澳大利亚核科学与工程学院的支持，是公认的事实。 TCK的是AINSE奖项的收件人。表观医学实验室是支持由国家卫生和澳大利亚的医学研究理事会（566559）。 LM是由墨尔本研究所（墨尔本大学）和生物医学成像的华润补充奖学金支持。莫纳什显微成像（DRS斯蒂芬科迪ISKA卡迈克尔）的支持是这项工作的宝贵。

<html>细胞制备<ol><li>生长在角质形成细胞无血清培养人角质形成细胞（FEP - 1811）（K - SFM; Invitrogen公司）与表皮生长因子，牛垂体提取物和20微克/毫升庆大霉素的补充，在37 ° C和5％的CO 2 。 </li><li>用胰酶- EDTA（0.05％V / V）分离制备单细胞悬液</li><li>细胞接种于8实验室TEK第二microchamber幻灯片（万细胞/孔）和幻灯片，在37 ° C和5％的CO 2孵育3天。 </li></ol>放射<ol><li>冰使用的137 Cs源（1000 Gammacell精英辐照; Nordion公司国际上，加拿大; 20.6秒/ GY）与2戈瑞辐照细胞</li><li>未经辐照的控制和2 Gy照射细胞孵育1小时37 ° C和5％的CO 2 。 </li></ol>免疫荧光染色<ol><li>媒体通风报信，洗涤细胞，每孔300μL的PBS（W / O CA 2 +或Mg 2 +的 ），并在5分钟的轨道混频器的旋转。 </li><li>缓冲区是通风报信，新鲜配制的4％多聚甲醛（V / V），每孔加入幻灯片在室温下孵育10分钟100μL。 所有孵化加湿染色槽</li><li>细胞，然后用PBS（W / O型的Ca 2 +，Mg 2 +的 ）。 5分钟的轨道混频器，幻灯片被放置在一个Coplin JAR和旋转。此清洗步骤再重复两次。 </li><li>缓冲区是通风报信，多余的PBS轻轻涂抹。 </li><li>使用100毫升TRITON X - 100（0.1％V / V），每口井，在室温下孵育10分钟的细胞透。 </li><li>细胞，用PBS冲洗（W / O型的Ca 2 +或Mg 2 +的 ）如在上述步骤3和4中所述</li><li>在室温下（1％V / V）与BSA的100毫升的非特异性蛋白结合，阻止每口井和20分钟的孵育。 </li><li>多余的BSA是通风报信，鼠抗磷酸化组蛋白H2AX的抗体（1:500稀释，在1％BSA; Millipore公司）100μL，在室温下孵育1小时，每口井。 </li><li>细胞用PBS冲洗（W / O型的Ca 2 +或Mg 2 +）的步骤3和第4段中所述和培养100μL二次抗体（的Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG稀释1:500，在1％BSA ; Invitrogen公司），每45分钟，在室温下在黑暗中。 （摊薄抗体，整个过程被蒙在鼓里） </li><li>细胞，用PBS冲洗（W / O型的Ca 2 +或Mg 2 +的 ）如在上述步骤3和4中所述然而，暴露在光线下是最小化使用铝箔。 </li><li>核counterstaining是用100ml TOPRO3（稀释1:500; Invitrogen公司）进行，每口井，在室温下孵育10分钟的</li><li>细胞用PBS（W / O型的Ca 2 +或Mg 2 +）在第10步以上所述。 </li><li>该商会进行了仔细从幻灯片中删除多余的水分，涂抹和幻灯片被允许空气干燥。 </li><li>延长金防褪色的解决方案（Invitrogen）的下降，每孔加入幻灯片安装（22x50毫米盖玻片）和幻灯片的边缘周围的任何多余的液体被抹杀。 </li><li>被关在黑暗为进一步在室温下30分钟，然后用指甲油密封幻灯片。 </li><li>幻灯片一夜之间被储存在4 ° C的分析前的黑暗。 </li></ol>显微镜/分析<ol><li>蔡司LSM510 META共焦Microscpe用来获取图像，使用标准的绿色荧光蛋白（γH2AX - 的Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG）和远红光激光器（TOPRO - 3）。通常，一个63 ×油浸物镜使用。 一个0.5微米的一步大小，图像采集在Z系列模式。一个0.5微米的一步大小选择不同的平面，以尽量减少损失灶目前在细胞核。在分析过程中，个别飞机卷积和堆放产生一个最大投射影像的疫源地，以尽量减少重叠（顶帽子过滤器适用于）。 </li><li> Metamorph分子器件，（美国）是用来分析疫源地的数量。 该计划定量灶，在每个单元的阈值后，已被应用到排除的背景。该信息被记录在Microsoft Excel电子表格，作进一步的分析。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig1.jpg" alt="图1" /> 图1。γH2AX灶（绿色）的免疫可视化未经处理的人角质形成细胞和细胞在2 Gy的照射，并为进一步的1小时在37℃，5％的CO 2。 DNA染色TOPRO - 3（蓝色）。使用的Zeiss LSM 510 META激光共聚焦显微镜获得的图像。酒吧= 10微米。 e_content“&gt; <img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig2.jpg" alt="图2" /> 图2。γH2AX灶（绿色）的免疫可视化在人类角质形成细胞和细胞在2 Gy的照射，并为进一步的1小时在37℃，5％的CO 2。图片被收购使用的Zeiss LSM 510元共聚焦显微镜使用0.5微米的Z -切片（1-9），以确保所有灶被收购。的图像，然后堆放定量使用Metamorph。 DNA染色TOPRO - 3（蓝色）。堆叠堆叠γH2AX和蓝色的图像可视化。酒吧= 10微米。

<ol>
	<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo.">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li><li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma+H2AX+and+cancer.">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li><li>Savic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Dynamic+[gamma]-H2AX+Domains+along+Broken+DNA+Strands+Is+Distinctly+Regulated+by+ATM+and+MDC1+and+Dependent+upon+H2AX+Densities+in+Chromatin.">Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin.</a> Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).</li><li>Downs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+chromatin-modifying+activities+to+phosphorylated+histone+H2A+at+DNA+damage+sites.">Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites.</a> Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).</li><li>Chowdhury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[gamma]-H2AX+Dephosphorylation+by+Protein+Phosphatase+2A+Facilitates+DNA+Double-Strand+Break+Repair.">[gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair.</a> Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).</li><li>Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PP4+is+a+gamma+H2AX+phosphatase+required+for+recovery+from+the+DNA+damage+checkpoint.">PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint.</a> EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).</li><li>Altaf, M., Auger, A., Covic, M., C&#244;t&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connection+between+histone+H2A+variants+and+chromatin+remodeling+complexes.">Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes.</a> Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).</li><li>Kusch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+by+Tip60+Is+Required+for+Selective+Histone+Variant+Exchange+at+DNA+Lesions.">Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions.</a> Science. 306, 2084-2087 (2004).</li><li>Hurlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype.">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).</li><li>Dickey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+functional+roles+and+potential+applications.">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. , (2009).</li></ol>

暴露于电离辐射（γ射线），γH2AX灶形式迅速和疫源地号码后达到最大，在30-60 分钟之间2。因此，1小时后照射时间点反映初始DSB的形成。我们的实验中，我们已经用2 Gy的临床相关的辐射剂量。然而，该方法可用于辐射剂量高达4戈瑞检测初始DSB的形成;灶明显的重叠排除在较高剂量准确定量。可用于更高的辐射剂量辐照后的潜伏期较长时间，γH2AX灶因维修，造成量化的数字。通常情况下，4...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM)</td>
<td>Media</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17005042</td>
<td>Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE).</td>
</tr>
<tr>
<td>Lab Tek lI Chamber Slides (8-well)</td>
<td>Chamber Slides</td>
<td>Nunc Denmark</td>
<td>NUN154534</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips (22x50mm)</td>
<td>Coverslips</td>
<td>Menzel-Gl&auml;ser</td>
<td>CS2250100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A7906</td>
<td>BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17-517Q</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5% Trypsin-EDTA x10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15400-054</td>
<td>Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks.</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>158127</td>
<td>Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody</td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Millipore</td>
<td>16193</td>
<td>Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11029</td>
<td>Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>TOPRO3</td>
<td>DNA Stain</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T3605</td>
<td>DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser.</td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold</td>
<td>Anti-fade solution</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>Refractive index of 1.42 at 20&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Tissue Culture Flask, Vented Cap</td>
<td>Culture Flask</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353112</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Culture Dish (150x25mm)</td>
<td>Petridish</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coplin Jar, glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>1771-OG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Trough</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>V1991.99</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gammacell 1000 Elite Irradiator</td>
<td>Gamma Irradiator</td>
<td>Nordion International Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Metamorph</td>
<td>Software for Imaging analysis</td>
<td>Molecular Devices, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

quantification of &gamma;h2ax foci in response to ionising radiation

DNA双链断裂（DSB的），这是无论是内源性代谢过程或外源性​​诱导，是最关键的DNA损伤一个方面的生存和保持基因组完整性。早期反应的双链断裂感应是组蛋白H2A变体，H2AX的磷酸化，丝氨酸139残留，在高度保守的C -末端SQEY图案，形成γH2AX<sup&gt; 1</sup&gt;。 （ATR）的双链断裂感应后，H2AX的迅速磷酸化的磷脂，inosito 3 - 激酶（PIKK）蛋白家族，共济失调毛细血管扩张症（ATM）的突变，DNA -蛋白激酶催化亚基和ATM和RAD3相关<sup&gt; 2</sup&gt;。通常情况下，只有少数几个碱基对（BP）在DSB有牵连，但是，有显着的信号放大，信号和修复DNA损伤的染色质修饰的重要性。 H2AX的磷酸化介导主要由ATM染色邻近地区的利差，影响约0.03％的细胞总H2AX的每DSB<sup&gt; 2,3</sup&gt;。这相当于约2000 H2AX的分子跨越〜2 MBP染色质的地区，周围的DSB网站和离散γH2AX灶形成的结果，可以很容易地可视化和免疫荧光显微镜定量磷酸化<sup&gt; 2</sup&gt;。 γH2AX在DSB的损失反映了修复，但是，有一些争论什么定义完整的双链断裂的修复，它已经提出，重新加入DNA的两条链是足够的，然而，它也被建议重新恢复压实原有的染色质状态是必要的<sup&gt; 4-8</sup&gt;。 γH2AXdisappearence涉及至少部分，去磷酸化磷酸酶，磷酸酶2A和磷酸4C<sup&gt; 5,6</sup&gt;。此外，去除再分配涉及与H2A.Z组蛋白交流的γH2AX有牵连<sup&gt; 7,8</sup&gt;。重要的是，γH2AX灶的定量分析，导致了广泛的应用在医学和核研究。在这里，我们展示了初始γ辐照壁人角质形成细胞DNA的损伤γH2AX灶的检测和定量的评价最常用的免疫方法<sup&gt; 9</sup&gt;。

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Î³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation at JoVE.com

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA双链分子标记γH2AX形成条纹的量化已成为辐射生物学中的一个非常宝贵的工具。在这里，我们表现出免疫荧光法检测细胞对辐射的暴露后γH2AX灶的定量使用。

电离辐射的反应定量的γH2AX灶

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

quantification-of-h2ax-foci-in-response-to-ionising-radiation

Research

JoVE Journal

Biology

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

20.3K 次观看.  The Alfred Medical Research and Education Precinct. DNA双链分子标记γH2AX形成条纹的量化已成为辐射生物学中的一个非常宝贵的工具。在这里，我们表现出免疫荧光法检测细胞对辐射的暴露后γH2AX灶的定量使用。