O apoio do Instituto Australiano de Ciência Nuclear e Engenharia é reconhecido. TCK foi o ganhador de prêmios AINSE. Lab Medicine epigenômico é suportado pelo National Health and Medical Research Council of Australia (566.559). LM é apoiada por Melbourne Research (University of Melbourne) e Biomedical Imaging bolsas complementares CRC. O apoio de Monash Micro Imaging (Drs. Stephen Cody e ISKA Carmichael) foi inestimável para este trabalho.

<html> Preparação de células <ol><li> Queratinócitos humanos (FEP-1811) foram cultivadas em queratinócitos-Serum Médio gratuito (K-SFM; Invitrogen) suplementado com fator de crescimento epidérmico, o extrato de hipófise de bovinos e 20 mcg / ml de gentamicina, a 37 ° CO C e 5% 2. </li><li> A suspensão única célula foi preparado por destacando com tripsina-EDTA (0,05% v / v) </li><li> Células foram semeadas em oito bem-Lab Tek slides II MicroChamber (10.000 células / poço) e as lâminas foram incubadas por 3 dias a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol> Irradiação <ol><li> As células foram irradiadas no gelo com 2 Gy usando uma fonte de 137 Cs (Gammacell irradiador 1000 Elite; Nordion International, ON, Canadá, 20,6 segundos / Gy) </li><li> Controle não irradiado e 2 Gy células irradiadas foram incubadas por 1 hora a 37 ° C e 5% CO 2. </li></ol> Imunofluorescência <ol><li> Mídia foi derrubado fora e as células foram lavadas com 300 ul de PBS (w / o Ca 2 + ou Mg 2 +) por poço e foram rodados em um misturador orbital por 5 minutos. </li><li> O buffer foi derrubado fora e 100μl de recém-preparados 4% (v / v) paraformaldeído foi adicionado a cada poço e as lâminas foram incubadas em temperatura ambiente por 10 minutos. Todas as incubações foram realizadas em um cocho de coloração umidificado </li><li> As células foram então lavadas com PBS (w / o Ca 2 + ou Mg 2 +). Lâminas foram colocadas em um frasco Coplin e rodado em um misturador orbital por 5 minutos. Esta etapa de lavagem foi repetido mais duas vezes. </li><li> O buffer foi derrubado fora e excesso de PBS foi gentilmente apagados. </li><li> Células foram permeabilizadas com 100ml Triton X-100 (0,1% v / v) por poço e uma incubação de 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Células foram lavadas com PBS (w / o Ca 2 + ou Mg 2 +), conforme descrito nos passos 3 e 4 acima. </li><li> Ligação não específica de proteínas foi bloqueada com 100 ml de BSA (1% v / v) por poço e 20 minutos de incubação à temperatura ambiente. </li><li> BSA excesso foi derrubado fora e 100μl do ensino primário monoclonal anti-anticorpo fosfo-histona H2AX (diluído 1:500 em BSA 1%; Millipore), foi adicionado a cada poço para a incubação de uma hora à temperatura ambiente. </li><li> Células foram lavadas com PBS (w / o Ca 2 + ou Mg 2 +) conforme descrito nas etapas 3 e 4 acima e incubadas com 100μl de anticorpo secundário (Alexa Fluor 488 cabra anti-camundongo IgG diluído 1:500 em BSA 1% ; Invitrogen) por poço por 45 minutos em temperatura ambiente no escuro. (Anticorpo diluído foi mantido no escuro durante todo o procedimento) </li><li> Células foram lavadas com PBS (w / o Ca 2 + ou Mg 2 +), conforme descrito nos passos 3 e 4 acima. No entanto, a exposição à luz foi minimizado usando papel alumínio. </li><li> Contracoloração nuclear foi realizado com 100 ml TOPRO3 (diluído 1:500; Invitrogen) por poço e incubação de 10 minutos em temperatura ambiente </li><li> Células foram lavadas com PBS (w / o Ca 2 + ou Mg 2 +) como descrito na etapa 10 acima. </li><li> As câmaras foram cuidadosamente removido os slides, o excesso de umidade foi apagado e as lâminas foram secas ao ar. </li><li> Uma gota de solução anti Prolongar-fade GOLD (Invitrogen) foi adicionado por poço e lâminas foram montadas (22x50 milímetros lamela) e qualquer excesso de líquido ao redor das bordas do slide foi apagado. </li><li> As lâminas foram mantidas no escuro por mais 30 minutos em temperatura ambiente antes de selar com unha polonês. </li><li> As lâminas foram armazenadas durante a noite a 4 ° C no escuro antes da análise. </li></ol> Microscopia / Análise <ol><li> Zeiss LSM510 Meta Confocal Microscpe utilizados para adquirir imagens utilizando a GFP padrão (para γH2AX - Alexa Fluor 488 cabra anti-IgG de rato) e lasers vermelho distante (para TOPRO-3). Tipicamente, um óleo de 63 x lente objetiva de imersão é usado. Imagens são adquiridas em um padrão Z-série com um tamanho de passo de 0,5 micron. A tamanho do passo de 0,5 m foi escolhida para minimizar a perda de apresentar focos em diferentes planos no núcleo. Durante a análise, planos individuais são deconvoluídos e empilhados para produzir uma imagem máxima projetada para minimizar a sobreposição de focos (Top hat-filtro aplicado). </li><li> Metamorph (dispositivos Molecular, EUA) foi utilizado para analisar o número de focos. O programa quantitates o número de focos em cada célula após o limite tem sido aplicado para excluir fundo. As informações são registradas em uma planilha do Microsoft Excel para análise posterior. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Visualização de imunofluorescência γH2AX focos (verde) em queratinócitos humanos não tratados e em células irradiadas com 2 Gy e incubados por uma hora mais 1 a 37 ° C, 5% CO 2. O DNA foi corado com TOPRO-3 (azul). Imagens foram adquiridas utilizando um microscópio Zeiss LSM 510 Meta Confocal. Bar = 10 mM. e_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Visualização de imunofluorescência γH2AX focos (verde) em queratinócitos humanos e em células irradiadas com 2 Gy e incubados por uma hora mais 1 a 37 ° C, 5% CO 2. Imagens foram adquiridas utilizando um microscópio Zeiss LSM 510 Meta Confocal utilizando 0,5 m de corte Z-(1-9) para garantir que todos os focos foram adquiridas. As imagens foi então empilhados para quantificação usando Metamorph. O DNA foi corado com TOPRO-3 (azul). O γH2AX empilhados e imagens azuis foram empilhadas para visualização. Bar = 10 mM.

<ol>
	<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo.">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li><li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma+H2AX+and+cancer.">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li><li>Savic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Dynamic+[gamma]-H2AX+Domains+along+Broken+DNA+Strands+Is+Distinctly+Regulated+by+ATM+and+MDC1+and+Dependent+upon+H2AX+Densities+in+Chromatin.">Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin.</a> Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).</li><li>Downs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+chromatin-modifying+activities+to+phosphorylated+histone+H2A+at+DNA+damage+sites.">Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites.</a> Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).</li><li>Chowdhury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[gamma]-H2AX+Dephosphorylation+by+Protein+Phosphatase+2A+Facilitates+DNA+Double-Strand+Break+Repair.">[gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair.</a> Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).</li><li>Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PP4+is+a+gamma+H2AX+phosphatase+required+for+recovery+from+the+DNA+damage+checkpoint.">PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint.</a> EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).</li><li>Altaf, M., Auger, A., Covic, M., C&#244;t&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connection+between+histone+H2A+variants+and+chromatin+remodeling+complexes.">Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes.</a> Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).</li><li>Kusch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+by+Tip60+Is+Required+for+Selective+Histone+Variant+Exchange+at+DNA+Lesions.">Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions.</a> Science. 306, 2084-2087 (2004).</li><li>Hurlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype.">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).</li><li>Dickey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+functional+roles+and+potential+applications.">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. , (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Após a exposição à radiação ionizante (raios-γ), forma γH2AX focos rapidamente e os números de focos atingir um máximo entre 30-60 minutos 2. Portanto, nosso ponto de uma hora o tempo pós-irradiação reflete DSB formação inicial. Temos usado a dose de radiação clinicamente relevantes de 2 Gy para nosso experimento. No entanto, o método pode ser usado para as doses de radiação até 4 Gy para a detecção da formação inicial DSB; sobreposição significativa de focos impede a quantificaçã...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM)</td>
<td>Media</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17005042</td>
<td>Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE).</td>
</tr>
<tr>
<td>Lab Tek lI Chamber Slides (8-well)</td>
<td>Chamber Slides</td>
<td>Nunc Denmark</td>
<td>NUN154534</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips (22x50mm)</td>
<td>Coverslips</td>
<td>Menzel-Gl&auml;ser</td>
<td>CS2250100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A7906</td>
<td>BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17-517Q</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5% Trypsin-EDTA x10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15400-054</td>
<td>Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks.</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>158127</td>
<td>Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody</td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Millipore</td>
<td>16193</td>
<td>Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11029</td>
<td>Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>TOPRO3</td>
<td>DNA Stain</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T3605</td>
<td>DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser.</td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold</td>
<td>Anti-fade solution</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>Refractive index of 1.42 at 20&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Tissue Culture Flask, Vented Cap</td>
<td>Culture Flask</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353112</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Culture Dish (150x25mm)</td>
<td>Petridish</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coplin Jar, glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>1771-OG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Trough</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>V1991.99</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gammacell 1000 Elite Irradiator</td>
<td>Gamma Irradiator</td>
<td>Nordion International Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Metamorph</td>
<td>Software for Imaging analysis</td>
<td>Molecular Devices, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

quantification of &gamma;h2ax foci in response to ionising radiation

DNA dupla fita-breaks (LAP), que são induzidos por qualquer processos metabólicos endógenos ou por fontes exógenas, são uma das lesões DNA mais críticos com relação à sobrevivência e preservação da integridade genômica. Uma resposta rápida à indução de LAP é fosforilação da variante histona H2A, H2AX, na serina-139 resíduos, na altamente conservada motivo SQEY C-terminal, formando γH2AX<sup&gt; 1</sup&gt;. Após a indução de LAP, H2AX é rapidamente fosforilada pela fosfatidil-inosito 3-quinase (Pikk) família de proteínas, ataxia telangiectasia mutantes (ATM), subunidade proteína-quinase DNA catalítico e ATM e Rad3 relacionados (ATR)<sup&gt; 2</sup&gt;. Tipicamente, apenas alguns pares-base (pb) estão implicados em uma DSB, no entanto, não há amplificação de sinal significativo, dada a importância das modificações da cromatina na sinalização de danos ao DNA e reparo. Fosforilação de H2AX mediada predominantemente por ATM espalha para áreas adjacentes da cromatina, afetando aproximadamente 0,03% do total celulares H2AX por DSB<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Isso corresponde a fosforilação de aproximadamente 2000 moléculas H2AX abrangendo ~ 2 Mbp regiões da cromatina em torno do local do DSB e resulta na formação de discretos focos γH2AX que podem ser facilmente visualizados e quantificados por microscopia de imunofluorescência<sup&gt; 2</sup&gt;. A perda de γH2AX no DSB reflete reparação, no entanto, há alguma controvérsia quanto ao que define o reparo completo da LAP, tem sido proposto que a recombinação de dois filamentos de DNA é adequada no entanto, também tem sido sugerido que restabelecimento do estado de compactação da cromatina originais é necessário<sup&gt; 08/04</sup&gt;. O desaparecimento de γH2AX envolve pelo menos em parte, pela desfosforilação fosfatases, fosfatase e fosfatase 2A 4C<sup&gt; 5,6</sup&gt;. Além disso, a remoção de γH2AX pela redistribuição envolvendo troca de histonas com H2A.Z tem sido implicado<sup&gt; 7,8</sup&gt;. Importante, a análise quantitativa de γH2AX focos levou a uma ampla gama de aplicações na pesquisa médica e nuclear. Aqui, nós demonstrar o método mais comumente usado de imunofluorescência para avaliação de danos no DNA inicial de detecção e quantificação de γH2AX focos em γ-irradiados aderente queratinócitos humanos<sup&gt; 9</sup&gt;.

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Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantificação de DNA dupla fita-estrias usando formação γH2AX como um marcador molecular tornou-se uma ferramenta valiosa na biologia da radiação. Aqui mostramos o uso de um teste de imunofluorescência para a quantificação dos focos γH2AX após a exposição das células à radiação.

Quantificação de γH2AX Focos em resposta à radiação ionizante

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

quantification-of-h2ax-foci-in-response-to-ionising-radiation

Research

JoVE Journal

Biology

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

20.3K visualizações.  The Alfred Medical Research and Education Precinct. Quantificação de DNA dupla fita-estrias usando formação γH2AX como um marcador molecular tornou-se uma ferramenta valiosa na biologia da radiação. Aqui mostramos o uso de um teste de imunofluorescência para a quantificação dos focos γH2AX após a exposição das células à radiação.