P0 신생아 쥐에서 Hippocampal 신경의 주요 문화

요약

해부 및 개별 뇌 영역에서 세포의 성장은 세포와 생리적 매개 변수의 조사를 용이하게합니다. 우리는 혈청이없는 환경에서 신경 세포 - 풍부한 문화를 생산하는 주요 세포 culturing에 대한 방법을 설명합니다.

초록

hippocampal 신경의 생리적 특성은 일반적으로 특히 때문에 학습 및 메모리에 해마의 참여의 조사입니다. 기본 hippocampal 세포 culturing은 neuroscientists는 개별 세포와 단일 버렸네 수준에서 뉴런의 활동과 속성을 확인하실 수 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 신생아 쥐의 기본 hippocampal 세포를 분리하고 성장하는 방법을 보여줍니다. 해마는 2~3분만큼 짧은 각 신생아 동물로부터 격리 수 있으며, 문화 두 주에 유지하실 수 있습니다. 우리는 또한 간략하게 ratiometric 칼슘 이미징 이러한 hippocampal 뉴런을 사용하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 이 프로토콜은 어떠한 수정을 거의, 해마에 대한 과정을 설명하는 동안, 그것은 두뇌의 다른 지역에 적용할 수 있습니다.

프로토콜

hippocampal 분리하기 전에

hippocampal 고립을 시작하기 전에 모든 도구 멸균되어 있는지 확인합니다. 70 % 에탄올과 문화 후드를 스프레이하고, 후드 내부의 도구를 놓으십시오. , 멸균 폴리 - L 코팅 유리 coverslips, pipettors 및 팁, 일회용 pipettes, 그리고 전기 pipettor과 10 cm 배양 접시 - 당신이 6 필요합니다. 이 시점부터는 올바른 살균 기술을 사용해야합니다.

1. 물 목욕 켜고 그것이 37 ° C.까지 가열되어 있는지 확인합니다
2. 4 저장되어있는 다음과 같은 솔루션 ° C가 필요합니다 :
   • 수정된 이글의 중간 (멤)
   • Neurobasal
   • 행크의 버퍼 생리 식염수 (HBSS)
   • Borate 버퍼 솔루션
   • 나트륨 pyruvate 솔루션
   • 증류수에 멸균 필터링 20 % 포도당 용액
     
     
   • 후드에서 그들을 배치하기 전에 70 %의 에탄올과 함께 모든 병을을 스프레이하십시오.
     
     
3. 냉동실에서 이러한 냉동 솔루션을 가지고 온수 물 목욕에서 그들을 장소 :
   • 말 혈청 5 ML의 나누어지는
   • B - 27 보충의 한 ML의 나누어지는
   • 100X 항생제의 한 ML의 나누어지는 (페니실린 스트렙토 마이신 플러스)
   • L - 글루타민 및 0.5 ML의 나누어지는
4. 솔루션은 해동 후, 물 목욕 그들을 데리고 70 % 에탄올과 그들을 스프레이하고, 후드에서 그들을 놓으십시오. 이제 도금과 Neurobasal 매체 준비하실 수 있습니다.
5. 해결책이 준비 후 hippocampal 고립을 수행하는 동안 워밍업을 단단히 용기 뚜껑과 37 ° C 목욕에서 그들을 놓으십시오.
6. 또한, 냉장고 밖으로 프로 테아제 트립신 (2.5 %)의 나누어지는를 타고 물 욕조에 넣습니다. 트립신은 다음 단계에서 격리됩니다 해부하는 해마를 소화합니다.
7. , 15ml 원뿔 튜브를 타고 HBSS로 기입하고, 치료 그룹으로 분류. 그것은 고립된 hippocampi는 다음 단계에서 수집됩니다 여기에 있습니다.

Hippocampal 절연

1. hippocampal 격리를 시작하려면 신생아 새끼는 깨끗해하고 우유 밴드, placentas, 그들의 어머니에 의해 제거 탯줄 코드를 적이 있는지 확인하십시오.
2. 청소하고, 후드에서 그들을 곳으로 70 %의 에탄올과 배양 접시에있는 스프레이 새끼를 놓습니다. 동물은 euthanized culturing 바로 앞에 있습니다.
3. 자세한 살균 한 접시에서 강아지를 타고 70 % 에탄올로 강아지를 찍어 다음 멸균 HBSS 두 씻는다로.
4. 가위로 시체에서 머리를 제거합니다. 같은 가위를 사용하여 피부와 두개골을 통해 했네요.
5. 멀리 두뇌에서 두개골 껍질, 괜찮아요 족집게 한 켤레를 사용하여 멸균 HBSS의 작은 금액을 포함하는 작은 페트리 접시에 머리를 놓으십시오.
6. 대뇌 반구 다시 필. 해마는 중간 측두엽에있는 작은 해마 모양의 구조입니다.
7. 15 ML 튜브의 HBSS 3 ML에 해마과 장소를 제거합니다. 각각의 강아지와 함께 이러한 단계를 반복하고, 15 ML 튜브에 각각 분리된 해마를 놓으십시오. 이제 하나의 세포로 조직을 떼어 놓다 시간이 있습니다.
   

Hippocampal 세포 분리

1. 모든 hippocampi가 고립되어 후 HBSS와 4.5 ML로 15 ML 튜브를 입력하십시오.
2. 후드에있는 물 목욕, 에탄올과 스프레이, 장소에서 트립신을 제거합니다. 튜브에 트립신 0.5 ML를 추가하고 37 15 분 동안 품어 ° C.
3. 후드에서 튜브의 바닥에 정착 hippocampi을 방해하지 않도록주의하고, 멸균 피펫으로 튜브에서 HBSS / 트립신 용액을 제거합니다. 부드럽게 관과 소용돌이에 HBSS 5 ML을 추가합니다. ° C 5 분 37 알을 품다.
4. 이전 HBSS를 제거하고 신선한 솔루션으로 대체 두번이 단계를 반복합니다.
5. 냉동고의 I가 DNAse의 나누어지는 가져가라. 4.5 ML의 HBSS에 hippocampi에 DNase 0.5 ML를 추가합니다. DNAse는 효소 불활 성화를 촉진에 추가됩니다.
6. 솔루션을 씹다 (또는 그리고 아래로 피펫)는 동질 때까지. homogenate에 거품을 소개하지 않도록주의하십시오.
7. trypan 블루 제외 메서드를 사용하여 세포 생존을 확인합니다.
8. 6-8 coverslips을 포함 10cm 페트리 접시를 타고, 도금 매체 10 ML를 추가합니다. coverslips 들어있는 접시에 세포의 원하는 번호를 피펫. 소용돌이는 부드럽게 세포를 분산하고, coverslips가 중복되지 않도록합니다.
9. 세포 5 % CO ₂ humidified 37 ° C 배양기에서 2-4시간 위해 첨부할 수 있습니다. 세포가 가능한되며 첨부 것을 확인한 후, Neurobasal 매체를 포함하는 각각의 요리에 coverslips을 전송하기만하면됩니다. 인큐베이터에 다시 이런 요리를 놓습니다.
10. 일주일에 한 번, 필요한만큼, 신선한 Neurobasal 매체와 실험 치료와 매체의 3 분의 1을 교체하십시오. 이제 문화에서 이러한 세포의 기능 특성 연구로 준비가되어 있습니다.

Hippocampal 뉴런의 Fura - 2 칼슘 이미징

1. 교양 hippocampal 뉴런 48 시간 (하지만 이전)에 대한 체외에 있었 후, 칼슘 이미징 실험을 시작할 수 있습니다. 이 시점에서,이 뉴런들은 프로세스를 확장하기 시작한다. 칼슘 이미징을위한 최적의 연령 범위는 체외 3 일에서 7입니다.
2. Fura - 2와 부하 문화 37 30 분 AM ° 그들이 어떤 샘플 매 150ms를 칼슘 표시기 염료 및 512 비트 CCD 카메라를 자극하는 제논 아크 램프를 사용하여 20X 목적에 따라 몇 군데 수있는 후에 C.

토론

이 프로토콜은 게리 뱅커와 김 고슬린 ^1의 혁신적인 작품의 수정으로 개발되었습니다. 이 책은 culturing 세포에 관심이 사람을위한 필수적인 리소스입니다 -뿐만 아니라 신경 세포 - 풍부한 문화는 현재 프로토콜 설명했다.

세포 culturing에있는 세 개의 가장 중요한 요소는 다음과 같습니다 불임, 속도, 사용되는 매체의 선택이다.

불임 - 층류 / 살균 후드, 무균 조건 및 무균 인큐베이...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic antimitotic	Invitrogen	15240062
B-27 Supplement	Invitrogen	17504044	Serum free
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B6768
Dnase I	Sigma-Aldrich	DN25
Fura-2, AM cell permeant	Molecular Probes, Life Technologies	F1221
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
HBSS (10X)	Invitrogen	14185052
HEPES	Invitrogen	15630080
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
MEM	Invitrogen	51200038
Neurobasal	Invitrogen	12348017	Without phenol red
Poly-L-Lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P6282
Pyruvic Acid	Sigma-Aldrich	P2256
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
Sodium Tetraborate	Sigma-Aldrich
Trypsin, 2.5% (10X)	Invitrogen	15090046