从P0新生大鼠海马神经元的原代培养

摘要

解剖和个人的大脑区域的细胞的生长，促进细胞和生理参数的调查。我们描述了一个初级细胞培养的方法，在无血清环境产生的神经元丰富的文化。

摘要

通常调查海马神经元的生理特性，特别是由于在学习和记忆的海马的参与。海马细胞培养，允许神经学家研究在单个细胞和单突触水平的神经元的活动和属性。在这段视频中，我们将演示如何隔离和成长从新生大鼠海马细胞。海马可能是孤立的，从每个新生动物在短短2至3分钟，和文化可以保持长达两个星期。我们还将简要演示了如何使用这些海马神经元的比例钙成像。虽然这一协议描述为海马的过程中，几乎没有修改，它可以被应用到大脑的其他地区。

研究方案

此前海马隔离

海马隔离开始之前，确保所有的工具是无菌的。喷雾用70％乙醇的文化的油烟机，并置于罩内的工具。您将需要6 - 10厘米的培养皿，无菌聚L镀膜玻璃盖玻片，移液器和技巧，一次性移液器，电动移液器。从这个角度上，记得要使用正确的无菌技术。

1. 打开水洗澡，并确保它被加热到37℃
2. 下面的解决方案，保存在4 ° C，将需要：
   • 改良Eagle培养基（MEM）
   • Neurobasal
   • 汉克的缓冲的盐溶液（HBSS）
   • 硼酸盐缓冲液
   • 丙酮酸钠溶液
   • 在蒸馏水中的无菌过滤20％葡萄糖溶液
     
     
   • 确保所有的瓶子放置在引擎盖前喷用70％乙醇。
     
     
3. 取出冷冻的这些冻结的解决方案，并放置在一个恒温水浴：
   • 一个马血清5毫升分​​装
   • 一个B - 27的补充1毫升分装
   • 1毫升等分的100X抗生素（青霉素加链霉素）
   • 和L -谷氨酰胺0.5毫升分装
4. 解冻的解决办法后，取出来的水洗澡，喷用70％乙醇，并将其放置在引擎盖。现在可以准备电镀和Neurobasal媒介。
5. 的解决方案准备完毕后，盖的容器紧紧地放置在37℃水浴热身，同时执行海马隔离。
6. 另外，取出的冰柜的蛋白酶胰蛋白酶（2.5％）等分，并放置在水浴。胰蛋白酶消化解剖海马，下一步将在隔离。
7. 以15毫升锥形管，它填补的HBSS，治疗组和标签。正是在这里隔离海马将在下一步的收集。

海马隔离

1. 要开始海马隔离，确保新生幼崽是干净的，有他们的牛奶乐队，胎盘，并删除他们的母亲的脐带。
2. 放置在培养皿中的幼崽，喷用70％乙醇清洗，放置在引擎盖。动物安乐死立即前培养。
3. 如需进一步消毒，采取一个小狗的菜，沾小狗到70％的乙醇，然后进入无菌的HBSS洗涤。
4. 删除从身体，用剪刀头。使用相同的剪刀，穿过皮肤和颅骨。
5. 使用一双细镊子，剥离颅骨远离大脑，把大脑变成一个小型的培养皿中，包含少量无菌的HBSS。
6. 剥开大脑半球。海马是一个小型的内侧颞叶，海马状结构。
7. 海马和地点分为3毫升15毫升管的H​​BSS中删除。每个小狗重复这些步骤，每一个孤立的海马放入15毫升管。现在，它是游离于组织单细胞的时间。
   

海马细胞的解离

1. 毕竟海马已被隔离，填补了15毫升管4.5毫升的HBSS。
2. 取出从水浴中，用乙醇喷雾，并在引擎盖的胰蛋白酶。管加入0.5毫升的胰蛋白酶，15分钟在37 ° C。
3. 在引擎盖上，从管中删除的HBSS /胰蛋白酶液，用无菌吸管，小心不要去打扰的相继落户到试管底部的海马。加入5毫升的HBSS管和涡流轻轻。在37 ° C孵育5分钟。
4. 重复此步骤两次，删除旧的HBSS，并更换新鲜的溶液。
5. 以我出的DNA酶等分的冰柜。 4.5毫升的HBSS中加入0.5毫升的DNA酶的海马。添加到促进DNA酶是酶失活。
6. 磨碎的解决方案（或吸管达上下），直到它被同质。要小心不要引入气泡匀浆。
7. 与台盼蓝排除法确定细胞活力。
8. 以10厘米的培养皿中含有6至8盖玻片，并添加10毫升的电镀液。移液器所需的细胞数量的菜含有盖玻片。轻轻地分散细胞的漩涡，并确保盖玻片不重叠。
9. 允许的细胞附着在饱和湿度37℃培养箱中培养2-4小时，用5％的_CO 2 。确认后，这些细胞是可行和有附加，转移盖玻片个别菜肴含有Neurobasal中等。进入孵化器，将这些菜。
10. 每周一次，更换三分之一的中型新鲜Neurobasal中和试验性治疗，如需要。现在，在培养这些细胞的功能特性加以研究。

FURA - 2的海马神经元钙成像

1. 后48小时（但不得早） 在体外培养海马神经元钙离子成像实验就可以开始。此时，这些神经元已经开始扩展过程。钙成像的最佳年龄范围是从体外3日至7 。
2. FURA - 2负载的文化AM在37 ° 30分钟，之后，他们可以根据一个20X使用氙弧灯来激发钙指示剂和一个512位的CCD相机，样本每150毫秒的目标成像。

讨论

该协议被修改的开创性工作银行家加里和金Goslin ^1。这本书是一个重要的资源在培养细胞有兴趣的人 - 不仅在目前的协议描述的神经丰富的文化。

细胞培养的三个最关键的因素是：不育，速度，介质的选择使用。

不育 -层流/无菌罩，无菌条件下，无菌孵化器是必需的。污染不仅不利于目前的实验工作，但也可能已计划的后续工作，在任何步骤。孵化器已被污染后，它可能需要数?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic antimitotic	Invitrogen	15240062
B-27 Supplement	Invitrogen	17504044	Serum free
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B6768
Dnase I	Sigma-Aldrich	DN25
Fura-2, AM cell permeant	Molecular Probes, Life Technologies	F1221
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
HBSS (10X)	Invitrogen	14185052
HEPES	Invitrogen	15630080
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
MEM	Invitrogen	51200038
Neurobasal	Invitrogen	12348017	Without phenol red
Poly-L-Lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P6282
Pyruvic Acid	Sigma-Aldrich	P2256
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
Sodium Tetraborate	Sigma-Aldrich
Trypsin, 2.5% (10X)	Invitrogen	15090046