Purification of Human Solute Carriers (SLCs) for Developing SLC Targeting Therapies

首先在室温下在水浴中解冻冷冻的溶质载体或SLC细胞沉淀。通过混合 135 毫升基础缓冲液和三种蛋白酶抑制剂混合物片剂来制备增溶缓冲液。一旦片剂溶解，将沉淀重悬于增溶缓冲液中。

然后加入脱氨酶，将悬浮液转移到冰冷的均质器中。通过上下移动柱塞约 20 次来均质化溶液，将均质器保持在冰上。接下来，加入洗涤剂储备溶液至1%终浓度。

将增溶混合物转移到 50 毫升锥形管中，并在 4 摄氏度下缓慢旋转。一小时后，离心混合物，并收集上清液。用基础缓冲液平衡 4 至 6 毫升床体积的链球菌-酸动蛋白树脂。

然后将平衡树脂加入到溶解的上清液中，在四摄氏度下旋转两小时。将溶液倒在重力流柱上，让溶液流过。用30倍床体积的链球菌洗涤缓冲液分三个相等的步骤洗涤树脂。

接下来，加入 3 到 5 毫升幻觉缓冲液并孵育 15 分钟，然后收集洗脱液。通过紫外吸收光谱法测量蛋白质浓度。结合所需的幻觉部分，并加入 3C 蛋白酶。

在四摄氏度下缓慢旋转管过夜。第二天，用SEC缓冲液平衡2至4毫升床体积的钴金属亲和树脂。将平衡的钴金属亲和树脂加入过夜的3C反应混合物中，并在4°C下旋转。

一小时后，将溶液倒入重力流柱中并收集流过的流量。通过在 4 摄氏度下以 3000 克旋转，将流通过的流量浓缩在 100 千道尔顿截止离心过滤器中。基于右旋糖酐的基于SEC缓冲液的SEC色谱柱。

将样品注入样品回路，并以流速运行SEC程序，使色谱柱压力低于色谱柱制造商的规格。使用馏分收集器，在整个 SEC 运行中收集 300 微升馏分。合并峰级分后，测量 280 纳米处的吸光度。

然后在 100 千道尔顿截止过滤器中将样品浓缩至所需体积。通过SDS页面电泳分析初始小规模SLC蛋白表达。A GFP 标记的 SLC 的荧光显微镜证实了蛋白质定位，特异性于质膜，具有显着的细胞内积累。

在体积排阻色谱过程中，化学和结构均一的蛋白质产生了单个单分散 A280 峰。