원자력 과학 및 공학의 호주 연구소의 지원 인정받고 있습니다. TCK는 AINSE 보너스받는했다. Epigenomic 의학 연구소는 국민 건강과 호주의 의료 연구위원회 (566559)에 의해 지원됩니다. LM은 멜버른 연구 (멜버른 대학)와 바이오 메디컬 이미징 CRC의 보조 장학금으로 지원됩니다. 모나 마이크로 이미징의 지원 (DRS 스티븐 코디 Iśka 카마 이클)이 작품 소중한했다.

<html> 셀 준비 <ol><li> 37, 표피 성장 인자, 소 뇌하수체 추출물 및 20 μg / ML gentamicin과 보충 ° C와 5% CO 2; 인간 keratinocytes (FEP - 1811)은 (Invitrogen K - SFM) Keratinocyte - 세럼 무료 매체 성장했다. </li><li> 단일 세포 현탁액은 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.05 % V / V)로 분리하여 준비했습니다 </li><li> 전지는 8 잘 연구실 테크 II microchamber 슬라이드에서 씨앗을 품고 있었다 (10,000 셀 / 음)과 슬라이드가 37 ° C와 5 % CO 2에서 3 일간 incubated되었습니다. </li></ol> 조사 <ol><li> 세포는 137 고사 소스를 (; Nordion 국제, ON, 캐나다, 20.6 초 / 쥐 Gammacell 1000 엘리트 irradiator)를 사용하여이 쥐와 함께 얼음에 조사되었다 </li><li> Unirradiated 제어 및 2 쥐 조사 전지는 37 ° C와 5% CO 2에서 1 시간 동안 incubated되었습니다. </li></ol> Immunofluorescence 염색법 <ol><li> 미디어는 밀고되어 세포가 잘 당 PBS의 300μl (W / O 칼슘 2 + 또는 MG 2 +)로 씻어 5 분 동안 궤도 믹서에 회전 하였다. </li><li> 버퍼는 밀고와 paraformaldehyde 각 잘 추가되었고 슬라이드가 10 분 동안 상온에서 incubated 있었다 신선한 4퍼센트 (V / V)의 100μl했습니다. 모든 incubations은 humidified 얼룩 트러프에서 수행되었다 </li><li> 전지는 다음 PBS (W / O 칼슘 2 + 또는 MG 2 +)로 세탁했다. 슬라이드가 5 분 궤도 믹서에 코플린 병 및 회전에 배치했다. 이 세척 단계는 더 이상 두 번 반복되었다. </li><li> 버퍼 밀고했고 초과 PBS는 부드럽게 blotted되었습니다. </li><li> 세포 100ml 트리톤 X - 100 (0.1 % V / V) 당 잘하고 실온에서 10 분 배양을 사용하여 permeabilized되었습니다. </li><li> 세포 PBS로 씻은했다 (W / O 칼슘 2 + 또는 MG 2 +)와 같은 3 단계 이상 4 설명했다. </li><li> 비 - 특정 단백질 바인딩은 상온에서 잘하고 이십분 부화 당 BSA의 100ml (1 % V / V)로 차단되었습니다. </li><li> 초과 BSA는 밀고되었으며 기본 마우스 단클론 항 phospho - H2AX 히스톤 항체 (1 % BSA에 1:500 희석, Millipore)의 100μl는 상온에서 1 시간 배양 각 잘 추가되었습니다. </li><li> 세포 PBS로 씻은했다 (W / O 칼슘 2 + 또는 MG 2 +) 위의 3 단계와 4 단계에서 설명한 및 보조 항체의 100μl (알렉사 플루어 488 염소 방지 마우스 IgG와 incubated 1 % BSA에 1:500 희석 ; Invitrogen) 어둠 속에서 실온에서 45 분간 잘마다. (희석 항체가 절차를 통해 어둠에 보관되었습니다) </li><li> 세포 PBS로 씻은했다 (W / O 칼슘 2 + 또는 MG 2 +)와 같은 3 단계 이상 4 설명했다. 그러나, 빛에 노출 호일을 사용하여 최소화했다. </li><li> 잘 따라와 실온에서 10 분 배양, 핵 counterstaining은 100ml TOPRO3 (Invitrogen 1:500 희석)으로 수행되었습니다 </li><li> 전지는 PBS (W / O 칼슘 2 + 또는 MG 2 +)가로 씻은 것처럼 위의 단계 10 설명했다. </li><li> 챔버 스는 조심스럽게 슬라이드에서 제거되었습니다, 과잉 수분이 blotted되었고 슬라이드는 건조 공기를 허용되었다. </li><li> GOLD 방지 퇴색 솔루션 (Invitrogen)를 연장 중 하나는 방울마다 잘 추가되었습니다과 슬라이드가 탑재되었다 (22x50 mm coverslip) 및 슬라이드의 가장자리 주위에 초과 액체는 bl​​otted되었습니다. </li><li> 슬라이드는 매니큐어로 밀봉하기 전에 실온에서 추가로 30 분 어둠에 보관했다. </li><li> 슬라이드 4에서 하룻밤 저장된 ° C 분석하기 전에 어둠 속이라서. </li></ol> 현미경 / 분석 <ol><li> (- 알렉사 플루어 488 염소 안티 - 마우스 IgG γH2AX)과 멀리 붉은 레이저 (TOPRO - 3) 자이스 혈구 LSM510 메타 공촛점 Microscpe은 표준 GFP를 사용하여 이미지를 획득하는 데 사용됩니다. 일반적으로 63 X 오일 침지 객관적인 렌즈가 사용됩니다. 이미지는 0.5 μm의의 스텝 크기와 Z - 시리즈 패턴에 인수됩니다. 0.5 μm의의 단계 크기는 핵에서 다른 비행기에 foci 선물의 손실을 최소화하기 위해 선정되었습니다. 분석하는 동안, 개인 비행기는 deconvoluted 및 foci의 중복 (톱 - 모자 필터 적용)를 최소화하기 위해 최대 예상 이미지를 생산하기 위해 정렬됩니다. </li><li> Metamorph (분자 디바이스, 미국)는 foci의 개수를 분석하는 데 사용되었다. 임계값이 배경을 제외 적용된 후이 프로그램은 각 셀에 foci의 수를 quantitates. 이 정보는 추가 분석을 위해 Microsoft Excel 스프레드 시트에 기록됩니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 치료 인간 keratinocytes에서 2 쥐와 조사 37에서 추가로 1 시간 동안 incubated 세포 γH2AX foci (녹색)의 Immunofluorescence 시각화 ° C 5 % CO 2. DNA는 TOPRO - 3 (블루) 물들일했습니다. 이미지 자이스 혈구 LSM 510 메타 공촛점 현미경을 사용하여 인수했다. 바 = 10 μm의. e_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 인간 keratinocytes에서 2 쥐와 조사 37에서 추가로 1 시간 동안 incubated 세포 γH2AX foci (녹색)의 Immunofluorescence 시각화 ° C 5 % CO 2. 이미지는 모든 foci가 인수되었습니다 보장하기 위해 0.5 μm의 Z - sectioning (1-9)를 사용하여 자이스 혈구 LSM 510 메타 공촛점 현미경을 사용하여 인수했다. 이미지는 다음 Metamorph를 사용하여 quantitation 위해 쌓아했다. DNA는 TOPRO - 3 (블루) 물들일했습니다. 스택 γH2AX 및 파랑 이미지는 시각화를 위해 쌓아되었습니다. 바 = 10 μm의.

<ol>
	<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo.">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li><li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma+H2AX+and+cancer.">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li><li>Savic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Dynamic+[gamma]-H2AX+Domains+along+Broken+DNA+Strands+Is+Distinctly+Regulated+by+ATM+and+MDC1+and+Dependent+upon+H2AX+Densities+in+Chromatin.">Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin.</a> Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).</li><li>Downs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+chromatin-modifying+activities+to+phosphorylated+histone+H2A+at+DNA+damage+sites.">Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites.</a> Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).</li><li>Chowdhury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[gamma]-H2AX+Dephosphorylation+by+Protein+Phosphatase+2A+Facilitates+DNA+Double-Strand+Break+Repair.">[gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair.</a> Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).</li><li>Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PP4+is+a+gamma+H2AX+phosphatase+required+for+recovery+from+the+DNA+damage+checkpoint.">PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint.</a> EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).</li><li>Altaf, M., Auger, A., Covic, M., C&#244;t&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connection+between+histone+H2A+variants+and+chromatin+remodeling+complexes.">Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes.</a> Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).</li><li>Kusch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+by+Tip60+Is+Required+for+Selective+Histone+Variant+Exchange+at+DNA+Lesions.">Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions.</a> Science. 306, 2084-2087 (2004).</li><li>Hurlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype.">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).</li><li>Dickey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+functional+roles+and+potential+applications.">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. , (2009).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이온화 방사선 (γ 선), 빠르게 γH2AX foci 양식 및 foci 번호를 다음 노출 30~60분 2 사이 최대에 도달. 따라서, 우리 1시간 후 방사선 시점은 초기 DSB 형성을 반영합니다. 우리는 우리의 실험 2 쥐의 임상 관련 방사선 선량을 사용했습니다. 그러나 방법은 초기 DSB 형성의 검출 4 쥐 위해 방사선 접종에 사용할 수있는, foci 상당한 중복 높은 복용에 정확한 quantitation 걸로. γH2AX foci가 같지는 숫자 결?...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM)</td>
<td>Media</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17005042</td>
<td>Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE).</td>
</tr>
<tr>
<td>Lab Tek lI Chamber Slides (8-well)</td>
<td>Chamber Slides</td>
<td>Nunc Denmark</td>
<td>NUN154534</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips (22x50mm)</td>
<td>Coverslips</td>
<td>Menzel-Gl&auml;ser</td>
<td>CS2250100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A7906</td>
<td>BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17-517Q</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5% Trypsin-EDTA x10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15400-054</td>
<td>Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks.</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>158127</td>
<td>Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody</td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Millipore</td>
<td>16193</td>
<td>Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11029</td>
<td>Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>TOPRO3</td>
<td>DNA Stain</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T3605</td>
<td>DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser.</td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold</td>
<td>Anti-fade solution</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>Refractive index of 1.42 at 20&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Tissue Culture Flask, Vented Cap</td>
<td>Culture Flask</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353112</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Culture Dish (150x25mm)</td>
<td>Petridish</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coplin Jar, glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>1771-OG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Trough</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>V1991.99</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gammacell 1000 Elite Irradiator</td>
<td>Gamma Irradiator</td>
<td>Nordion International Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Metamorph</td>
<td>Software for Imaging analysis</td>
<td>Molecular Devices, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

quantification of &gamma;h2ax foci in response to ionising radiation

내생 신진 대사 과정 중 또는 외인성 소스에 의해 유도된 아르 DNA 이중 가닥 나누기 (DSBs)는, 게놈 무결성 생존과 보존에 관한 가장 중요한 DNA의 병변 중 하나입니다. DSBs의 유도에 초기 반응은 γH2AX을 형성, 높​​은 보존 C - 터미널 SQEY의 모티브에서 세린 - 139 잔여물에서 H2A 히스톤 변형, H2AX의 인산화입니다<sup&gt; 1</sup&gt;. DSBs의 유도에 따라, H2AX는 빠르게 phosphatidyl - inosito 3 키나제 (PIKK) 단백질의 가족 운동 실조증 telangiectasia 변이된 (ATM), DNA - 단백질 키나제 촉매 subunit와 ATM과 RAD3 관련하여 phosphorylated입니다 (ATR)<sup&gt; 2</sup&gt;. 일반적으로 단지 몇베이스 쌍 (BP)은 DNA 손상 신호 및 수리에 염색질 수정의 중요성을 감안할 때, 그러나, 중요한 신호 증폭이, DSB에 연루됩니다. H2AX의 인산화는 DSB 당 전체 세포 H2AX의 약 0.03 %에 영향을 미치는, 염색질의 인접 지역에 ATM 확산에 의해 주로 중재<sup&gt; 2,3</sup&gt;. 이것은 쉽게 시각과 immunofluorescence 현미경에 의해 quantitated 수있는 DSB와 이산 γH2AX foci 형성의 결과의 사이트를 둘러싼 염색질의 ~ 2 MBP 영역을 걸쳐 약 2000 H2AX 분자의 인산화에 해당하는<sup&gt; 2</sup&gt;. DSB에 γH2AX의 손실 복구를 반영하지만, DSBs의 완전한 복구를 정의하는 무엇 같은 논쟁이있다, 그것은 DNA의 양쪽 가닥이 복귀하는 것은 그러나 적절한 것을 제안되었습니다, 그것은 또한 제안되었음을에 다시 instatement 압축의 원래 염색질 상태가 필요합니다<sup&gt; 4-8</sup&gt;. γH2AX의 disappearence 적어도 부분적으로 포함, phosphatases, 인산 가수 분해 효소 2A 및 인산 가수 분해 효소 4C에 의해 dephosphorylation<sup&gt; 5,6</sup&gt;. 또한, H2A.Z와 히스톤 교류를 포함한 재배포하여 γH2AX의 제거가 연루되어있다<sup&gt; 7,8</sup&gt;. 중요한 것은 γH2AX foci의 정량 분석​​은 의료 및 핵 연구에 응용 프로그램의 다양한되었다. 여기서는 γ - 반구 자기편 인간 keratinocytes에서 γH2AX foci의 탐지 및 quantitation에 의해 초기의 DNA 손상 평가를 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법을 보여주 immunofluorescence<sup&gt; 9</sup&gt;.

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Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

분자 마커로 γH2AX 형성을 사용하여 DNA 이중 스트랜드 줄무늬의 부량 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기 우리는 방사선에 노출 후 세포의 γH2AX foci의 부량위한 immunofluorescence 분석의 사용을 보여줍니다.

Ionising 방사선에 대한 응답으로 γH2AX Foci의 부량

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

quantification-of-h2ax-foci-in-response-to-ionising-radiation

Research

JoVE Journal

Biology

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

20.3K 조회수.  The Alfred Medical Research and Education Precinct. 분자 마커로 γH2AX 형성을 사용하여 DNA 이중 스트랜드 줄무늬의 부량 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기 우리는 방사선에 노출 후 세포의 γH2AX foci의 부량위한 immunofluorescence 분석의 사용을 보여줍니다.