我们非常感谢阿兰特西尔宝贵的建议，讨论和技术支持。我们承认在Concordia大学生物应用质谱杰出服务中心。这项工作得到了CIHR和加拿大NSERC资助。 VIT是一个新的CIHR调查和Concordia大学基因组学研究主席，细胞生物学和老化。

材料和方法<ol><li>酵母菌株和生长条件。 丰富YEPD培养基中生长的野生型菌株BY4742（MATαhis3Δ1leu2Δ0lys2Δ0ura3Δ0）（1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖） 。细胞培养在30 ° C旋转摇晃锥形瓶在200 RPM“瓶体积/中等音量”5:1的比例。 </li><li>脂质提取的酵母细胞储存 <ol><li>文化是收获的细胞50毫升离心5分钟在3000 XG。 </li><li>用冷水冲洗两次。 <ol style=" list-style-type:lower-alpha;"><li>悬浮颗粒在25毫升冰水</li><li>在离心沉淀细胞，5分钟在3000 XG </li></ol></li><li>悬浮颗粒和转移到Eppendorf管</li><li>球离心，16000 XG 2分钟，取出使用上清于-80 ° C，直到和冻结。 （我们使用异丙醇的烧杯中，也可以用液态氮保存在-80冷冻） </li></ol></li><li>试剂 自Sigma - Aldrich生物技术级氯仿和甲醇。游离脂肪酸和甘油三酯均购自Larodan（瑞典马尔默）。获得各种种磷脂 - 包括磷脂，磷脂，磷脂酰肌醇，磷脂酰丝氨酸，磷脂酸，并cardiolipins - 阿凡提极性脂（雪花石膏，AL，美国）。从费舍尔高速离心管玻璃与聚四氟乙烯内衬的盖子。 </li></ol>脂质提取这是一个布莱和代尔8所述的协议的修改。提取血脂所有的操作，应使用玻璃移液管或注射器，塑料将创建一个大的背景信号，如果他们接触到，以氯仿。确切的卷是不是只要关键氯仿的比例为1:2:0.8 -甲醇-在第3步中的H 2 O和2:2:1.8为氯仿-甲醇- H 2 O在第7步是保守的。 <ol><li>冷冻细胞重悬在1.6毫升的冰冷的蒸馏水H 2 O </li><li> 1.6毫升细胞悬液转移到高速的玻璃离心管。 </li><li>加入6毫升氯仿和甲醇（1:2）混合和0.8毫升细胞悬液的玻璃珠。 </li><li>涡细胞悬液，用玻璃珠1分钟的2倍。 </li><li>加入2毫升氯仿，轻轻混匀。 </li><li>孵育5分钟室温搅拌偶尔。 </li><li>加入2毫升的蒸馏水H 2 O，轻轻混匀。 </li><li>孵育5分钟室温搅拌偶尔。 </li><li>在3000 XG在室温下5分钟离心。 </li><li>整个液相收集到一个新的高速玻璃离心管。 </li><li>从第9步的细胞沉淀，加入3.2毫升氯仿。 </li><li>涡1分钟两次。 </li><li>在3000 XG在室温下5分钟离心。 </li><li>从第10步液相添加上清。 </li><li>在3000 XG在室温下5分钟离心。 </li><li>倒掉上层（水）相和较低的阶段（有机）转移到一个新的高速玻璃离心管。 </li><li>在3000 XG在室温下5分钟离心。 </li><li>整个上清转移到一个玻璃小瓶，干燥的氮气保护下。 </li><li>脂质膜溶解于500μL氯仿和储存在-20 ° C </li></ol>质谱分析血脂血脂标准的股票组合中的氯仿应事先准备好的，按表1，以及原液的甲醇 - 氯仿（1:1）0.1％（V / V）氢氧化铵。 <ol><li>注射前，结合10μL在表1提供的血脂标准混合样品10μL。在200μL1:1的氯仿：甲醇与0.1％NH 4 OH。 <ul><li>样本比例的标准是可以改变的需要。 </li></ul></li><li>解决使用一个微团的Q - TOF质谱仪配备与1μL/ min的流速在纳米电源经营血脂。 <ul><li>从仪器仪表精确的仪器参数会有所不同。一个微团配备一个纳米电源2 Q - TOF（沃特斯，米尔福德，马萨诸塞州，美国）的设置，请参阅表2。虽然我们已采取的Q - TOF质谱仪的一个类型的高分辨率的优势，它不是一种强制性要求。 </li></ul></li><li>收购后的质谱是平滑的，减去背景和中心，然后高峰列表导出到Excel。每个脂质类的峰值，然后归到他们的内部标准。根据不同的应用，它可能需要做进行进一步处理后deisotoping和反褶积等。 </li></ol> 表1。内部血脂标准，其浓度标准的组合，并为他们的分析MS模式。 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td>脂质类</td><td>标准链的构成</td><td>标准的质量</td><td>浓度（微克/毫升） </td><td> MS模式</td></tr><tr><td>磷脂酸</td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 591.40 </td><td> 100 </td><td>负面</td></tr><tr><td>磷脂酰乙醇胺</td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 634.45 </td><td> 200 </td><td>负面</td></tr><tr><td>磷脂</td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td>负面</td></tr><tr><td>磷脂</td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 622.37 </td><td> 40 </td><td>负面</td></tr><tr><td>心磷脂</td><td> 4x14：0 </td><td> 619.92 </td><td> 100 </td><td>负面</td></tr><tr><td>游离脂肪酸</td><td> 19:0 </td><td> 297.28 </td><td> 100 </td><td>负面</td></tr><tr><td>卵磷脂</td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 650.48 </td><td> 100 </td><td>积极的</td></tr><tr><td>甘油三酯</td><td> 13:0 / 13:0 / 13:0 </td><td> 698.63 </td><td> 200 </td><td>积极的</td></tr></tbody></table> 表2。一个微团Q - TOF 2（沃特斯，米尔福德，马萨诸塞州，美国）的仪器设置配备纳米电源。 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td>流量</td><td>锥孔电压</td><td>毛细管电压</td><td>碰撞气体</td></tr><tr><td>正离子模式</td><td> 1μl/min </td><td> -28 v </td><td> 3.0 KV </td><td> 10 </td></tr><tr><td>负离子模式</td><td> 1μl/min </td><td> 30 V </td><td> -3.2 KV </td><td> 10 </td></tr></tbody></table>

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	<li>Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+lipokine,+a+lipid+hormone+linking+adipose+tissue+to+systemic+metabolism.">Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism.</a> Cell. 134, 933-944 (2008).</li><li>Claypool, S. M., Oktay, Y., Boontheung, P., Loo, J. A., Koehler, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+defines+the+interactome+of+the+major+ADP/ATP+carrier+protein+of+the+mitochondrial+inner+membrane.">Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane.</a> J. Cell Biol. 182, 937-950 (2008).</li><li>Guo, T., Gregg, C., Boukh-Viner, T., Kyryakov, P., Goldberg, A., Bourque, S., Banu, F., Haile, S., Milijevic, S., San, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+signal+from+inside+the+peroxisome+initiates+its+division+by+promoting+the+remodeling+of+the+peroxisomal+membrane.">A signal from inside the peroxisome initiates its division by promoting the remodeling of the peroxisomal membrane.</a> J. Cell Biol. 177, 289-303 (2007).</li><li>Russell, S. J., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+regulation+of+ageing.">Endocrine regulation of ageing.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 681-691 (2007).</li><li>Czabany, T., Athenstaedt, K., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+storage+and+degradation+of+neutral+lipids+in+yeast.">Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1771, 299-309 (2007).</li><li>Br&amp;uuml, g. g. e. r., Erben, B., Sandhoff, G., Wieland, R., &amp;amp, F. T., Lehmann, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+biological+membrane+lipids+at+the+low+picomole+level+by+nano-electrospray+ionization+tandem+mass+spectroscopy.">Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2339-2344 (1997).</li><li>Schneiter, R., Br&#252;gger, B., Sandhoff, R., Zellnig, G., Leber, A., Lampl, M., Athenstaedt, K., Hrastnik, C., Eder, S., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry+(ESI-MS/MS)+analysis+of+the+lipid+molecular+species+composition+of+yeast+subcellular+membranes+reveals+acyl+chain-based+sorting/remodeling+of+distinct+molecular+species+en+route+to+the+plasma+membrane.">Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species en route to the plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 146, 741-754 (1999).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li></ol>

这种方法使酵母lipidome使用现成的，廉价的材料的快速定量评估。该方法允许大部分diacylglycerols，ergosterols和ergosteryl酯的例外在酵母细胞中发现的脂质物种的鉴定，虽然这些脂质可取代氢氧化锂，氢氧化铵确定。所描述的方法可低至微克/毫升的浓度脂质识别和量化，与浓度的线性超过2〜3个数量级（脂质种而定）的蔓延。虽然市售磷酸肌醇的适当的标准，本磷脂不同的分子形式可以使用其他磷脂?...

a quantitative assessment of the yeast lipidome using electrospray ionization mass spectrometry

脂质是生物分子的主要类别之一，并发挥重要作用膜动力学，能量存储，和信令<sup&gt; 1-4</sup&gt;。芽殖酵母<em&gt;酿酒酵母</em&gt;，一种基因和生物化学来操作带注释的基因组，很简单lipidome的单细胞真核生物，是一个有价值的模型，研究在多细胞真核生物中各种脂质物种的生物功能<sup&gt; 2,3,5</sup&gt;。<em&gt; S。酵母</em与链长，主要是16或18个碳原子和零或一个不饱和度&gt; 10血脂的主要类别<sup&gt; 6,7</sup&gt;。现有脂质的鉴定和定量的方法 - 如高效液相色谱法，薄层色谱法，荧光显微镜，气相色谱仪由MS - 已经非常成熟，但灵敏度低，不够独立的各种脂类分子形式，要求前脂质derivitization分析，或可相当费时。在这里，我们提出了我们的实验方法的详细说明，以解决这些固有的局限性，所使用的整个酵母细胞中的脂类补充的识别和定量调查扫描ESI / MS。所描述的方法不需要复杂的脂质混合物从酵母细胞中提取的色谱分离，从而大大加快了数据采集的过程。这种方法能够在低克/毫升的浓度脂质识别和量化，并已成功地应用于评估整个酵母细胞及其纯化细胞器lipidomes。血脂，使用这种方法血脂分析的整个酵母细胞中提取需要两到三个小时。它只有五到十分钟，上运行的Q - TOF质谱光谱仪配备了一个纳米电源每个样本提取和干燥血脂。

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A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

我们描述了一个新的定量确定使用调查的扫描电喷雾电离质谱（ESI / MS）酵母大量的脂质物种lipidomics方法。这种方法超过目前可用的方法脂质识别和量化的能力来解决血脂，灵敏度和速度不同的分子形式。

一个定量评估的酵母使用电喷雾质谱法Lipidome

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

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11.6K 次观看.  Concordia University. 我们描述了一个新的定量确定使用调查的扫描电喷雾电离质谱（ESI / MS）酵母大量的脂质物种lipidomics方法。这种方法超过目前可用的方法脂质识别和量化的能力来解决血脂，灵敏度和速度不同的分子形式。