Los becarios del Instituto Whitehead Fondos

Parte 1: Configuración de la infección <ol><li> Se cultivan las células HeLa en frascos y esperar hasta que las células son aproximadamente el 80% confluente. </li><li> Prepare suficiente medio de cultivo viral para el experimento: regular DMEM con FBS al 2% y no hay antibióticos añadidos. </li><li> La infección se puede realizar ya sea con una reserva de crudo del virus de la vacuna con un título conocido, o sacarosa purificada de virus con un título sabe si usted está preocupado acerca de la expresión génica de acogida. </li><li> Si está utilizando virus sacarosa purificada, vaya directamente a la parte 2. </li><li> Si usted está usando un archivo crudo virus vaccinia, justo antes de la infección, sonicar una alícuota del virus en una taza de baño de ultrasonidos con un baño de hielo y sobre todo un poco de agua. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Sonicado en torno a 30W durante 20 segundos. </li><li> Vórtice del tubo y repetir el tratamiento con ultrasonidos 3 veces, agregando más hielo si es necesario para mantener el vaso lleno de hielo y frío. </li><li> Vortex en cada paso sonicación. </li><li> Proceder a la parte 2. </li></ul></li><li> Por otra parte, si usted no posee un sonicador taza, mezcle un volumen igual de la acción del virus del crudo y la tripsina 0.25mg/mL. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Agitar vigorosamente. </li><li> Incubar el virus de archivo / tripsina mezcla en un baño de agua a 37 ° C durante 30 minutos. </li><li> Vortex a intervalos de 5-10 minutos. </li><li> Proceder a la parte 2. </li></ul></li></ol> Parte 2: Infección de las células <ol><li> Calcular la cantidad de partículas virales necesarias para infectar a la monocapa en la multiplicidad deseado de infección (MOI). Por lo general, un alto MOI (entre 5 y 10) se utiliza para timecourses infección. </li><li> Agregar la cantidad deseada de virus sacarosa purificada o el virus de crudo trypsinized a 37 ° C los medios de cultivo viral y mezclar bien. Que deben utilizar los medios suficientes para cubrir sólo el fondo del frasco. Por ejemplo, 10 ml de los medios de comunicación de un frasco T-175. </li><li> Retire el medio de las células y enjuague con la temperatura ambiente PBS. </li><li> Añadir el virus / los medios de comunicación viral de crecimiento a cada frasco. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Agitar suavemente, placas de inclinación y se incuba a 37 ° C en un incubador de CO2 al 5% durante 1 hora. </li><li> Placas de inclinación y agitar cada 15 minutos a la propagación del virus de manera uniforme y mantener las células húmedas. </li><li> Por un momento el punto 0hr/Mock, añadir el medio de cultivo viral solamente, sin virus añadido. </li></ul></li><li> Después de la incubación de 1 hora, retire el material que contiene el virus, y enjuáguese la boca tres veces con PBS temperatura ambiente. </li><li> Añadir la cantidad máxima de medio de cultivo viral a cada frasco. Por ejemplo, 30 ml de los medios de comunicación de un frasco T-175. Empezar a contar esto como su punto 0 tiempo hr. </li></ol> Parte 3: las células de cosecha <ol><li> Comprobar que las células bajo un microscopio y observar cualquier efecto citopático (CPE). </li><li> Eliminar los medios de comunicación y aclarar las células con 30 ml de PBS temperatura ambiente. </li><li> Agregar 15 ml de tripsina a las células y se incuba durante 2-5min a 37 ° C. </li><li> Compruebe bajo el microscopio para el desprendimiento de células y pulse frasco suavemente para separar las células. </li><li> La transferencia de células con una pipeta serológica estéril en un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Lavar el matraz con un volumen igual de medio de cultivo celular, y añadir los medios de comunicación a las células con tripsina en el tubo cónico. </li><li> Centrifugar las células a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Retire la tripsina / medios de comunicación de la célula de pellets. </li><li> Resuspender el botón celular en cualquier reactivo TRIzol o el tampón de lisis de su kit de aislamiento de ARN deseado. </li><li> Si usted está usando TRIzol, dividir la muestra en alícuotas de 1 ml en 1,5 ml etiquetados tubos Eppendorf y se congela a -80 ° C. </li><li> Repita este procedimiento para todos los tiempos, la cosecha de un frasco por cada punto del tiempo. </li></ol> Parte 4: extracción de RNA de muestras en TRIzol <ol><li> En este punto, las muestras deben ser resuspendidas en el reactivo Trizol y listo para ser procesado. </li><li> Añadir 200μL del reactivo de separación de fase BCP por cada 1 ml de TRIzol en cada tubo. Puede que tenga que transferir la muestra a un tubo más grande si usted está comenzando con una gran cantidad de TRIzol. </li><li> Vortex o agite vigorosamente y se incuba a temperatura ambiente durante 2-3 minutos. </li><li> Centrifugar la muestra a 12.000 xg durante 15 minutos. </li><li> Pasar la fase acuosa a un tubo nuevo. La fase acuosa es la capa transparente en la parte superior. Usted debe ser la recuperación de aproximadamente 600μL por cada 1 ml de TRIzol que empezó. </li><li> Hacer una segunda extracción con fenol / cloroformo, esta vez con 500μL de cloroformo por 1 ml de Trizol, en lugar de BCP. </li><li> Vortex o agite vigorosamente y se incuba a temperatura ambiente durante 2-3 minutos. </li><li> Centrifugar la muestra a 12.000 xg durante 15 minutos. </li><li> Pasar la fase acuosa a un tubo nuevo. La fase acuosa es la capa transparente en la parte superior. </li><li> Añadir a 20 microgramos de acrilamida lineal para cada muestra. La acrilamida lineal actúa como soporte y ayuda a precipitar el ARN. </li><li> Añadir 500 y micro, L de isopropanol por 1 ml de TRIzol que comenzó con a cada muestra y mezclar bien. </li><li> Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos. </li><li> Centrifugación en una microcentrífuga a máxima velocidad durante 10-15 minutos. </li><li> El ARN precipitado será visible en la parte inferior del tubo. Con mucho cuidado, separar el sobrenadante del tubo, ya sea con una aspiradora, o manualmente por pipeta. No moleste a la bolita. </li><li> Lavar el pellet con 1 ml de etanol al 70%. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Añadir 1 ml de etanol al 70% de la pastilla. </li><li> Centrifugar a 14.000 g velocidad máxima durante 5-7 minutos. </li><li> Con mucho cuidado, separar el etanol del tubo, ya sea con una aspiradora, o manualmente por pipeta. Compruebe que la pastilla es visible en la parte inferior del tubo. </li><li> Eliminar el sobrenadante. </li></ul></li><li> Repita el paso de lavado. Después se desecha el sobrenadante, marcar el lugar donde se pellet en el tubo. </li><li> Aire seco en pelets por no más de 5 minutos. No seque en demasía, o el ARN será difícil reconstruir! </li><li> Si desea seguir el tratamiento opcional DNasa para eliminar cualquier resto de ADN de la muestra, resuspender el precipitado en 17μL de agua libre de nucleasa. De lo contrario, resuspender el precipitado en 20μL de agua libre de nucleasa y continúe con el paso 22. </li><li> (Opcional tratamiento DNasa) Utilizando el Qiagen RNasa libre de DNasa set, añadir 2μL Buffer RDD y 1μL reconstituido RNasa libre de DNasa I para el ARN se resuspendió. Mezclar suavemente. </li><li> (Opcional tratamiento DNasa) Se incuba a 37 ° C durante 30 minutos. </li><li> (Opcional tratamiento DNasa) Añadir 2μL de 2,5 mM EDTA y se incuba a 65 ° C durante 5 minutos para inactivar la DNasa. No exceda el tiempo de inactivación o temperatura ya veces / altas temperaturas pueden causar la degradación del ARN. </li><li> Comprobar la concentración de ARN por espectrofotometría. </li><li> Almacenar las muestras de ARN a -80 ° C. </li><li> (CC Opcional) Compruebe la calidad del ARN mediante un Bioanalyzer Agilent, o mediante la ejecución de la muestra en un gel desnaturalizante y comprobar las lecturas de OD. (260 nm y la relación 260/280) </li></ol>

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	<li>KH, R. u. b. i. n. s., LE, H. e. n. s. l. e. y., GW, B. e. l. l., Wang, C., EJ, L. e. f. k. o. w. i. t. z., PO, B. r. o. w. n., DA, R. e. l. m. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection:+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes.">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li><li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundstr&#246;m, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes.">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li><li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxvirus+transcriptome+analysis.">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li><li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundstr&#246;m, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss:+Poxvirus+transcriptome+analysis.">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Pascual-Montano, A., Mu&#241;oz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells.">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells.">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Pascual-Montano, A., N&#225;jera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC:+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells.">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li><li>Guerra, S., N&#225;jera, J. L., Gonz&#225;lez, J. M., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Climent, N., JM, G. a. t. e. l. l., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC.">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li></ol>

Los pasos críticos Part 1 &amp; 2 Hay varios pasos fundamentales para la creación de una infección sincrónica vaccinia, el primer baño de ultrasonidos con cuidado (o trypzinizing) del virus, con el fin de desagregar las partículas de virus. Vaccinia es muy propensa a la agregación, y la alteración de las partículas del virus es importante para asegurar incluso la infección de las células. A fin de lograr una infección sincrónica, un alto MOI (superior a 2...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>TRIzol Reagent</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15596-026</td>
<td>Similar reagents, such as TriPure from Roche, will also work.</td>
</tr>
<tr>
<td>BCP Phase Separation Reagent</td>
<td>Reagent</td>
<td>Molecular Research Center</td>
<td>BP151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase-Free DNase Set</td>
<td>Reagent</td>
<td>Qiagen</td>
<td>79254</td>
<td>DNase treatment is an optional step.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

vaccinia virus infection &amp; temporal analysis of virus gene expression: part 1

La familia<em&gt; Poxviridae</em&gt; Se compone de grandes de doble cadena de ADN que contienen los virus que se replican exclusivamente en el citoplasma de las células infectadas. Los miembros de la<em&gt; Orthopox</em&gt; Género incluyen la viruela, el agente causante de la viruela humana, viruela de los monos, y la vaccinia (VAC), el miembro prototípico de la familia del virus. En el genoma relativamente grande (~ 200 kb) vaccinia, tres clases de genes están codificados: temprana, intermedia y tardía. Mientras que las tres clases son transcritos por la forma viral codificada ARN polimerasas, cada clase tiene una función diferente en el ciclo de vida del virus. Poxvirus utilizar múltiples estrategias para la modulación del ambiente celular del huésped durante la infección. Con el fin de entender la regulación de host y la expresión de genes del virus, hemos utilizado todo el genoma enfoques para analizar la abundancia de transcripción de los dos virus y las células huésped. Aquí, demostramos las infecciones tiempo del curso de las células HeLa con virus de la vacuna y el ARN de muestreo en varios puntos temporales después de la infección. Tanto del huésped como del ARN viral total es aislado y amplificado por la hibridación de microarrays para el análisis de la expresión génica.

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Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Protocolo de Vaccinia la infección de células HeLa y el análisis de la acogida y la expresión de genes virales.

Infección por el virus vaccinia y Análisis temporal de la expresión génica del virus: Parte 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K vistas.  MIT - Massachusetts Institute of Technology. Protocolo de Vaccinia la infección de células HeLa y el análisis de la acogida y la expresión de genes virales.