Cultura primaria di neuroni dell'ippocampo da P0 ratti neonati

Riepilogo

La dissezione e la crescita delle cellule da una zona del cervello individuale facilita l'investigazione dei parametri cellulari e fisiologici. Descriviamo un metodo per la coltura di cellule primarie che produce neurone arricchito di culture in un ambiente privo di siero.

Abstract

Le proprietà fisiologiche dei neuroni dell'ippocampo sono comunemente indagati, soprattutto per il coinvolgimento dell'ippocampo nell'apprendimento e nella memoria. Primaria coltura delle cellule dell'ippocampo neuroscienziati permette di esaminare le attività e le proprietà dei neuroni in singole cellule e del livello singola sinapsi. In questo video ci dimostra come isolare e coltivare cellule primarie di ippocampo di ratti neonati. L'ippocampo possono essere isolati gli uni dagli animali appena nati nel più breve 2-3 minuti, e le culture può essere mantenuta per un massimo di due settimane. Ci sarà anche brevemente illustrare come utilizzare questi neuroni dell'ippocampo per l'imaging di calcio raziometrico. Anche se questo protocollo descrive il processo per l'ippocampo, con poca o nessuna modifica, può essere applicato ad altre regioni del cervello.

Protocollo

Prima dell'isolamento dell'ippocampo

Prima di iniziare l'isolamento dell'ippocampo, assicurarsi che tutti gli strumenti sono sterili. Spray giù il cappuccio della cultura con il 70% di etanolo, e atto gli strumenti all'interno della cappa. Avrete bisogno di 6 - e 10 cm di piastre di Petri, sterile poli-L coprioggetto vetro rivestito, pipette e le punte, pipette monouso, e un pipettatore elettrica. Da questo punto in poi, ricordatevi di usare correttamente la tecnica sterile.

1. Accendere il bagno d'acqua e fare in modo che viene riscaldato fino a 37 ° C.
2. Le seguenti soluzioni che vengono conservati a 4 ° C saranno necessarie:
   • Media modificato Eagle (MEM)
   • Neurobasal
   • Soluzione salina tamponata di Hank (HBSS)
   • Soluzione tampone borato
   • Piruvato di sodio soluzione
   • Sterile filtrata soluzione di glucosio al 20% in acqua distillata
     
     
   • Assicurati di spruzzare tutte le bottiglie con il 70% di etanolo prima di metterli nel cofano.
     
     
3. Prendete queste soluzioni congelato dal freezer e metterli in un bagno di acqua riscaldata:
   • Un'aliquota di 5 ml di siero di cavallo
   • A 1 ml di aliquota B-27 supplemento
   • A 1 ml di aliquota 100X antibiotico (penicillina più streptomicina)
   • E di 0,5 ml aliquota di L-glutammina
4. Dopo le soluzioni sono scongelati, li tolga dal bagno d'acqua, spruzzi giù con il 70% di etanolo, e metterli nel cofano. Ora il medium placcatura e Neurobasal possono essere preparati.
5. Dopo le soluzioni sono preparate, tappo i contenitori ermeticamente e metterli nella vasca 37 ° C per riscaldarsi durante l'esecuzione l'isolamento dell'ippocampo.
6. Inoltre, prendere una aliquota della proteasi tripsina (2,5%) dal freezer e metterlo in bagno d'acqua. Tripsina sarà digerire l'ippocampo sezionato, che sarà isolato nella fase successiva.
7. Prendete un tubo 15ml conica, riempirlo con HBSS, e l'etichetta con il gruppo di trattamento. E 'qui che isolato dell'ippocampo saranno raccolti nella fase successiva.

Isolamento dell'ippocampo

1. Per iniziare l'isolamento dell'ippocampo, assicurarsi che i cuccioli appena nati sono pulite e hanno avuto la loro band il latte, placente e cordoni ombelicali rimosso dalla madre.
2. Posizionare i cuccioli in piastre di Petri, spruzzare con il 70% di etanolo per la pulizia, e metterli nel cofano. Gli animali sono l'eutanasia immediatamente prima coltura.
3. Per la sterilizzazione ulteriore prendere uno cucciolo dal piatto, immergere il cucciolo in etanolo al 70%, e poi in due lavaggi di HBSS sterile.
4. Rimuovere la testa dal corpo con le forbici. Utilizzando le forbici stesso, tagliare attraverso la pelle e il cranio.
5. Utilizzando un paio di pinzette bene, la buccia del cranio di distanza dal cervello e mettere il cervello in una piccola scatola di Petri che contiene una piccola quantità di HBSS sterile.
6. Staccare gli emisferi cerebrali. L'ippocampo è una piccola struttura a forma di cavalluccio marino nel lobo temporale mediale.
7. Rimuovere l'ippocampo e il luogo in 3 ml di HBSS in una provetta da 15 ml. Ripetere questi passaggi con ogni cucciolo, e svolge ogni ippocampo isolato nel tubo da 15 ml. Ora, è tempo di dissociare il tessuto di singole cellule.
   

Dissociazione delle cellule dell'ippocampo

1. Dopo tutto dell'ippocampo sono state isolate, riempire il tubo 15 ml a 4,5 ml con HBSS.
2. Rimuovere la tripsina dal bagno d'acqua, spruzzare con l'etanolo, e posto nel cofano. Aggiungere 0,5 ml di tripsina al tubo, e incubare per 15 minuti a 37 ° C.
3. Nel cofano, rimuovere il HBSS / tripsina soluzione dal tubo con una pipetta sterile, facendo attenzione a non disturbare il dell'ippocampo che si sono insediati sul fondo della provetta. Aggiungere 5 ml di HBSS al tubo e miscelare delicatamente. Incubare a 37 ° C per 5 minuti.
4. Ripetere questo passaggio due volte, la rimozione del vecchio HBSS e la sostituzione con una soluzione fresca.
5. Prelevare un 'aliquota di DNAsi I fuori dal freezer. Aggiungere 0,5 ml di DNasi al dell'ippocampo HBSS in 4,5 ml. La DNAsi è aggiunto a promuovere l'inattivazione dell'enzima.
6. Triturare la soluzione (o pipetta su e giù) finché non è omogeneo. Fare attenzione a non introdurre bolle in omogenato.
7. Determinare la vitalità cellulare con il metodo trypan esclusione blu.
8. Prendete un piatto di 10 centimetri Petri contenente 6-8 vetrini, e aggiungere 10 ml di terreno placcatura. Pipettare il numero desiderato di cellule al piatto contenente il coprioggetto. Agitare delicatamente per disperdere le cellule, e assicurarsi che il coprioggetto non si sovrappongano.
9. Permettono alle cellule di attaccare per 2-4 ore in un umidificata a 37 ° C incubatore con 5% di CO _2. Dopo aver confermato che le cellule sono vitali e hanno attaccato, trasferire i coprioggetti ai piatti singoli contenenti terreno Neurobasal. Luogo questi piatti nuovamente dentro l'incubatrice.
10. Una volta alla settimana, sostituire un terzo del mezzo con freschi di media Neurobasal e le cure sperimentali, se necessario. Ora, le proprietà funzionali di queste cellule in coltura sono pronti per essere studiati.

Fura-2 Imaging di calcio di neuroni dell'ippocampo

1. Dopo colture di neuroni dell'ippocampo sono state in vitro per 48 ore (ma non prima), gli esperimenti di imaging di calcio può avere inizio. A questo punto, questi neuroni dovrebbero avere iniziato a estendere i processi. La fascia di età ottimale per l'imaging calcio è dal primo giorno in vitro 3 a 7.
2. Culture di carico con Fura-2 AM per 30 minuti a 37 ° C, dopo di che può essere ripreso sotto un obiettivo 20X usando una lampada ad arco allo xeno per eccitare il colorante indicatore di calcio e una fotocamera da 512 bit ccd, che campioni di ogni 150ms.

Discussione

Questo protocollo è stato sviluppato come una modifica del lavoro seminale di Gary Banker e Kim Goslin ^1. Questo libro è una risorsa essenziale per chiunque sia interessato a cellule di coltura - non solo il neurone arricchito di culture descritte nel protocollo corrente.

I tre fattori più critici nella coltura delle cellule sono: la sterilità, la velocità, la scelta del mezzo utilizzato.

Sterilità - un flusso laminare / cappa sterile, condizioni asettiche, e una sterile incubatore sono obbl...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic antimitotic	Invitrogen	15240062
B-27 Supplement	Invitrogen	17504044	Serum free
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B6768
Dnase I	Sigma-Aldrich	DN25
Fura-2, AM cell permeant	Molecular Probes, Life Technologies	F1221
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
HBSS (10X)	Invitrogen	14185052
HEPES	Invitrogen	15630080
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
MEM	Invitrogen	51200038
Neurobasal	Invitrogen	12348017	Without phenol red
Poly-L-Lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P6282
Pyruvic Acid	Sigma-Aldrich	P2256
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
Sodium Tetraborate	Sigma-Aldrich
Trypsin, 2.5% (10X)	Invitrogen	15090046