怀特黑德研究所的研究员基金

第1部分：设置感染<ol><li> HeLa细胞生长在烧瓶，等到约80％融合的细胞。 </li><li>准备足够的实验病毒的生长介质：含2％FBS的DMEM定期和不添加抗生素。 </li><li>感染可以进行原油库存的牛痘病毒与已知的滴度，或蔗糖纯化与一个已知滴度的病毒，如果你对宿主基因表达有关。 </li><li>如果您使用的是蔗糖纯化的病毒，请直接进入第2部分。 </li><li>如果您使用的是一个粗略的牛痘病毒的股票，只是之前的感染，超声一杯sonicator病毒等分的大多是冰的浴缸和一点点水。 <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li>在20秒左右30W超声。 </li><li>涡管和重复的超声3次，加入更多的冰，如果需要保持与冰和冷冻包装的杯子。 </li><li>涡之间的每个超声一步。 </li><li>进入第2部分。 </li></ul></li><li>另外，如果你不具备一个杯子sonicator，等体积混合的原油病毒库存和0.25mg/mL胰蛋白酶。 <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li>涡大力。 </li><li>股票/胰蛋白酶在37℃水浴孵育病毒混合30分钟。 </li><li>涡在5-10分钟一班。 </li><li>进入第2部分。 </li></ul></li></ol>第2部分：感染细胞<ol><li>计算病毒感染所需的感染复数（MOI）的单层颗粒的数量。通常情况下，高MOI（5和10之间），是用于感染timecourses。 </li><li>添加蔗糖纯化的病毒或胰酶消化原油病毒所需的金额，以37 ° C病毒的生长媒体和拌匀。您应该使用足够的介质，以刚好盖住烧瓶的底部。例如，10毫升的T - 175烧瓶媒体。 </li><li>从细胞中移除的媒体和室温PBS冲洗。 </li><li>添加到每个烧瓶中的病毒/病毒的生长介质。 <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li>涡流轻轻倾斜板和37 ° C为1小时5％CO2培养箱。 </li><li>每15分钟倾斜和旋流板，传播病毒的统一，保持细胞的湿润。 </li><li>对于0hr/Mock时间点，只添加病毒的生长介质，添加没有病毒的。 </li></ul></li><li> 1小时的潜伏期后，取出含有病毒的媒体，并与室温PBS冲洗三次。 </li><li>添加到每个烧瓶中的病毒的生长介质的最高金额。例如，30毫升的T - 175烧瓶媒体。开始计数为0小时的时间点。 </li></ol>第3部分：收获细胞<ol><li>细胞在显微镜下检查，并注意任何细胞病变效应（CPE）。 </li><li>取出介质，并与30毫升室温PBS冲洗细胞。 </li><li>添加15毫升的胰蛋白酶的细胞和2 - 5分钟，在37 ° C。 </li><li>在显微镜下检查细胞脱落和挖掘烧瓶中，轻轻地打跑细胞。 </li><li>血清50 mL锥形管，用无菌吸管转移细胞。 </li><li>洗细胞生长介质等体积的容量瓶中，并添加媒体在锥形管的胰酶消化细胞。 </li><li>离心机在室温下5分钟的300 ×克细胞。 </li><li>取出细胞​​沉淀的胰蛋白酶/媒体。 </li><li>无论你所需的RNA提取试剂盒TRIzol试剂或细胞裂解液重悬细胞沉淀。 </li><li>如果你是用TRIzol，分为1毫升分装在1.5ml的标记Eppendorf管中，并冻结的样品在-80 ° C。 </li><li>重复所有的时间点，每一个时间点瓶收获。 </li></ol>第4部分：在TRIZOL RNA提取样品<ol><li>在这一点上，您的样品应悬浮于Trizol试剂，并准备进行处理。 </li><li>新增的Trizol每1毫升每管BCP相分离试剂200μL。您可能需要将样品转移到一个较大的管，如果你开始与大量的Trizol。 </li><li>涡或用力振摇，并在室温下孵育2-3分钟。 </li><li>离心12,000 15分钟XG的样本。 </li><li>水相转移到一个新的管。水相是在顶部的层次清晰。你应该收回大约为每毫升TRIZOL你开始600μL。 </li><li>做第二个酚/氯仿抽提，而不是口岸这次使用的氯仿每1 ml TRIZOL500μL，。 </li><li>涡或用力振摇，并在室温下孵育2-3分钟。 </li><li>离心12,000 15分钟XG的样本。 </li><li>水相转移到一个新的管。水相是在顶部的层次清晰。 </li><li>每个样品中添加20μg线性丙烯酰胺。线性丙烯酰胺作为载体，有助于沉淀的RNA。 </li><li>新增500＆MICRO;异丙醇大号，每1毫升的Trizol，你开始了与每个样品拌匀。 </li><li>样品在室温下孵育10分钟。 </li><li>离心机在一个最高速度为10-15分钟，离心。 </li><li>的RNA沉淀在试管底部可见。非常仔细，从管中移除上清液，使用真空吸引器，或手动移液器。请勿打扰的颗粒。 </li><li> 1毫升70％的乙醇洗涤沉淀。 <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li>加入1毫升70％的乙醇沉淀。 </li><li>以最快的速度离心14000克为5-7分钟。 </li><li>非常仔细，从管中删除乙醇，使用真空吸引器或手动移液器。检查，沉淀在试管底部可见。 </li><li>上清液。 </li></ul></li><li>重复洗涤步骤。后取上清液丢弃，标记颗粒管。 </li><li>空气干燥颗粒不超过5分钟。不要overdry，或RNA的重组将难以！ </li><li>如果你想按照可选的DNA酶处理，以去除任何剩余的DNA样品，无核酸酶水悬浮颗粒在17μL。否则，重悬沉淀，无核酸酶水20μL，继续到步骤22。 </li><li> （可选的DNA酶处理）使用Qiagen公司的无RNA酶的DNA酶设置，添加2μL缓冲区的RDD和1μL重组无RNase的悬浮RNA的DNA酶我。轻轻混匀。 </li><li> （可选的DNA酶处理）37 ° 30分钟。 </li><li> （可选的DNA酶处理）添加2μL2.5毫米EDTA和孵化，在65 ° C至5分钟灭活DNA酶。不要超过灭活时间或温度，更长的时间/温度较高，可能会导致RNA的降解。 </li><li>检查由分光光度计的RNA浓度。 </li><li> RNA样品存放在-80 ° C </li><li> （可选的QC）使用安捷伦生物分析仪检查RNA的质量，或通过运行一个变性凝胶上的样品和检查的OD值。 （260nm和260/280的比例） </li></ol>

<ol>
	<li>KH, R. u. b. i. n. s., LE, H. e. n. s. l. e. y., GW, B. e. l. l., Wang, C., EJ, L. e. f. k. o. w. i. t. z., PO, B. r. o. w. n., DA, R. e. l. m. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection:+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes.">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li><li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundstr&#246;m, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes.">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li><li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxvirus+transcriptome+analysis.">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li><li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundstr&#246;m, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss:+Poxvirus+transcriptome+analysis.">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Pascual-Montano, A., Mu&#241;oz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells.">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells.">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Pascual-Montano, A., N&#225;jera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC:+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells.">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li><li>Guerra, S., N&#225;jera, J. L., Gonz&#225;lez, J. M., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Climent, N., JM, G. a. t. e. l. l., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC.">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li></ol>

关键步骤第1部分和2 有几个关键步骤设置同步的牛痘感染，小心病毒（或trypzinizing）超声，以分解病毒颗粒。牛痘是极易发生聚合，重要的是确保即使感染细胞的病毒颗粒的破坏。为了实现一个同步的感染，高MOI（大于2）应使用，以确保每一个细胞都感染。受感染和未受感染的细胞的混合物，会导致感染，多轮异构混合物的时间点，和异步的病毒与宿主转录...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>TRIzol Reagent</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15596-026</td>
<td>Similar reagents, such as TriPure from Roche, will also work.</td>
</tr>
<tr>
<td>BCP Phase Separation Reagent</td>
<td>Reagent</td>
<td>Molecular Research Center</td>
<td>BP151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase-Free DNase Set</td>
<td>Reagent</td>
<td>Qiagen</td>
<td>79254</td>
<td>DNase treatment is an optional step.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

vaccinia virus infection &amp; temporal analysis of virus gene expression: part 1

家庭<em&gt; Poxviridae</em&gt;由大型双链DNA含有病毒在感染细胞的细胞质中完全复制。成员<em&gt;痘</em&gt;属包括天花，人类的小痘病原体，猴痘，牛痘（VAC）的病毒家族的原型成员。在比较大（约200 KB）痘苗病毒基因组中，3类基因编码的早期，中期，和后期。维拉利编码RNA聚合酶转录虽然所有这三个类，每一类有一个病毒的生命周期中的不同功能。痘病毒利用调制主机在感染的细胞环境的多种策略。为了了解主机和病毒基因表达的调控，我们利用全基因组的方法，从病毒和宿主细胞的转录丰度分析。在这里，我们展示日久感染的HeLa细胞在几个时间点后感染牛痘病毒和采样RNA。主机和病毒总RNA分离和扩增为杂交微阵列基因表达分析。

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Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

协议牛痘感染的HeLa细胞和宿主和病毒基因的表达分析。

牛痘病毒感染及病毒基因表达的时空分析：第1部分

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

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Biology

10.2K 次观看.  MIT - Massachusetts Institute of Technology. 协议牛痘感染的HeLa细胞和宿主和病毒基因的表达分析。