Culture primaire de neurones de l'hippocampe de rats nouveau-nés P0

Résumé

La dissection et la croissance de cellules provenant d'une zone du cerveau individuel facilite enquête sur les paramètres cellulaires et physiologiques. Nous décrivons un procédé de culture de cellules primaires qui produit des cultures enrichies en neurones dans un environnement dépourvu de sérum.

Résumé

Les propriétés physiologiques des neurones de l'hippocampe sont couramment étudiés, notamment en raison de l'implication de l'hippocampe dans l'apprentissage et la mémoire. Primaire culture cellulaire hippocampique permet neuroscientifiques d'examiner l'activité et les propriétés des neurones à la cellule individuelle et le niveau de la synapse unique. Dans cette vidéo, nous allons démontrer comment isoler et de cultiver des cellules primaires d'hippocampe de rats nouveau-nés. L'hippocampe peut être isolée de chaque animal nouveau-né dans le plus court de 2 à 3 minutes, et les cultures peuvent être maintenus pendant jusqu'à deux semaines. Nous allons aussi brièvement démontrer comment l'utilisation de ces neurones de l'hippocampe pour l'imagerie calcique ratiométrique. Alors que ce protocole décrit le processus de l'hippocampe, avec peu ou aucune modification, il peut être appliqué à d'autres régions du cerveau.

Protocole

Avant l'isolement hippocampique

Avant le début de l'isolement de l'hippocampe, assurez-vous que tous les outils sont stériles. Vaporiser le bas de la hotte de la culture à l'éthanol 70%, et place les outils à l'intérieur du capot. Vous aurez besoin de 6 - et 10-cm boîtes de Pétri, stérile poly-L lamelles de verre enduit, pipettes et des conseils, des pipettes jetables, et une pipette électrique. A partir de ce moment, pensez à utiliser une technique stérile correcte.

1. Mettez le bain d'eau et assurez-vous qu'il est chauffé à 37 ° C.
2. Les solutions suivantes qui sont conservés à 4 ° C seront nécessaires:
   • Eagle modifié Medium (MEM)
   • Neurobasal
   • Hank solution saline tamponnée (HBSS)
   • Solution tampon borate
   • Solution de pyruvate de sodium
   • Filtration stérile solution de glucose à 20% dans l'eau distillée
     
     
   • Assurez-vous de pulvériser toutes les bouteilles vers le bas avec 70% d'éthanol avant de les placer dans la hotte.
     
     
3. Prenez ces solutions congelées du congélateur et les placer dans un bain d'eau chauffée:
   • Une partie aliquote de 5 ml de sérum de cheval
   • Une partie aliquote de 1 ml de B-27 complètent
   • Une partie aliquote de 1 ml de 100X antibiotiques (pénicilline plus streptomycine)
   • Et une partie aliquote 0,5 ml de L-glutamine
4. Après les solutions sont décongelés, les sortir du bain d'eau, les arroser avec de l'éthanol à 70%, et les placer dans la hotte. Maintenant, le support de placage et Neurobasal peuvent être préparés.
5. Après les solutions sont préparées, le bonnet d'contenants hermétiquement et placez-les dans le bain à 37 ° C pour se réchauffer tout en effectuant l'isolement hippocampe.
6. En outre, prélever une aliquote de la trypsine protéase (2,5%) hors du congélateur et le placer dans l'eau du bain. La trypsine va digérer l'hippocampe disséqué, qui sera isolé dans l'étape suivante.
7. Prenez un tube de 15ml conique, le remplir avec du HBSS, et c'est l'étiquette avec le groupe de traitement. C'est ici que hippocampes isolées seront recueillies à l'étape suivante.

Isolement hippocampe

1. Pour commencer l'isolement de l'hippocampe, assurez-vous que les nouveau-nés sont propres et ont eu leurs bandes de lait, les placentas et cordons ombilicaux enlevés par leur mère.
2. Placez les chiots dans une boîte de Pétri, de pulvérisation avec de l'éthanol à 70% pour nettoyer, et les placer dans la hotte. Les animaux sont euthanasiés immédiatement avant la culture.
3. Pour la stérilisation en outre, prendre un chiot de l'antenne, tremper le chiot en éthanol de 70%, puis en deux lavages de HBSS stérile.
4. Retirez la tête du corps avec des ciseaux. En utilisant les ciseaux même, couper à travers la peau et le crâne.
5. En utilisant une paire de pinces fines, pelez le crâne loin du cerveau et la place du cerveau dans une petite boîte de Petri contenant une petite quantité de HBSS stérile.
6. Peler les hémisphères cérébraux. L'hippocampe est une petite structure en forme d'hippocampe-dans le lobe temporal médial.
7. Retirez l'hippocampe et le lieu dans 3 ml de HBSS dans un tube de 15 ml. Répétez ces étapes avec chaque chiot, et placer chaque hippocampe isolés dans le tube de 15 ml. Maintenant, il est temps de dissocier le tissu à des cellules individuelles.
   

Cellules hippocampiques de dissociation

1. Après tout hippocampes ont été isolés, remplir le tube de 15 ml à 4,5 ml avec HBSS.
2. Retirez la trypsine du bain d'eau, pulvérisation avec de l'éthanol, et sa place dans le capot. Ajouter 0,5 ml de trypsine dans le tube et incuber pendant 15 minutes à 37 ° C.
3. Dans la hotte, enlever la solution HBSS / trypsine du tube avec une pipette stérile, en prenant soin de ne pas déranger les hippocampes qui se sont installés au fond du tube. Ajouter 5 ml de HBSS dans le tube et agiter doucement. Incuber à 37 ° C pendant 5 minutes.
4. Répétez cette étape deux fois, en supprimant l'ancienne HBSS et les remplacer par une solution fraîche.
5. Prenez une aliquote de DNAse I du congélateur. Ajouter 0,5 ml de DNase à l'hippocampe en 4,5 ml de HBSS. La DNase est ajoutée afin de promouvoir l'inactivation des enzymes.
6. Triturer la solution (ou une pipette haut et bas) jusqu'à ce qu'elle soit homogène. Soyez prudent de ne pas introduire des bulles dans l'homogénat.
7. Déterminer la viabilité des cellules avec la méthode exclusion du bleu trypan.
8. Prenez une boîte de Petri de 10 cm contenant 6 à 8 lamelles, et ajouter 10 ml de milieu de placage. Pipeter le nombre souhaité de cellules de la boîte contenant les lamelles. Agiter doucement pour disperser les cellules, et assurez-vous que les lamelles ne se chevauchent pas.
9. Laisser les cellules se fixer pendant 2-4 heures dans un incubateur humidifié 37 ° C avec 5% de CO _2. Après avoir vérifié que les cellules sont viables et ont fixé, le transfert des lamelles aux plats individuels contenant milieu Neurobasal. Placer ces plats de retour dans l'incubateur.
10. Une fois par semaine, remplacez un tiers de la moyenne avec milieu Neurobasal frais et des traitements expérimentaux, au besoin. Maintenant, les propriétés fonctionnelles de ces cellules en culture sont prêts à être étudiés.

Fura-2 d'imagerie calcique des neurones de l'hippocampe

1. Après des cultures de neurones hippocampiques ont été in vitro pendant 48 heures (mais pas plus tôt), des expériences d'imagerie calcique peut commencer. À ce stade, ces neurones doivent avoir commencé à étendre les processus. La tranche d'âge optimal pour l'imagerie du calcium est de jour in vitro de 3 à 7.
2. Cultures de charge avec Fura-2 heures 30 minutes à 37 ° C, après quoi ils peuvent être visualisés sous un objectif 20X en utilisant une lampe à arc Xenon pour exciter le colorant indicateur de calcium et d'une caméra CCD de 512 bits, qui tous les échantillons 150ms.

Discussion

Ce protocole a été développé comme une modification de l'œuvre séminale de Gary Banquier et Kim Goslin ^1. Ce livre est une ressource essentielle pour quiconque s'intéresse à la culture de cellules - non seulement les cultures de neurones enrichi décrites dans le protocole actuel.

Les trois facteurs les plus critiques dans la culture cellulaire sont: la stérilité, la vitesse, le choix du support utilisé.

Stérilité - un écoulement laminaire / hotte stérile, des conditions d&#...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic antimitotic	Invitrogen	15240062
B-27 Supplement	Invitrogen	17504044	Serum free
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B6768
Dnase I	Sigma-Aldrich	DN25
Fura-2, AM cell permeant	Molecular Probes, Life Technologies	F1221
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
HBSS (10X)	Invitrogen	14185052
HEPES	Invitrogen	15630080
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
MEM	Invitrogen	51200038
Neurobasal	Invitrogen	12348017	Without phenol red
Poly-L-Lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P6282
Pyruvic Acid	Sigma-Aldrich	P2256
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
Sodium Tetraborate	Sigma-Aldrich
Trypsin, 2.5% (10X)	Invitrogen	15090046