, CT International, Thickness = 6.5 mm, Length = 30.5 cm (12), Glove Size = 8.5, Glove Color = White	Fisher Scientific	18-999-102F
Skid Resistant Shoe Cover	Uline	S-25639
Surgical Gown, Towel, Sterile, Large, 32/cs	Thomas Scientific	KIM 95111
Teklad Global 18% protein extruded rodent diet (sterilizable)	Inotiv	2018SX
Thermo Scientific Nalgene Heavy-Duty Rectangular LLDPE Tank with Cover (20 L volume)	Thermo Scientific	14-831-330J
VERIFY Dual Species Self Contained Biological Indicators	Steris Healthcare	S3061
WypAll L40 1⁄4 Fold Wipers	Uline	S-8490