使用电子顺磁共振检测血小板中的超氧阴离子

首先，将柠檬酸盐抗凝全血以 200 g 离心 20 分钟，获得富含血小板的血浆。向血浆中加入吲哚美辛和 PGE1，以 500 g 离心 10 分钟。将所得血小板沉淀重悬于 37 摄氏度的改良 Tyrode HEPES 缓冲液中，以获得每毫升 2x10^8 个血小板的密度。

将血小板在 30 摄氏度下静置 37 分钟。将 DETC 加入终浓度为 5 微摩尔的 DETC 和终浓度为 25 微摩尔的去铁胺中，然后加入 CMH 至终浓度为 200 微摩尔。将样品放入装有特氟龙涂层搅拌磁铁的聚集比色皿中，然后将它们加载到聚集仪上。

1 分钟后，添加凝血酶或胶原蛋白等刺激物，并孵育 10 分钟。孵育后，将血小板悬液从聚集比色皿转移到微量离心管中，并以 6， 000g 的速度快速旋转 10 秒。在毛细管微量移液器中加载 50 微升上清液，并用 EPR 密封蜡密封。

将样品传输到 EPR 扫描仪并在扫描仪上设置参数。将 CMH 氧化为 CM 自由基估计为记录的 EPR 峰曲线下的面积。使用市售的 CM 自由基获得校准曲线。

样品中的 EPR 信号强度与 EPR 峰的强度成正比。使用 ROS 清除剂和产生超氧阴离子的酶的选择性抑制剂证实了检测的特异性。在选择性抑制剂 VAS2870 存在下用凝血酶或胶原蛋白刺激血小板的数据表明，NADPH 氧化酶是响应这两种激动剂的血小板超氧阴离子的主要来源。