我々は、貴重なアドバイス、ディスカッション、および技術サポートのためにアランテッシェに感謝しています。私たちは、優れたサービスのためのコンコルディア大学の質量分析の生物学的応用のためのセンターを認めます。この作品は、CIHRとカナダのNSERCからの補助金によって支えられている。 VITはCIHR新調査官とゲノミクスのコンコルディア大学のリサーチチェア、細胞生物学と高齢化です。

材料および方法<ol><li>酵母菌株及び成長条件 野生型株BY4742（MATαhis3Δ1leu2Δ0lys2Δ0ura3Δ0が ）豊富なYEPD培地（1％酵母エキス、2％ペプトン、2％グルコース）で増殖させた。細胞を30℃で回転が5:1の&quot;フラスコの体積/培地体積&quot;比での三角フラスコで200 rpmで振盪しながら培養した。 </li><li>脂質の抽出のための酵母細胞の貯蔵 <ol><li>細胞の50 mlの培養液で5分間3000 × gで遠心分離によって回収した。 </li><li>冷たい水で2回洗浄した。 <ol style=" list-style-type:lower-alpha;"><li> 25mlの氷冷水でペレットを再懸濁します</li><li> 5分間3000 × gで遠心分離で細胞をペレット化</li></ol></li><li>ペレットを再懸濁し、エッペンドルフチュー​​ブに移す</li><li>遠心分離によってペレット、2分間に16,000 xgでは、使用するまで-80℃で上清と凍結を解除する。 （我々はイソプロピルアルコールのビーカーを使用するには、液体窒素を使用することもできます-80冷凍庫に保管） </li></ol></li><li>試薬 バイオテクノロジーグレードのクロロホルムとメタノールは、Sigma - Aldrich社から購入した。遊離脂肪酸とトリアシルグリセロールはLarodan（マルメ、スウェーデン）から購入した。リン脂質の様々な種 - ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、およびカルジオリピンを含む - はアヴァンティ極性脂質（アラバスター、AL、米国）から入手した。テフロンライニングキャップを持つ高速ガラス遠心管はフィッシャーからのものであった。 </li></ol>脂質の抽出これは、ブライとダイアー8で記述されたプロトコルの変更です。抽出された脂質を持つすべての操作は、ガラスピペットやシリンジを用いて実施すべきである;彼らはクロロホルムと接触する場合、プラスチックには、大きなバックグラウンド信号を作成します。正確な量は、クロロホルムのため1:2:0.8の比率限り重要ではない-メタノール-クロロホルムのためのH 2、ステップ3でOと2:2:1.8 -メタノール-ステップ7でH 2 Oが保存されている。 <ol><li>氷冷蒸留H 2 Oを1.6 mlの凍結細胞を再懸濁し</li><li>高速ガラス遠心管に細胞懸濁液1.6 mlを。 </li><li>クロロホルムおよびMeOH（1:2）混合し、細胞懸濁液にガラスビーズを0.8mlの6mlを追加します。 </li><li>渦ガラスビーズを用いた細胞懸濁液に1分間2回。 </li><li>クロロホルム2mlを加え、穏やかに混ぜる。 </li><li>時々混合しながら室温で5分間インキュベートします。 </li><li>蒸留H 2 O 2 mlを加え、穏やかに混合する。 </li><li>時々混合しながら室温で5分間インキュベートする。 </li><li>室温で3000 xgで5分間遠心する。 </li><li>新しい高速ガラス遠心管に全体の液相を収集する。 </li><li>手順9からの細胞ペレットにクロロホルム3.2 mlを加え。 </li><li> 1分間ボルテックスを2回。 </li><li>室温で3000 xgで5分間遠心する。 </li><li>ステップ10から液相に上清を追加。 </li><li>室温で3000 xgで5分間遠心する。 </li><li>上段（水）相を破棄し、新しい高速ガラス遠心管に低い（有機）相を転送する。 </li><li>室温で3000 xgで5分間遠心する。 </li><li>ガラスバイアルに全体の上清を移し、窒素下で乾燥させます。 </li><li> -20℃で500のクロロホルム溶液とストア内脂質フィルムを溶かす</li></ol>質量分析による脂質の分析 0.1％のクロロホルム（1:1）（v / v）の水酸化アンモニウム - クロロホルム中の脂質の基準の株式のミックスは、表1と同様にメタノールの原液ごとに事前に準備する必要があります。 <ol><li>注入前に、表1に提供されて脂質の標準的なミックスを10μlとサンプル10μlを組み合わせる。午前1時01クロロホルムの200μLに：0.1％NH 4 OHとメタノール。 <ul><li>サンプルの比率への標準は、必要に応じて変更することができます。 </li></ul></li><li> 1μL/分の流速でナノエレクトロスプレーソースOSを搭載したマイクロマスQ - TOF 2質量分析計を用いて脂質を解決します。 <ul><li>正確なインストゥルメントのパラメータは、楽器から楽器ごとに異なります。ナノエレクトロスプレー源を装備したMicromass社Q - TOF 2（ウォーターズ、ミルフォード、MA、米国）のための設定については表2を参照してください。我々は質量分析計のQ - TOF型の高解像度の利点を取られているが、これは必須要件ではありません。 </li></ul></li><li>買収後はマススペクトルは平滑化され、背景が減算され、中央にして、ピークリストをExcelにエクスポート。各脂質クラスのピークは、それらの内部標準に正規化されます。アプリケーションによっては、そのようなdeisotopingとデコンボリューションなど、さらなる後処理を行う行う必要がある場合があります。 </li></ol> 表1内部の脂質基準、それらの濃度で標準的な混合、およびそれらの分析のためのMSモード。 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td>脂質クラス</td><td>標準チェーンの構成</td><td>標準の質量</td><td>濃度（μg/ ​​ml） </td><td> MSモード</td></tr><tr><td>ホスファチジン酸</td><td>午後2時/午後二時</td><td> 591.40 </td><td> 100 </td><td>マイナス</td></tr><tr><td>ホスファチジルエタノールアミン</td><td>午後2時/午後二時</td><td> 634.45 </td><td> 200 </td><td>マイナス</td></tr><tr><td>ホスファチジルイノシトール</td><td> N / </td><td> N / </td><td> N / </td><td>マイナス</td></tr><tr><td>ホスファチジルセリン</td><td>午後2時/午後二時</td><td> 622.37 </td><td> 40 </td><td>マイナス</td></tr><tr><td>カルジオリピン</td><td> 4x14：0 </td><td> 619.92 </td><td> 100 </td><td>マイナス</td></tr><tr><td>遊離脂肪酸</td><td>午前19時00分</td><td> 297.28 </td><td> 100 </td><td>マイナス</td></tr><tr><td>ホスファチジルコリン</td><td>午後2時/午後二時</td><td> 650.48 </td><td> 100 </td><td>正</td></tr><tr><td>トリアシルグリセロール</td><td>午前13時00分/ 13：00 /午後1時00分</td><td> 698.63 </td><td> 200 </td><td>正</td></tr></tbody></table>ナノエレクトロスプレー源を装備したMicromass社Q - TOF 2（ウォーターズ、ミルフォード、MA、米国） 表2。機器設定。 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td>流量率</td><td>コー​​ン電圧</td><td>キャピラリー電圧</td><td>衝突ガス</td></tr><tr><td>ポジティブモード</td><td> 1μl/min </td><td> -28 V </td><td> 3.0 KV </td><td> 10 </td></tr><tr><td>負のモード</td><td> 1μl/min </td><td> 30 V </td><td> -3.2 KV </td><td> 10 </td></tr></tbody></table>

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	<li>Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+lipokine,+a+lipid+hormone+linking+adipose+tissue+to+systemic+metabolism.">Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism.</a> Cell. 134, 933-944 (2008).</li><li>Claypool, S. M., Oktay, Y., Boontheung, P., Loo, J. A., Koehler, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+defines+the+interactome+of+the+major+ADP/ATP+carrier+protein+of+the+mitochondrial+inner+membrane.">Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane.</a> J. Cell Biol. 182, 937-950 (2008).</li><li>Guo, T., Gregg, C., Boukh-Viner, T., Kyryakov, P., Goldberg, A., Bourque, S., Banu, F., Haile, S., Milijevic, S., San, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+signal+from+inside+the+peroxisome+initiates+its+division+by+promoting+the+remodeling+of+the+peroxisomal+membrane.">A signal from inside the peroxisome initiates its division by promoting the remodeling of the peroxisomal membrane.</a> J. Cell Biol. 177, 289-303 (2007).</li><li>Russell, S. J., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+regulation+of+ageing.">Endocrine regulation of ageing.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 681-691 (2007).</li><li>Czabany, T., Athenstaedt, K., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+storage+and+degradation+of+neutral+lipids+in+yeast.">Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1771, 299-309 (2007).</li><li>Br&amp;uuml, g. g. e. r., Erben, B., Sandhoff, G., Wieland, R., &amp;amp, F. T., Lehmann, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+biological+membrane+lipids+at+the+low+picomole+level+by+nano-electrospray+ionization+tandem+mass+spectroscopy.">Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2339-2344 (1997).</li><li>Schneiter, R., Br&#252;gger, B., Sandhoff, R., Zellnig, G., Leber, A., Lampl, M., Athenstaedt, K., Hrastnik, C., Eder, S., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry+(ESI-MS/MS)+analysis+of+the+lipid+molecular+species+composition+of+yeast+subcellular+membranes+reveals+acyl+chain-based+sorting/remodeling+of+distinct+molecular+species+en+route+to+the+plasma+membrane.">Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species en route to the plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 146, 741-754 (1999).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li></ol>

このメソッドは、容易に入手できる、安価な材料を使用して酵母のlipidomeの迅速な定量的評価が可能になります。これらの脂質は、水酸化リチウムと水酸化アンモニウムを置き換えることによって識別することができるが方法は、ジアシルグリセロール、ergosterolsとergosterylエステルを除いて、酵母細胞にある脂質の種のほとんどの同定が可能になります。説明する方法は、大きさの2〜3桁（脂...

a quantitative assessment of the yeast lipidome using electrospray ionization mass spectrometry

脂質は、生体分子の主要なクラスの一つであり、重要な役割の膜の力学、エネルギー貯蔵、およびシグナリングを再生<sup&gt; 1月4日</sup&gt;。出芽酵母<em&gt;サッカロマイセスセレビシエ</em&gt;、注釈付きのゲノムと非常にシンプルなlipidomeと遺伝的および生化学的に操作可能な単細胞真核生物は、多細胞真核生物の様々な脂質の種の生物学的機能を研究するための貴重なモデルです。<sup&gt; 2,3,5</sup&gt;。<em&gt; S.出芽酵母</em&gt;主に16または18個の炭素原子と不飽和のゼロまたは1度の鎖長を持つ脂質の10の主要なクラスがあります<sup&gt; 6,7</sup&gt;。脂質の同定と定量のための既存の方法 - そのような高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、蛍光顕微鏡、およびMSに続いてガスクロマトグラフィーとしては - 十分に確立が低感度、脂質の不十分別の様々な分子形式は、前の脂質誘導体化を必要と持っています分析に、または非常に時間がかかる可能性があります。ここでは、酵母細胞内の脂質の全体補数の同定および定量化のために調査スキャンESI / MSを使用して、これらの固有の限界を解決するために我々の実験手法の詳細な説明を提示する。記載されている方法は、それによって大幅にデータ収集のプロセスを加速し、酵母細胞から回収した複合脂質の混合物のクロマトグラフ分離を必要としません。このメソッドはg / mlとして低濃度で脂質の同定と定量を可能にし、成功した全酵母細胞およびそれらの精製された細胞小器官のlipidomesを評価するために適用されています。脂質の分析のこの方法を使用するための全体の酵母細胞からの脂質の抽出は、2〜3時間かかります。それは、ナノエレクトロスプレー源を装備したQ - TOF質量分析計で抽出、乾燥脂質の各サンプルを実行するためにわずか5〜10分かかります。

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A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

我々は調査 - スキャンエレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI / MS）を用いて酵母で数々の脂質の種を識別するための新しい定量的な脂質メタボロームの手法を説明します。このメソッドは、現在、脂質の同定と定量脂質の様々な分子形態を解決する能力で、感度、およびスピードで利用できるメソッドを超えています。

エレクトロスプレーイオン化質量分析法を用いて酵母Lipidomeの定量評価

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

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11.6K ビュー.  Concordia University. 我々は調査 - スキャンエレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI / MS）を用いて酵母で数々の脂質の種を識別するための新しい定量的な脂質メタボロームの手法を説明します。このメソッドは、現在、脂質の同定と定量脂質の様々な分子形態を解決する能力で、感度、およびスピードで利用できるメソッドを超えています。