Il sostegno della Australian Institute of Nuclear Science and Engineering è riconosciuto. TCK è stato il destinatario di premi AINSE. Lab Medicina epigenomic è supportata dal National Health and Medical Research Council of Australia (566.559). LM è supportato da Melbourne di ricerca (Università di Melbourne) e borse di studio integrative Biomedical Imaging CRC. Il supporto di Monash Micro Imaging (Dr. Stephen Cody e Iska Carmichael) è stata preziosa per questo lavoro.

<html> Preparazione delle cellule <ol><li> Cheratinociti umani (FEP-1811) sono state coltivate in cheratinociti-siero Media gratuito (K-SFM; Invitrogen) integrato con il fattore di crescita epidermico, estratto di ipofisi bovina e 20 mg / ml di gentamicina, a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Una sospensione singola cella è stata preparata da staccare con tripsina-EDTA (0,05% v / v) </li><li> Le cellule sono state seminate a 8-Tek ben Lab II diapositive microchamber (10.000 cellule / pozzetto) e le diapositive sono state incubate per 3 giorni a 37 ° C e 5% di CO 2. </li></ol> Irradiazione <ol><li> Le cellule sono state irradiate su ghiaccio con 2 Gy utilizzando una sorgente di 137 Cs (Gammacell 1000 Elite irradiatore; Nordion internazionale, ON, Canada, 20,6 secondi / Gy) </li><li> Controllo irradiato e 2 Gy cellule irradiate sono state incubate per 1 ora a 37 ° C e 5% di CO 2. </li></ol> Immunofluorescenza <ol><li> Media è stata una soffiata e le cellule sono state lavate con 300μl di PBS (w / o Ca 2 + o Mg 2 +) per bene e sono stati ruotati su un mixer orbitale per 5 minuti. </li><li> Il buffer è stata una soffiata e 100μl di preparati al momento 4% (v / v) è stato aggiunto paraformaldeide in ciascun pozzetto e diapositive sono state incubate a temperatura ambiente per 10 minuti. Tutte le incubazioni sono state eseguite in una vasca colorazione umidificata </li><li> Le cellule sono state poi lavate con PBS (w / o Ca 2 + o Mg 2 +). I vetrini sono stati posti in una vaschetta Coplin e ruotata su un mixer orbitale per 5 minuti. Questa fase di lavaggio è stata ripetuta altre due volte. </li><li> Il buffer è stata una soffiata e l&#39;eccesso di PBS è stato gentilmente cancellato. </li><li> Le cellule sono state permeabilizzate con 100ml Triton X-100 (0,1% v / v) per bene e una incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Le cellule sono state lavate con PBS (w / o Ca 2 + o Mg 2 +), come descritto nei punti 3 e 4 di cui sopra. </li><li> Non specifico legame con le proteine ​​è stato bloccato con 100 ml di BSA (1% v / v) per bene e 20 minuti di incubazione a temperatura ambiente. </li><li> L&#39;eccesso di BSA è stata una soffiata e 100μl di mouse primario monoclonale anti-fosfo-istone H2AX anticorpi (diluito 1:500 in 1% BSA, Millipore), è stato aggiunto in ciascun pozzetto di una incubazione 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Le cellule sono state lavate con PBS (w / o Ca 2 + o Mg 2 +), come descritto nei punti 3 e 4 di cui sopra e incubato con 100μl di anticorpo secondario (Alexa Fluor 488 di capra anti-IgG di topo diluito 1:500 in BSA 1% ; Invitrogen) per bene per 45 minuti a temperatura ambiente al buio. (Anticorpo diluito è stato tenuto all&#39;oscuro durante tutta la procedura) </li><li> Le cellule sono state lavate con PBS (w / o Ca 2 + o Mg 2 +), come descritto nei punti 3 e 4 di cui sopra. Tuttavia, l&#39;esposizione alla luce è stato minimizzato usando pellicola. </li><li> Di contrasto nucleare è stata eseguita con 100ml TOPRO3 (diluito 1:500; Invitrogen) per bene e una incubazione 10 minuti a temperatura ambiente </li><li> Le cellule sono state lavate con PBS (w / o Ca 2 + o Mg 2 +) come descritto al punto 10. </li><li> Le camere sono state accuratamente rimosse dalle guide di scorrimento, l&#39;umidità in eccesso è stato cancellato e le diapositive sono stati lasciati asciugare all&#39;aria. </li><li> Una goccia di prolungare ORO anti-sbiadimento soluzione (Invitrogen) è stato aggiunto per bene e le diapositive sono state montate (22x50 millimetri coprioggetto) e il liquido in eccesso lungo i bordi di scorrimento è stata cancellata. </li><li> I vetrini sono stati tenuti al buio per altri 30 minuti a temperatura ambiente prima di sigillare con smalto. </li><li> I vetrini sono stati conservati durante la notte a 4 ° C al buio prima dell&#39;analisi. </li></ol> Microscopia / Analisi <ol><li> Meta confocale Zeiss LSM510 Microscpe utilizzato per acquisire immagini utilizzando la GFP standard (per γH2AX - Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG) e laser rosso lontano (per TOPRO-3). Tipicamente, un olio 63 x lente ad immersione obiettivo è utilizzato. Le immagini sono acquisite in una serie Z tracciato con dimensione del passo di 0,5 micron. Un passo di 0,5 micron è stata scelta per minimizzare la perdita di focolai presenti nei diversi piani nei nuclei. Durante l&#39;analisi, i piani individuali sono deconvoluted e sovrapposti per produrre una immagine proiettata al massimo per ridurre al minimo la sovrapposizione di focolai (Top-hat filtro applicato). </li><li> Metamorph (Molecular Devices, USA) è stato utilizzato per analizzare il numero di focolai. Il programma quantitates il numero di focolai in ogni cella dopo la soglia è stata applicata per escludere sfondo. Le informazioni vengono registrate in un foglio di calcolo Microsoft Excel per ulteriori analisi. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Visualizzazione di immunofluorescenza γH2AX focolai (verde) non trattati in cheratinociti umani e in cellule irradiate con 2 Gy e incubate per circa 1 ora a 37 ° C, 5% di CO 2. Il DNA è stato macchiato con TOPRO-3 (blu). Immagini sono state acquisite utilizzando un Zeiss LSM 510 Meta microscopio confocale. Bar = 10 micron. e_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Visualizzazione di immunofluorescenza γH2AX focolai (verde) in cheratinociti umani e in cellule irradiate con 2 Gy e incubate per circa 1 ora a 37 ° C, 5% di CO 2. Immagini sono state acquisite utilizzando un Zeiss LSM 510 Meta microscopio confocale utilizzando 0,5 micron Z-sezionamento (1-9) per garantire che tutti focolai sono stati acquisiti. Le immagini è stata poi impilati per la quantificazione utilizzando Metamorph. Il DNA è stato macchiato con TOPRO-3 (blu). Il γH2AX impilati e le immagini blu erano accatastati per la visualizzazione. Bar = 10 micron.

<ol>
	<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo.">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li><li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma+H2AX+and+cancer.">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li><li>Savic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Dynamic+[gamma]-H2AX+Domains+along+Broken+DNA+Strands+Is+Distinctly+Regulated+by+ATM+and+MDC1+and+Dependent+upon+H2AX+Densities+in+Chromatin.">Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin.</a> Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).</li><li>Downs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+chromatin-modifying+activities+to+phosphorylated+histone+H2A+at+DNA+damage+sites.">Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites.</a> Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).</li><li>Chowdhury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[gamma]-H2AX+Dephosphorylation+by+Protein+Phosphatase+2A+Facilitates+DNA+Double-Strand+Break+Repair.">[gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair.</a> Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).</li><li>Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PP4+is+a+gamma+H2AX+phosphatase+required+for+recovery+from+the+DNA+damage+checkpoint.">PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint.</a> EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).</li><li>Altaf, M., Auger, A., Covic, M., C&#244;t&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connection+between+histone+H2A+variants+and+chromatin+remodeling+complexes.">Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes.</a> Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).</li><li>Kusch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+by+Tip60+Is+Required+for+Selective+Histone+Variant+Exchange+at+DNA+Lesions.">Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions.</a> Science. 306, 2084-2087 (2004).</li><li>Hurlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype.">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).</li><li>Dickey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+functional+roles+and+potential+applications.">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. , (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In seguito all&#39;esposizione a radiazioni ionizzanti (raggi γ), γH2AX forma foci rapidamente e numeri focolai raggiungono un massimo tra 30-60 minuti 2. Pertanto, il nostro 1 ora dalla irradiazione punto di tempo riflette la formazione iniziale DSB. Abbiamo usato la dose di radiazioni clinicamente rilevante di 2 Gy per il nostro esperimento. Tuttavia, il metodo può essere utilizzato per dosi di radiazioni fino a 4 Gy per il rilevamento di formazione iniziale DSB; sovrapposizione significativa di focolai ...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM)</td>
<td>Media</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17005042</td>
<td>Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE).</td>
</tr>
<tr>
<td>Lab Tek lI Chamber Slides (8-well)</td>
<td>Chamber Slides</td>
<td>Nunc Denmark</td>
<td>NUN154534</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips (22x50mm)</td>
<td>Coverslips</td>
<td>Menzel-Gl&auml;ser</td>
<td>CS2250100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A7906</td>
<td>BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17-517Q</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5% Trypsin-EDTA x10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15400-054</td>
<td>Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks.</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>158127</td>
<td>Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody</td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Millipore</td>
<td>16193</td>
<td>Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11029</td>
<td>Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>TOPRO3</td>
<td>DNA Stain</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T3605</td>
<td>DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser.</td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold</td>
<td>Anti-fade solution</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>Refractive index of 1.42 at 20&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Tissue Culture Flask, Vented Cap</td>
<td>Culture Flask</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353112</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Culture Dish (150x25mm)</td>
<td>Petridish</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coplin Jar, glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>1771-OG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Trough</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>V1991.99</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gammacell 1000 Elite Irradiator</td>
<td>Gamma Irradiator</td>
<td>Nordion International Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Metamorph</td>
<td>Software for Imaging analysis</td>
<td>Molecular Devices, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

quantification of &gamma;h2ax foci in response to ionising radiation

DNA a doppio filamento (DSB), che sono indotti da processi metabolici sia endogena o da fonti esogene, sono una delle lesioni del DNA più critici in termini di sopravvivenza e la conservazione dell&#39;integrità del genoma. Una risposta presto per l&#39;induzione di DSB è la fosforilazione della variante dell&#39;istone H2A, H2AX, alla serina-139 residui, altamente conservati nel C-terminale motivo SQEY, formando γH2AX<sup&gt; 1</sup&gt;. Dopo l&#39;induzione di DSB, H2AX è rapidamente fosforilata dalla fosfatidil-inosito 3-chinasi (Pikk) famiglia di proteine, atassia telangiectasia mutati (ATM), DNA-proteina chinasi subunità catalitiche e ATM e RAD3-correlate (ATR)<sup&gt; 2</sup&gt;. Tipicamente, solo poche paia di basi (bp) sono implicati in un DSB, tuttavia, vi è amplificazione del segnale significativo, data l&#39;importanza delle modificazioni della cromatina nella segnalazione del danno al DNA e riparazione. Fosforilazione di H2AX mediato principalmente da ATM si diffonde in aree adiacenti della cromatina, che colpisce circa lo 0,03% del totale dei cellulari H2AX per DSB<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Questo corrisponde alla fosforilazione di circa 2000 molecole H2AX spanning ~ 2 regioni Mbp di cromatina che circonda il sito della DSB e provoca la formazione di discreto γH2AX focolai che possono essere facilmente visualizzati e quantificato mediante microscopia di immunofluorescenza<sup&gt; 2</sup&gt;. La perdita di γH2AX a DSB riflette la riparazione, tuttavia, vi è una certa polemica su ciò che definisce la riparazione completa dei DSB, è stato proposto che la ricongiunzione dei due filamenti di DNA è sufficiente però, è stato anche suggerito che la reintegrazione del stato originale di compattazione della cromatina è necessario<sup&gt; 4-8</sup&gt;. La scomparsa di γH2AX coinvolge almeno in parte, defosforilazione da fosfatasi, fosfatasi 2A e fosfatasi 4C<sup&gt; 5,6</sup&gt;. Inoltre, la rimozione di γH2AX di redistribuzione che coinvolgono lo scambio degli istoni con H2A.Z è stata implicata<sup&gt; 7,8</sup&gt;. È importante sottolineare che l&#39;analisi quantitativa della γH2AX foci ha portato ad una vasta gamma di applicazioni nella ricerca medica e nucleare. Qui, dimostriamo il metodo più comunemente utilizzato immunofluorescenza per la valutazione del danno al DNA iniziale di rilevazione e quantificazione di γH2AX focolai nei cheratinociti aderente γ-irradiati umano<sup&gt; 9</sup&gt;.

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Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

La quantificazione di DNA a doppio filamento striature formazione γH2AX utilizzando come marcatore molecolare è diventata uno strumento prezioso nel campo della biologia delle radiazioni. Qui mostriamo l&#39;utilizzo di un test di immunofluorescenza per la quantificazione della γH2AX focolai dopo l&#39;esposizione delle cellule alle radiazioni.

Quantificazione dei γH2AX Foci in risposta alle radiazioni ionizzanti

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

quantification-of-h2ax-foci-in-response-to-ionising-radiation

Research

JoVE Journal

Biology

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

20.3K Views.  The Alfred Medical Research and Education Precinct. La quantificazione di DNA a doppio filamento striature formazione γH2AX utilizzando come marcatore molecolare è diventata uno strumento prezioso nel campo della biologia delle radiazioni. Qui mostriamo l'utilizzo di un test di immunofluorescenza per la quantificazione della γH2AX focolai dopo l'esposizione delle cellule alle radiazioni.